（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，食品科學(xué)與工程學(xué)院，呼和浩特010018）

乳桿菌ALAC-3產(chǎn)抑酵母菌活性物質(zhì)培養(yǎng)基的優(yōu)化

鄭中文，李曉婷，劉靜，高鶴塵，李海暄，趙潔，陳忠軍

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，食品科學(xué)與工程學(xué)院，呼和浩特010018）

從內(nèi)蒙古傳統(tǒng)乳酸發(fā)酵食品中篩選出具有較強(qiáng)抑酵母菌作用的一株乳桿菌ALAC-3。從8組適合乳桿菌菌株生長的培養(yǎng)基中篩選出代謝產(chǎn)生抑酵母活性物質(zhì)的最優(yōu)培養(yǎng)基，再通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)，確定培養(yǎng)基中最適宜組分和適宜添加量。結(jié)果表明，碳源、氮源對菌株產(chǎn)抑菌物質(zhì)有顯著的影響，最優(yōu)培養(yǎng)基為：蔗糖25 g/L，蛋白胨∶牛肉膏∶酵母膏（2∶1∶1）20 g/L，K+：Mg2+：Mn2+（10∶3∶1）0.1 mol/L，生長因子乙醇2 mL/L。以此培養(yǎng)基培養(yǎng)ALAC-3，其抑菌圈可達(dá)32.68 mm，比培養(yǎng)基優(yōu)化前（抑菌圈29.91 mm）提高了9.3%。

乳桿菌；抑酵母菌作用；培養(yǎng)基；優(yōu)化

0 引言

食品在生產(chǎn)到銷售過程中易混入病原菌和腐敗菌，危害消費(fèi)者健康[1]。近年食品安全事故頻發(fā)就是這一危害不斷擴(kuò)大的結(jié)果[2]，而以酵母菌等真菌的污染最嚴(yán)重。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年因酵母菌污染而浪費(fèi)的糧食達(dá)2%[3]。

乳桿菌作為益生菌，可以提高食品營養(yǎng)、保藏性和附加值，改善食品風(fēng)味[4-5]。同時(shí)，乳桿菌能夠調(diào)節(jié)機(jī)體腸道菌群，降膽固醇[6-8]，對機(jī)體生理功能、免疫反應(yīng)等產(chǎn)生作用[9]，被廣泛用于工業(yè)生產(chǎn)[10]。目前研究發(fā)現(xiàn)，乳桿菌代謝可產(chǎn)生對近源或同種菌種有特異性抑制作用的細(xì)菌素[11]，但對酵母菌等真菌作用不明顯[12]。

本研究從內(nèi)蒙古發(fā)酵食品中分離出具有抑酵母菌特性的乳桿菌ALAC-3，通過優(yōu)化其培養(yǎng)基組分，以獲得最大抑菌物質(zhì)產(chǎn)量，為該抑菌活性物質(zhì)的進(jìn)一步分離純化和結(jié)構(gòu)分析提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與儀器

乳桿菌：ALAC-3，分離自內(nèi)蒙古傳統(tǒng)發(fā)酵食品中。

指示菌：白假絲酵母（Candida albicans）標(biāo)準(zhǔn)菌株，編號為32819，來自中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。

酵母膏，牛肉膏，胰蛋白胨，大豆蛋白胨，細(xì)菌學(xué)蛋白胨，氯化鈉，檸檬酸氫二胺，磷酸氫二鉀，硫酸錳，硫酸鎂，葡萄糖，瓊脂粉，硫酸銨，TWEEN 80，無水氯化鈣，Trizma堿，無水甲醇，冰乙酸，Bromophenol blue，均為分析純。

篩選用培養(yǎng)基：M17肉湯培養(yǎng)基，改良番茄汁培養(yǎng)基，番茄汁分離培養(yǎng)基，改良MC培養(yǎng)基，MRS肉湯培養(yǎng)基，莫匹羅星鋰鹽改良MRS培養(yǎng)基，乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基，Elliker肉湯培養(yǎng)基。各培養(yǎng)基配方及編號如表1所示[13]。

