梁 超,姜 濤,王靜芝,曾曉玲，劉建民,鄭肇良

(1.?？谑兄嗅t(yī)醫(yī)院，海南 ?？?570216；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷學(xué)院,武漢 430000)

【針灸研究】

不同變頻組合電針預(yù)處理對(duì)急性腦缺血大鼠神經(jīng)功能和腦皮質(zhì)促紅細(xì)胞生成素的影響

梁 超1,姜 濤1,王靜芝2,曾曉玲2，劉建民2,鄭肇良1

(1.?？谑兄嗅t(yī)醫(yī)院，海南 ?？?570216；2.湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷學(xué)院,武漢 430000)

目的: 觀察不同頻率電針預(yù)處理對(duì)大腦中動(dòng)脈梗塞(middle cerebral artery occulation，MCAO)大鼠神經(jīng)功能和腦皮質(zhì)促紅細(xì)胞生成素(EPO)表達(dá)影響。方法: SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、模型組、安慰針刺組、預(yù)處理1組、預(yù)處理2組、預(yù)處理3組每組各10只，不同頻率電針頭穴進(jìn)行預(yù)處理后制備MCAO模型；參照Longa標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估神經(jīng)功能，免疫組化法檢測(cè)EPO陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)EPOmRNA表達(dá)。結(jié)果：不同頻率電針預(yù)處理后MCAO大鼠神經(jīng)功能損傷明顯減輕，其中以2Hz/100Hz的頻率最為明顯；各預(yù)處理組EPO陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)差異明顯，2Hz/100Hz頻率預(yù)處理后陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目最多；電針預(yù)處理能促進(jìn)EPOmRNA的表達(dá)增加，其中以2Hz/100Hz頻率電針預(yù)處理組的表達(dá)最明顯。結(jié)論: 不同變頻組合電針頭穴的預(yù)處理能減輕腦缺血后神經(jīng)功能的損傷，這可能與調(diào)節(jié)缺血局部腦皮質(zhì)EPO蛋白和基因的表達(dá)有關(guān)，不同頻率電針其效應(yīng)不同，其中以2Hz/100Hz頻率電針的效果最顯著。

MACO大鼠；電針頻率；頭穴；預(yù)處理；EPO

缺血性腦血管病是一種好發(fā)于中老年人的疾病，高發(fā)病率、高致殘率使其備受關(guān)注。美國(guó)缺血性卒中和短暫性腦缺血發(fā)作患者卒中預(yù)防指南明確提出該病的積極預(yù)防意義遠(yuǎn)大于治療[1～2]。針灸作為一種缺血預(yù)處理手段，被廣泛應(yīng)用于該病的研究中，能明顯減輕缺血后神經(jīng)元損傷，減輕炎癥反應(yīng)，幫助神經(jīng)功能恢復(fù)[3～4]。本研究在之前基礎(chǔ)上，觀察不同時(shí)間電針預(yù)處理對(duì)局灶性腦缺血大鼠局部腦皮質(zhì)中促紅細(xì)胞生成素(Erythropoietin，EPO)表達(dá)變化及受損神經(jīng)功能的影響，初步探討電針預(yù)防急性腦血管病的相關(guān)機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康成年SPF級(jí)SD大鼠60只(湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心提供，許可證號(hào)SCXK(鄂)2015-0018)，雌雄不拘，體質(zhì)量(200±20) g。于實(shí)驗(yàn)前1周一次性購(gòu)進(jìn)，飼養(yǎng)于安靜、溫暖且避強(qiáng)光的環(huán)境中，室溫(20±2)℃，自由飲水飲食。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑 兔抗大鼠EPO多克隆抗體、HRP標(biāo)記山羊抗兔抗體、DAB顯色劑、免疫組化試劑盒、濃縮型正常山羊血清(封閉)、熒光(Cy3)標(biāo)記羊抗兔IgG(均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司)、DAPI、抗熒光淬滅封片劑(碧云天生物科技有限公司)；Trizol(Aidlab)、DL2000 DNA Marker(TAKARA)引物合成(擎科科技有限公司)。

