馮永浩 陳 龍 陳英輝 施曉紅△

(1復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院內(nèi)分泌科,2神經(jīng)內(nèi)科 上海 201508)

百里醌對2型糖尿病大鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激及細胞因子表達的影響

馮永浩1陳 龍2陳英輝2施曉紅1△

(1復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院內(nèi)分泌科,2神經(jīng)內(nèi)科 上海 201508)

2型糖尿病; 百里醌; 氧化應(yīng)激; 炎癥; 細胞因子; 大鼠

2型糖尿病是常見的內(nèi)分泌紊亂疾病之一,其長期并發(fā)癥可影響眼、腎臟、血管、心臟,甚至導(dǎo)致神經(jīng)變性及中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能紊亂[1]。在過去的10年里,2型糖尿病中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥發(fā)病率已有顯著的升高[2]。目前,中樞神經(jīng)系統(tǒng)的長期慢性并發(fā)癥稱為糖尿病腦病(diabetic encephalopathy,DE),該并發(fā)癥可致患者學(xué)習(xí)、記憶能力下降等認知功能障礙[3]。大量研究證實糖尿病腦病與炎性反應(yīng)、氧化應(yīng)激密切相關(guān)。百里醌(thymoquinone ,TQ)作為一種從黑草種子中提煉出的有效生物活性單體,具有多種生物學(xué)作用,目前已用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的治療[4],但關(guān)于TQ對糖尿病腦病治療效果的研究少之又少。同時,由于TQ分子結(jié)構(gòu)的特殊性,使其可以通過血腦屏障,為治療糖尿病腦病提供了天然優(yōu)勢[5]。為了初步探究TQ對糖尿病腦病的治療效果及發(fā)現(xiàn)其潛在的機制,本研究將觀察TQ對2型糖尿病大鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白及細胞因子表達的影響。

材 料 和 方 法

試劑 TQ和鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)購自美國Sigma公司。水合氯醛購于上海工碩生物科技有限公司。血紅素加氧酶-1 (heme oxygenase-1,HO-1)抗體、核因子E2相關(guān)因子2 (nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)抗體購自英國Abcam公司,環(huán)加氧酶-2 (cyclo-oxygenase 2,COX-2)抗體購自沈陽萬類生物科技有限公司,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)試劑盒購自日本株式會社同仁化學(xué)研究所。

實驗動物及分組 48只6 周齡雄性Wistar大鼠(140～160 g),購自復(fù)旦大學(xué)實驗動物科學(xué)部。動物使用符合上海市動物管理委員會管理條例。單籠飼養(yǎng),保持飼養(yǎng)室安靜、溫度為(20±2) ℃、相對濕度為60%,光照時間12 h/d,清潔飲水,造模前給予普通飲食并適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。實驗分正常對照組、模型組和百里醌組(n=16)。模型組和百里醌組為造模成功的2型糖尿病大鼠。根據(jù)本課題組前期的研究成果[6],造模成功后百里醌組給予腹腔注射無水乙醇溶解的TQ(5 mg/kg),隔天1次共6周,模型組腹腔注射等量無水乙醇,期間繼續(xù)高糖、高脂飼料(正常飼料∶豬油∶蔗糖=7∶2∶1)喂養(yǎng)。各組大鼠在測定取材時,月齡處于相同水平,而且模型組和百里醌組血糖差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2型糖尿病大鼠模型的建立 正常對照組大鼠食用清潔級普通飼料12周。模型組和百里醌組大鼠食用高糖、高脂飼料。飼料由北京博泰宏達生物技術(shù)有限公司提供。在高脂、高糖飼料喂養(yǎng)6 周后,模型組和百里醌組禁食12 h以上(不禁水),然后腹腔注射STZ 35 mg/kg。腹腔注射STZ 72 h后檢測大鼠空腹血糖(測試前禁食12 h,不禁水),以血糖含量>16.7 mmol/L者為2型糖尿病大鼠造模成功,納入實驗。造模過程中,模型組有2只死亡,百里醌組有1只死亡,造模成功率為87%。