SW-CJ-2FD雙人單面垂直凈化工作臺，BCD-249CF美菱冰箱，DPX-9162B-1電熱恒溫培養(yǎng)箱，可見分光光度計(jì)，KDC-140HR高速冷凍離心機(jī)，HPX-9052 MBE數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱，L600低速自動平衡離心機(jī)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。

1.2 方法

1.2.1 ALAC-3生長培養(yǎng)基的篩選

（1）各培養(yǎng)基的配制。按表1所示將各組分依次加入，攪拌均勻，調(diào)節(jié)pH值，滅菌。

表1 篩選用培養(yǎng)基及配方g/L

（2）ALAC-3抑菌物質(zhì)濃縮液的處理。將充分活化后的ALAC-3按4%接種量分別接種到各篩選培養(yǎng)基中，在30℃溫度下培養(yǎng)36 h，發(fā)酵液經(jīng)過去酸化去除有機(jī)酸后離心分離去沉淀（4 000 r/min，10 min），上清液按4%比例濃縮，即為抑菌活性物質(zhì)濃縮液[14]。

（3）牛津杯法測定抑菌性。牛津杯法，全稱是牛津杯雙層瓊脂擴(kuò)散法，方法是將已滅菌的瓊脂培養(yǎng)基加熱到完全融化，倒入培養(yǎng)皿內(nèi)，每皿15 mL（下層），待其冷卻凝固后在固體瓊脂上均勻放置3只牛津杯。將融化的指示菌（白假絲酵母）培養(yǎng)基冷卻到50℃左右接入指示菌，將混有指示菌的培養(yǎng)基5 mL加到已凝固的培養(yǎng)基上待凝固（上層）。在牛津杯中分別加入等量抑菌物質(zhì)濃縮液，37℃培養(yǎng)16～18 h。在培養(yǎng)皿中，一方面指示菌開始生長，另一方面抑菌物質(zhì)濃縮液呈球面擴(kuò)散，離杯越近，濃縮液濃度越大，離杯越遠(yuǎn)則濃度越小。隨著濃縮液濃度減小，有一條最低抑菌濃度帶，在帶范圍內(nèi)，菌不能生長，而呈透明的圓圈，這就是“抑菌圈”?？股貪舛仍礁?，抑菌性越強(qiáng)，抑菌圈越大，從而抑菌圈的直徑可以指示其抑菌性強(qiáng)弱（抑菌物質(zhì)濃度大?。15]。

（4）ALAC-3生長培養(yǎng)基的篩選。分別收集各篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)出的ALAC-3的抑菌物質(zhì)濃縮液，按牛津杯法測定其抑菌性，濃縮液添加量均為1 mL，37℃下培養(yǎng)16～18 h，測量抑菌圈直徑。比較抑菌圈直徑大小，選擇抑菌圈最大的濃縮液對應(yīng)的培養(yǎng)基為最佳培養(yǎng)基。

1.2.2 培養(yǎng)基組分和含量的優(yōu)化

（1）單因素實(shí)驗(yàn)。碳源：從常用碳源中選取葡萄糖、乳糖、半乳糖、果糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、棉子糖、鼠李糖、蔗糖、麥芽糖11種糖作為碳源等量替換原培養(yǎng)基中的碳源，接入ALAC-3培養(yǎng)后按1.2.1（2）所示方法收集濃縮液，牛津杯法測定抑菌性，比較抑菌圈大小，選擇最大抑菌圈對應(yīng)的碳源。

氮源：選取蛋白胨、牛肉膏和酵母膏的不同比例組合作為氮源，等量替換原氮源，具體方法同上。比較抑菌圈大小，選擇最大抑菌圈對應(yīng)的氮源。

金屬離子：選取Na+、K+、Mn2+、Mg2+的不同比例組合作為金屬離子，替換原培養(yǎng)基中的金屬離子，方法同上。比較抑菌圈大小，選擇最大抑菌圈對應(yīng)的金屬離子。

生長因子：選取吐溫20（Tween 20）、吐溫80（Tween 80）、PEG-400、乙醇作為生長因子，方法同上，比較抑菌圈大小，選擇最大抑菌圈對應(yīng)的生長因子。