1.2.2 主要儀器 病理切片機(jī)(德國(guó)Leica RM 2016輪轉(zhuǎn)式切片機(jī))、熒光顯微鏡(NIKON Eclipse 80i生物顯微鏡)、微量移液器(北京大龍公司)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI7900 / illumina eco)、熒光定量PCR管(EXTRAGENE / illumina)、分光光度計(jì)(上海舜宇恒科學(xué)儀器有限公司)、PH計(jì)(德國(guó)Metter-Toledo GmbH公司)、水平電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)、紫外分析儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及處理

60只SD大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為正常對(duì)照組、模型組、安慰針刺組及預(yù)處理1組、預(yù)處理2組、預(yù)處理3組各10只；正常對(duì)照組不予處理，正常給水給食；模型組按要求制備MCAO模型；安慰針刺組和預(yù)處理各組按治療方法給予不同處理，治療完成后制備MCAO模型。

2.2 動(dòng)物模型制備

按Longa[5]線栓法制備MCAO模型。大鼠造模前禁食不禁水24 h，以10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉；常規(guī)備皮消毒，頸部正中切口，鈍性分離皮下筋膜和肌肉，暴露并分離出右側(cè)頸總動(dòng)脈(Common carotid arternal,CCA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(Internal carotid artery,ICA)、頸外動(dòng)脈(External carotid artery,ECA)；電凝ECA的分支，結(jié)扎游離ECA主干，分離ICA主干至翼腭動(dòng)脈(Pterygo palatine artery,PPA)，并在其起始部和CCA的近心端各置一動(dòng)脈夾；線栓從ECA殘端小口進(jìn)入，輕推經(jīng)CCA分叉部沿ICA入顱，至大腦中動(dòng)脈(Middle cerebral artery,MCA)；尼龍線插入深度由CCA分叉部計(jì)約18 mm，栓塞60 min后拉出縫合切口并消毒，術(shù)后大鼠室溫下禁食給水喂養(yǎng)，蘇醒后進(jìn)行神經(jīng)功能障礙評(píng)分，評(píng)分在1級(jí)以上的大鼠為造模成功。

2.3 治療方法

根據(jù)中國(guó)針灸學(xué)會(huì)制定的《頭皮針穴名國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化方案》[6]選取雙側(cè)頂顳前斜線、頂顳后斜線，并結(jié)合《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[7]大鼠穴位圖譜模擬人體經(jīng)穴定位。頂顳后斜線:“百會(huì)”(頂骨正中點(diǎn))至“曲鬢”(為耳緣直上與耳尖水平線的交點(diǎn))；頂顳前斜線:頂顳后斜線向前平移0.1 寸。選用30號(hào)1寸一次性無(wú)菌針灸針，分別從頂骨中點(diǎn)向耳根前與頭皮呈15°夾角透刺0.5～0.8寸，快速捻轉(zhuǎn)至針下沉澀感后，同側(cè)頭穴為一對(duì)。安慰針刺組采用套迭式頓頭安慰針，底座固定于穴位處，左手固定針管，右手快速叩擊頓頭安慰針，局部皮膚針刺感，但不刺入皮膚，不予加電刺激；電針治療采用LH202H型韓氏儀，疏密波，電流強(qiáng)度lmA，電針預(yù)處理1組、2組和3組分別選用頻率為2 Hz/150 Hz、2 Hz/100 Hz和2 Hz/50 Hz，連續(xù)治療10 d，每日1次，每次30 min。

3 指標(biāo)及方法

3.1 神經(jīng)功能缺損評(píng)分(NSS)

參照Longa神經(jīng)功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估：1級(jí)：左前肢不能充分伸展計(jì)1分；2級(jí)：向左環(huán)形運(yùn)動(dòng)，輕度局灶神經(jīng)功能缺失計(jì)2分；3級(jí)：向左側(cè)倒，中度局灶神經(jīng)功能缺失計(jì)3分；4級(jí)：不能自然行走，重度局灶神經(jīng)功能缺失計(jì)4分。