血糖測定 分別于腹腔注射STZ 72 h后和標本取材前,尾靜脈采血,采用葡萄糖氧化酶法,用德國羅氏公司ACCU-CHEK?血糖儀及試紙條測定各組大鼠空腹血糖。

Western blot 10%水合氯醛(0.4 mL/100 g)腹腔注射,麻醉大鼠,斷頭法處死大鼠,獲取腦組織,然后分離出海馬組織。RIPA裂解液與PMSF按100∶1的比例配成蛋白質(zhì)提取液,每1 mL蛋白質(zhì)提取液加入100 mg新鮮的腦組織提取蛋白質(zhì)。以微管蛋白作為內(nèi)參照,按照制膠、上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育、ECL發(fā)光的順序進行電泳,轉(zhuǎn)膜后顯像。

SOD測定 用生理鹽水清洗腦組織,盡可能將血液去除。用無菌紙巾將腦組織上的水分吸干,然后稱取100 mg腦組織,加入900 μL蔗糖緩沖液(0.25 mol/L 蔗糖,10 mmol/L HEPES,1 mmol/L EDTA,pH 7.4),用勻漿器將樣品勻漿。再用冰浴器將樣品超聲粉碎(60 W,0.5 s間隔,15 min)。 隨后按照SOD試劑盒的操作步驟測定各組SOD活性。

結(jié) 果

TQ干預(yù)前后對血糖水平的影響 造模成功時百里醌組[(23.37±6.45)mmol/L]和模型組[(22.76±4.17)mmol/L]空腹血糖水平均較正常對照組[(5.46±0.49)mmol/L]顯著升高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=59.6,P<0.001);而模型組和百里醌組之間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.995,P>0.05)。TQ治療6周后,百里醌組[(16.81±3.15)mmol/L]和模型組[(20.40±5.15)mmol/L]空腹血糖水平均仍較正常對照組[(5.96±0.29)mmol/L]高,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=37.3,P<0.001);百里醌組血糖下降,但與模型組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.095,P>0.05)。表明TQ無明顯降低糖尿病大鼠血糖的作用。

大鼠海馬組織中Nrf2,HO-1和COX-2的蛋白質(zhì)水平Westernblot檢測結(jié)果(表1,圖1A)顯示,Nrf2的水平在各組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=77.3,P<0.001)。與正常對照組相比,模型組海馬組織中Nrf2的水平明顯降低(P<0.001);與模型組相比,百里醌組海馬組織中Nrf2水平升高(P<0.001,表1,圖1B)。提示TQ提高了糖尿病大鼠海馬組織中Nrf2的水平。HO-1水平在各組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=18.5,P=0.003)。與正常對照組相比,模型組海馬組織中HO-1的水平明顯降低(P=0.011);與模型組相比,百里醌組海馬組織中HO-1水平升高(P=0.001,表1,圖1C)。TQ提高了糖尿病大鼠海馬組織中HO-1的水平。

綜上表明,百里醌組的氧化應(yīng)激水平較模型組有明顯下降,且Nrf2與HO-1的變化趨勢一致,證明了TQ可能通過激活Nrf2/HO-1通路來緩解2型糖尿病大鼠海馬組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)。Westernblot結(jié)果亦表明,COX-2水平在各組之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=28.9,P=0.001)。與正常對照組相比,模型組海馬組織中COX-2的水平明顯升高(P<0.001),百里醌組海馬組織中COX-2水平也明顯升高(P=0.022);與模型組相比,百里醌組海馬組織中COX-2的水平降低(P=0.004)(表1,圖1D)。表明經(jīng)過TQ治療后,百里醌組大鼠海馬組織的炎性反應(yīng)程度較模型組有明顯下降,但仍高于正常對照組,提示TQ可能在一定程度上改善糖尿病大鼠海馬組織的炎性反應(yīng)。