（2）正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇碳源、氮源、金屬離子和生長因子作4因素3水平的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，按L9（34）正交表設(shè)計(jì)試驗(yàn)。分析試驗(yàn)結(jié)果，確定最優(yōu)培養(yǎng)基組分及含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 ALAC-3生長培養(yǎng)基的篩選

使用表1中8種不同的培養(yǎng)基培養(yǎng)ALAC-3，測定抑菌物質(zhì)濃縮液的抑菌圈直徑，結(jié)果如表2所示。

表2 不同培養(yǎng)基對抑菌物質(zhì)濃縮液抑菌性的影響

由表2可以看出，5號培養(yǎng)基抑菌物質(zhì)濃縮液的抑菌圈最大；2，3，4號培養(yǎng)基培養(yǎng)ALAC-3時(shí)，菌體無法生長或者無法代謝產(chǎn)生抑菌物質(zhì)。因此，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果選定MRS肉湯培養(yǎng)基作為后期優(yōu)化用的培養(yǎng)基。

2.2 優(yōu)化培養(yǎng)基組分和含量

微生物培養(yǎng)基的組成大致分為碳源（C源）、氮源（N源）、金屬離子、生長因子。在單因素試驗(yàn)中，分別用不同碳源、氮源、金屬離子、生長因子等量替換原培養(yǎng)基中的相應(yīng)成分，比較替換前后ALAC-3產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)抑菌性強(qiáng)弱，從而確定各類組分的最佳成分和適宜添加量范圍[16]。

2.2.1 不同碳源對抑菌性的影響

選用不同的碳源代替原培養(yǎng)基中的碳源時(shí)，所得抑菌物質(zhì)濃縮液的抑菌情況如圖1。

圖1 不同碳源對抑菌物質(zhì)抑菌性的影響

由圖1可以看出，甘露糖作為碳源時(shí)所得抑菌物質(zhì)濃縮液的抑菌圈最大，蔗糖次之，且數(shù)值低不到3%?？紤]到甘露糖價(jià)格較高，以蔗糖作為較優(yōu)碳源。

2.2.2 不同氮源對抑菌性的影響

選用不同的氮源代替原培養(yǎng)基中的氮源，所得抑菌物質(zhì)濃縮液的抑菌情況如圖2所示。

圖2 不同氮源對抑菌物質(zhì)抑菌性的影響

圖2中，橫坐標(biāo)數(shù)值1為蛋白胨∶牛肉膏∶酵母膏（2∶2∶1）；2為蛋白胨；3為牛肉膏；4為酵母膏；5為蛋白胨∶牛肉膏（5∶3）；6為蛋白胨∶酵母膏（5∶3）；7為牛肉膏∶酵母膏（1∶1）；8為蛋白胨∶牛肉膏∶酵母膏（2∶1∶1）。

由圖2可以看出，8號氮源時(shí)所獲得抑菌圈最大，即蛋白胨∶牛肉膏∶酵母膏（2∶1∶1）作為培養(yǎng)基的氮源。

2.2.3 不同金屬離子對抑菌性的影響

選用不同金屬離子代替原培養(yǎng)基中的組分，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。

圖3 不同金屬離子對抑菌物質(zhì)抑菌性的影響

圖3中，橫坐標(biāo)數(shù)值1為Na+∶K+∶Mg2+∶Mn2+（30∶10∶3∶1）；2為Na+∶Mg2+（10∶1）；3為Na+∶Mn2+（30∶1）；4為K+：Mg2+（10∶3）；5為K+∶Mn2+（10∶1）；6為Na+∶Mg2+：Mn2+（30∶3∶1）；7為K+：Mg2+∶Mn2+（10∶3∶1）。

由圖3可以看出，選擇7號金屬離子時(shí)，獲得最大抑菌性（產(chǎn)量），即K+∶Mg2+∶Mn2+為10∶3∶1。

2.2.4 不同生長因子對抑菌性的影響

用不同生長因子代替原組分（總量3 mL/L），結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同生長因子對抑菌物質(zhì)抑菌性的影響