3.2 EPO陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)目

大鼠灌注后迅速取腦，剝離腦膜除去嗅球、延髓和小腦，在視交叉平面前后2mm處將腦冠狀切開(kāi)，分離右側(cè)大腦皮層，仔細(xì)切取缺血區(qū)域大腦皮層組織塊(即右側(cè)頂顳葉皮層組織)約1 mm×1 mm×1 mm，按免疫組化S-ABC法操作(步驟按試劑盒說(shuō)明)，一抗(EPO抗體)稀釋度為1∶200；以細(xì)胞漿出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞；在高倍(×400)光學(xué)顯微鏡下，隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，并取平均值為EPO蛋白表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目。

3.3 EPOmRNA表達(dá)的檢測(cè)

按上述方法取右側(cè)頂顳葉皮層組織約1 mm×1 mm×1 mm，清洗后保存于-80℃冰箱；按照TRizol說(shuō)明書(shū)的方法提取腦缺血組織中總RNA；在20μL反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中，以1μL RNA為模板將mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA；PCR反應(yīng)以β-actin mRNA為內(nèi)參，上游引物：5-CGTTGACATCCGTAAAG ACCTC-3’，下游引物：5’-TAGGAGCCAGGGCAGTAATCT-3’；EPO mRNA引物序列，上游引物：5-CACCCTGCTGCTTTTACTATCCTT-3’,下游引物：5-CATTGTGACATTTTCTGCCTCCT-3’；反應(yīng)體系為20μL，擴(kuò)增結(jié)束后，PCR產(chǎn)物的定量校正和判定分析采用β-actin mRNA作為內(nèi)參，用β-actin mRNA的拷貝數(shù)作為校正基數(shù)，各樣本中EPOmRNA的CT(cycle threshold)值，分別與對(duì)應(yīng)樣本中β-actin mRNA的CT值相減，即獲得EPOmRNA的△CT值；分別以模型組的△CT值作為校正，得出-△△CT值，2-△△Ct公式計(jì)算出個(gè)樣本中EPOmRNA的表達(dá)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

5 結(jié)果

表1圖1顯示，缺血后各組大鼠神經(jīng)功能損傷評(píng)分均升高，模型組與安慰針刺組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，預(yù)處理后NSS分值低于模型組和安慰針刺組，預(yù)處理2組分值最低(P<0.01)，預(yù)處理1組和預(yù)處理3組分值間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；安慰針刺組EPO陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目與模型組的區(qū)別不大(P>0.05)，各預(yù)處理組比安慰針刺組的細(xì)胞數(shù)目均多(P<0.05)，預(yù)處理2組EPO 陽(yáng)性表達(dá)最多(P<0.01)，預(yù)處理1組和預(yù)處理3組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；安慰針刺組EPOmRNA表達(dá)量與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；不同電針頻率預(yù)處理后其表達(dá)量各不相同，預(yù)處理3組表達(dá)量最少(P<0.05)，預(yù)處理1組的表達(dá)量次之(P<0.05)，預(yù)處理2組的表達(dá)量最多(P<0.01)。

組別鼠數(shù)NSSEPO陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)EPOmRNA表達(dá)正常對(duì)照組100.01±0.31 15.38±0.380.14±0.38模型組103.21±0.81☆29.33±0.59☆0.27±1.01☆安慰針刺組102.97±1.2233.75±0.310.30±0.54預(yù)處理1組102.03±1.14★#57.18±1.55★#0.53±0.77★#▲預(yù)處理2組101.59±0.72★#△78.09±0.97★#△0.75±0.46★#△預(yù)處理3組101.87±0.95★#64.21±1.29★#0.42±0.59★#

注：與正常對(duì)照組比較：☆P<0.05；與模型組比較：★P<0.05；與安慰針刺組比較：#P<0.05；與預(yù)處理3組比較：▲P<0.05,△P<0.01

圖1 各組大鼠缺血局部腦皮質(zhì)EPO免疫組化圖(10×40)