表1 各組大鼠海馬組織中Nrf2,HO-1和COX-2的蛋白質(zhì)相對水平

大鼠海馬組織中SOD的活性 根據(jù)SOD試劑盒檢測原理,SOD抑制率可以反映SOD活性的強弱。SOD試劑盒檢測結(jié)果顯示,正常對照組SOD抑制率為73.6%±3.3%,模型組SOD抑制率為17.8%±2.0%,百里醌組SOD抑制率為25.3%±4.4%,各組間SOD活性的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=242.3,P<0.001)。與正常對照組相比,模型組海馬組織中SOD活性明顯降低(P<0.001);與模型組相比,百里醌組SOD活性明顯升高(P=0.034)。表明TQ提高了海馬組織中的SOD活性,進而改善氧化應(yīng)激,提示TQ在糖尿病大鼠腦組織中可能通過提高SOD活性來改善氧化應(yīng)激。

A:Representative protein bands; B:Nrf2/tubulin protein ratio according to band density; C:HO-1/tubulin protein ratio according to band density; D:COX-2/tubulin protein ratio according to band density.Data was shown as mean±SE.TQ:Thymoquinone.(1)P<0.01.

圖1 TQ對各組大鼠氧化應(yīng)激及炎癥的影響

Fig 1 Effect of TQ on oxidative stress and inflammation in rats

討 論

2型糖尿病時,糖代謝的急性和慢性紊亂可損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)[7]。常見的急性紊亂有低血糖所致的神經(jīng)損害及其精神癥狀,高血糖所致的酮癥酸中毒和高滲性昏迷。長期慢性糖代謝紊亂可在結(jié)構(gòu)、神經(jīng)生理及神經(jīng)精神等方面對腦組織產(chǎn)生不良影響,進而導(dǎo)致糖尿病相關(guān)認知障礙,故又稱作糖尿病腦病(diabetic encephalopathy,DE)[8]。1966年Nielon定義了DE的概念[9],主要表現(xiàn)為記憶能力消退,語言表達、理解能力降低,同時可能伴有神情淡漠、動作遲緩等,病理變化可表現(xiàn)為大腦萎縮、腦室擴大、神經(jīng)脫髓鞘、腦血管改變等。考慮到海馬組織與認知功能障礙密切相關(guān),故本研究選取海馬組織作為實驗標本。

目前尚無典型的DE動物模型,對于DE的研究大都建立在糖尿病動物模型基礎(chǔ)上。腹腔注射STZ是目前經(jīng)典的誘發(fā)糖尿病的方法。STZ對一定種屬動物的胰島β細胞具有選擇性破壞作用,能誘發(fā)動物產(chǎn)生糖尿病[10]。小劑量(25～40 mg/kg)注射STZ時,由于其只是破壞一部分胰島β細胞的功能,造成外周組織對胰島素不敏感,同時給予高脂高糖飼料喂養(yǎng),兩者結(jié)合便誘導(dǎo)出病理、生理改變都接近于人類2型糖尿病的動物模型[11]。STZ注射法具有穩(wěn)定性強、對全身各器官毒性小、造模成功率高等優(yōu)點,而且STZ 不會直接影響腦組織的代謝,因而適用于糖尿病神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥的研究[12]。

DE的病理生理機制較為復(fù)雜,目前認為氧化應(yīng)激是DE發(fā)生的重要機制之一[13]。機體在正常情況下的氧化和抗氧化處于相對平衡狀態(tài)。氧化應(yīng)激是指機體受到各種有害刺激時,體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡,傾向于氧化,導(dǎo)致活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成過多,抗氧化物水平相對不足,活性下降,使氧化與抗氧化系統(tǒng)失衡,產(chǎn)生氧化應(yīng)激,從而導(dǎo)致組織的損傷。在持續(xù)高糖條件下,腦組織的線粒體功能障礙[14],導(dǎo)致ROS的生成超出腦組織的清除能力,使ROS在腦組織逐漸積累,進而導(dǎo)致神經(jīng)細胞變性、壞死,發(fā)生中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性、進行性、退行性疾病,最終導(dǎo)致糖尿病腦損傷,在大腦發(fā)生結(jié)構(gòu)、神經(jīng)生理及神經(jīng)精神等方面的病理改變[15]。