由圖4可以看出，添加乙醇作為生長因子獲得的抑菌物質(zhì)的抑菌性遠(yuǎn)高于其他生長因子，因此選擇生長因子為乙醇。

2.2.5 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化各組分最佳用量

采用L9（34）正交表，以蔗糖（A）、蛋白胨∶牛肉膏∶酵母膏=2∶1∶1（B）、K+∶Mg2+∶Mn2+=10∶3∶1（C）、乙醇（D）作為4個(gè)考察因素，選取3個(gè)水平進(jìn)行試驗(yàn)。各因素及水平如表3所示；數(shù)據(jù)結(jié)果如表4所示。

表3 正交實(shí)驗(yàn)因素水平

表4 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)結(jié)果

對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果如表5所示。

表4的極差分析表明，RA＞RB＞RD＞RC。由表5可知，碳源（A）、氮源（B）對抑菌結(jié)果有顯著影響（Sig.＜0.05），其中碳源（A）對抑菌性有極顯著影響（Sig.＜0.01）。試驗(yàn)數(shù)據(jù)方差R2=0.986，表明結(jié)果可信度較高。4個(gè)因素對抑菌物質(zhì)抑菌性影響大小為：碳源（A）〉氮源（B）〉生長因子（D）〉金屬離子（C）。在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，優(yōu)化得到培養(yǎng)基組分的最佳值為A3B1C2D2，即蔗糖25 g/L；蛋白胨∶牛肉膏∶酵母膏（2∶1∶1）20 g/L；K+∶Mg2+∶Mn2+（10∶3∶1）0.1 mol/L；乙醇2 mL/L。用此優(yōu)化培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，所得抑菌物質(zhì)濃縮液的抑菌圈直徑為32.68 mm，比用優(yōu)化前培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)（抑菌圈29.91 mm）提高了9.3%。

表5 顯著性分析結(jié)果

3 結(jié)論

本研究從內(nèi)蒙古當(dāng)?shù)貍鹘y(tǒng)發(fā)酵食品中分離出一株具有較強(qiáng)抑酵母菌活性的乳桿菌ALAC-3，在選擇較優(yōu)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，采用單因素和正交實(shí)驗(yàn)法研究碳源、氮源、金屬離子、生長因子對菌株產(chǎn)抑菌物質(zhì)的影響。確定了最適宜ALAC-3代謝產(chǎn)生抑酵母活性物質(zhì)的培養(yǎng)基組分為：蔗糖25 g/L；蛋白胨∶牛肉膏∶

酵母膏（2∶1∶1）20 g/L；K+∶Mg2+∶Mn2+（10∶3∶1）0.1 mol/L；乙醇2 mL/L；為下一步抑菌物質(zhì)的分離純化及結(jié)構(gòu)鑒定奠定了基礎(chǔ)。

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Medium optimization of antiyeast active substances produced by Lactobacillus ALAC-3

ZHENG Zhongwen,LI Xiaoting,LIU Jing,GAO Hechen,LI Haixuan,ZHAO Jie,CHEN Zhongjun
(Inner Mongolia Agricultural University,College of Food Science and Engineering,Hohhot 010018,China)

The inhibiting activity of antiyeast substances produced by Lactobacillus ALAC-3,one strain isolated from traditional dairy fermen?tation food in Inner Mongolia was studied.In this study,one best was singled out of eight culture media that suited ALAC-3 to grow and produce antiyeast active substances.Then the best components and its volume range were confirmed by Single-Factor experiments and Or?thogonal experimental design.Experimental results indicated that the carbon source,nitrogen source significantly affected the inhibiting activi?ty on yeast.When the parameters were composed as follows:25 g/L of sucrose,20 g/L of peptone∶beef extract∶yeast extract(2∶1∶1),0.1 mol/L of K+-Mg2+-Mn2+（10∶3∶1）,2 mL/L of ethanol as growth factor,the inhibiting activity was maximum with verified value of 32.68 mm,increased by 9.3%from the initial value of 29.91 mm.

Lactobacillus;inhibiting yeast function;medium;optimization

TQ935

：A

：1001-2230（2017）07-0023-04

2016-11-25

內(nèi)蒙古自然基金（2015MS0364）；國家自然基金(31260390)。

鄭中文（1990-），男，碩士，研究方向?yàn)槭称肺⑸铩?/p>

陳忠軍