6 討論

急性腦缺血屬于中醫(yī)學(xué)“中風(fēng)”范疇?！鹅`樞·五亂》記載：“亂于頭，則為厥逆，頭重眩仆……氣在于頭者，取之天柱大杼”，這是頭穴治療中風(fēng)最早的起源。根據(jù)“病變?cè)谀X，首選督脈”，頭穴成為現(xiàn)代臨床治療該病的必選穴位。頭穴電針對(duì)缺血性腦損傷早期具有改善腦電活動(dòng)、氧的代謝及減輕神經(jīng)功能障礙等作用[8-10]，但不同電針頻率其作用機(jī)制的側(cè)重點(diǎn)也會(huì)不同。對(duì)于抑制神經(jīng)元凋亡作用最好的頻率為20 Hz/80 Hz，主要通過(guò)降低Bax mRNA表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)[11-12]。2 Hz/15 Hz-15 Hz/30 Hz則減輕炎癥因子分泌，誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞增生效果明顯[13-14]。而2 Hz/100 Hz在修復(fù)血管內(nèi)皮損傷方面療效顯著[15]。本實(shí)驗(yàn)以往研究表明，該頻率電針能調(diào)控缺血腦皮質(zhì)EPO蛋白表達(dá)，增加血流量并促進(jìn)微血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖[16]；同樣頻率的頭針也能產(chǎn)生類(lèi)似效應(yīng)以改善局部血流、減輕腦缺血損傷[17]。但該頻率產(chǎn)生的血管新生效應(yīng)是否與針刺預(yù)處理之間有關(guān)，是本研究觀察的目的之一。

以往關(guān)于EPO的研究?jī)H局限于貧血疾病[18]，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)部分中樞神經(jīng)系統(tǒng)組織也可產(chǎn)生EPO及其受體，并對(duì)神經(jīng)元具有廣泛的促生長(zhǎng)與保護(hù)作用，能明顯減輕腦缺血再灌注損傷[19]。之前我們發(fā)現(xiàn)，電針頭穴可增加EPOmRNA表達(dá)以激活相關(guān)分子信號(hào)通路促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)，增加血管內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)量[20]?，F(xiàn)在經(jīng)過(guò)電針預(yù)處理EPO含量也增加，但不同頻率預(yù)處理EPO蛋白和基因表達(dá)不一樣，以2 Hz/100 Hz表達(dá)最多，2 Hz/50 Hz和2 Hz/150 Hz的表達(dá)較少。EPO的這一表達(dá)趨勢(shì)與神經(jīng)功能損傷評(píng)分的分值變化一致，說(shuō)明EPO在缺血腦皮質(zhì)中的含量變化與神經(jīng)功能的修復(fù)存在一定程度的關(guān)系[21]。

自“缺血預(yù)處理”概念提出后，針灸預(yù)防腦血管病一直是研究熱點(diǎn)之一。電針預(yù)處理可以在缺血后24 h和48 h明顯增加大鼠骨髓和外周血中EPCs含量[22]，調(diào)控血腦屏障MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞及VEGFmRNA表達(dá)，以提高缺血耐受效應(yīng)[23]，促進(jìn)MiRNA-290、MiRNA-494表達(dá)，降低AQP-4相對(duì)含量以減輕腦損傷[24-25]。本研究發(fā)現(xiàn)，不同頻率電針預(yù)處理其神經(jīng)損傷改善程度不同，2 Hz/100 Hz頻率電針刺激后神經(jīng)功能損傷評(píng)分最低，EPO蛋白陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目最多，EPOmRNA表達(dá)最明顯。

綜上所述，不同頻率電針頭穴的預(yù)處理能促進(jìn)缺血局部腦皮質(zhì)EPO蛋白和基因的表達(dá)，增強(qiáng)缺血耐受效應(yīng)，從而顯著改善腦缺血大鼠受損的神經(jīng)功能；相同穴位、電流強(qiáng)度、針刺時(shí)間的基礎(chǔ)上，選擇不同頻率電針其神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)不同，其中以2 Hz/100 Hz頻率電針的效果最顯著，但確切機(jī)制仍需繼續(xù)深入探究。

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海南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(20158371)-不同時(shí)間頭針對(duì)MCAO大鼠缺血局部腦皮質(zhì)微血管新生的影響研究

梁 超(1984-)，女，湖北武漢人，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事針灸治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的臨床與實(shí)驗(yàn)研究。

R245.9+7

B

1006-3250(2017)05-0686-03

2016-11-26