近年來越來越多的研究證明,炎性反應(yīng)亦參與了DE的發(fā)病機制[16]。有臨床證據(jù)表明,在存在認知功能減退的2型糖尿病患者中,血清中的炎癥因子白介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-α TNF-α)、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)、IL-10水平均明顯高于不存在認知功能障礙的糖尿病患者[17-18]。已有實驗證實IL-6、 TNF-α、IL-10等炎性因子在2型糖尿病大鼠腦組織中表達升高,從而損害認知功能[19]。以上研究表明炎性因子參與了DE的發(fā)病過程。

TQ的化學(xué)結(jié)構(gòu)為2-異丙基-5-甲基-1,4-苯并醌,是從黑種草籽中分離出來的主要有效單體[20]。黑種草屬毛茛科黑種草屬植物,分布于中東、中亞及我國新疆等地區(qū),全草均可入藥,無明顯毒性作用和不良反應(yīng),幾乎完全用于食用和醫(yī)療,千百年來被廣泛應(yīng)用于多種疾病的治療。20世紀60年代,科學(xué)家首次從黑種香草的種子中提取并分離出TQ,并將其應(yīng)用于各種疾病模型實驗。近年來大量實驗結(jié)果證明TQ具有顯著的抗氧化及抗炎作用[21]。

目前研究表明Nrf2/ARE/HO-1通路作為機體對抗氧化應(yīng)激的主要機制之一[22],而SOD作為一種抗氧化酶可在腦組織中表達[23]。故Nrf2、HO-1及SOD可以反映糖尿病大鼠腦組織中的氧化應(yīng)激水平。本研究發(fā)現(xiàn),模型組大鼠海馬組織的Nrf2和HO-1水平低于正常對照組大鼠,而百里醌組大鼠腦組織中Nrf2和HO-1水平高于模型組。表明模型組大鼠海馬組織內(nèi)發(fā)生了顯著的氧化應(yīng)激反應(yīng),且超出了機體的承受能力。但經(jīng)過TQ治療后,大鼠海馬組織的抗氧化應(yīng)激能力較模型組有顯著上升。同時,模型組SOD活性低于正常對照組,百里醌組海馬組織中SOD活性高于模型組。表明經(jīng)TQ治療后可以提高海馬組織抗氧化應(yīng)激相關(guān)酶的活性,進而改善海馬組織內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn),經(jīng)TQ治療6周后,百里醌組和模型組之間的血糖無明顯差異,表明百里醌組大鼠高表達的Nrf2、HO-1、SOD并未降低血糖。這些結(jié)果表明,糖尿病大鼠海馬腦組織內(nèi)發(fā)生了氧化應(yīng)激反應(yīng),而TQ可能通過激活Nrf2/ARE通路提高抗氧化酶HO-1和SOD的水平從而減輕氧化應(yīng)激對2型糖尿病大鼠海馬組織的損傷。

COX-2作為環(huán)加氧酶同工酶的一種,主要特異性表達于炎性組織,在炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[24]。本研究通過檢測腦組織中的COX-2來評估腦組織中的炎性水平。實驗結(jié)果顯示,模型組中的COX-2的水平明顯均高于正常對照組,而百里醌組腦組織中的COX-2的水平明顯低于模型組,表明糖尿病大鼠的腦組織中存在明顯的炎性反應(yīng)。由于百里醌組和模型組之間的血糖無明顯差異,表明TQ并非通過降低血糖來減輕糖尿病大鼠的炎性反應(yīng),而是直接抑制了糖尿病海馬組織中的炎性反應(yīng)。

DE由多因素、多環(huán)節(jié)、多靶點共同作用所致,隨著社會老齡化進程的推進,其作為糖尿病的又一重要并發(fā)癥對人們生活質(zhì)量的威脅越來越大。由于其病因及發(fā)病機制復(fù)雜,西醫(yī)治療以控制血糖、減輕胰島素抵抗、增加胰島素敏感性為主,缺乏明確的藥物干預(yù)方法。因此,積極尋找特異性藥物控制以進行性認知障礙為主的DE已不容忽視。TQ作為黑草種子的一種提取物,具有廣泛的生物學(xué)活性。本文僅簡單研究了炎癥及氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白質(zhì)的水平,未進一步同步做定量PCR、組織形態(tài)學(xué)、功能學(xué)研究,如腦組織病理及大鼠學(xué)習(xí)記憶能力改變等。但實驗結(jié)果證明TQ可以明顯直接抑制2 糖尿病大鼠腦組織的炎性反應(yīng)以及改善腦組織的氧化應(yīng)激水平,初步說明TQ作為特異性藥物治療DE具有一定的價值。

[1] SIMS-ROBINSON C,BAKEMAN A,ROSKO A,etal.The role of oxidized cholesterol in diabetes-induced lysosomal dysfunction in the brain[J].MolNeurobiol,2016,53(4):2287-2296.

[2] BIESSELS GJ,VAN DER HEIDE LP,KAMAL A,etal.Ageing and diabetes:implications for brain function[J].EurJPharmacol,2002,441(1-2):1-14.

[3] ZILLIOX LA,CHADRASEKARAN K,KWAN JY,etal.Diabetes and cognitive impairment[J].CurrDiabRep,2016,16(9):87.

[4] G?KCE EC,KAHVECI R,G?KCE A,etal.Neuroprotective effects of thymoquinone against spinal cord ischemia-reperfusion injury by attenuation of inflammation,oxidative stress,and apoptosis[J].JNeurosurgSpine,2016,24(6):949-959.

[5] AHMAD MZ,AHMAD J,AMIN S,etal.Role of nanomedicines in delivery of anti-acetylcholinesterase compounds to the brain in Alzheimer's disease[J].CNSNeurolDisordDrugTargets,2014,13(8):1315-1324.

[6] CHEN L,LI B,CHEN B,etal.Thymoquinone alleviates the experimental diabetic peripheral neuropathy by modulation of inflammation[J].SciRep,2016,6:31656.

[7] SELVARAJAH D,TESFAYE S.Central nervous system involvement in diabetes mellitus[J].CurrDiabRep,2006,6(6):431-438.

[8] KIM DJ,YU JH,SHIN MS,etal.Hyperglycemia reduces efficiency of brain networks in subjects with type 2 diabetes[J].PLoSOne,2016,11(6):e0157268.

[9] RESKE-NIELSEN E,LUNDBK K,RAFAELSEN OJ.Pathological changes in the central and peripheral nervous system of young long-term diabetics :I.Diabetic encephalopathy[J].Diabetologia,1966,1(3-4):233-241.

[10] SRINIVASAN K,VISWANAD B,ASRAT L,etal.Combination of high-fat diet-fed and low-dose streptozotocin-treated rat:a model for type 2 diabetes and pharmacological screening[J].PharmacolRes,2005,52(4):313-320.

[11] REED MJ,MESZAROS K,ENTES LJ,etal.A new rat model of type 2 diabetes:the fat-fed,streptozotocin-treated rat[J].Metabolism,2000,49(11):1390-1394.

[12] DAVIDSON E,COPPEY L,LU B,etal.The roles of streptozotocin neurotoxicity and neutral endopeptidase in murine experimental diabetic neuropathy[J].ExpDiabetesRes,2009,2009:431980.

[13] WANG X,ZHAO L.Calycosin ameliorates diabetes-induced cognitive impairments in rats by reducing oxidative stress via the PI3K/Akt/GSK-3beta signaling pathway[J].BiochemBiophysResCommun,2016,473(2):428-434.

[14] KUHAD A,CHOPRA K.Curcumin attenuates diabetic encephalopathy in rats:behavioral and biochemical evidences[J].EurJPharmacol,2007,576(1-3):34-42.

[15] YAN S,DU F,WU L,etal.F1F0 ATP synthase-cyclophilin D interaction contributes to diabetes-induced synaptic dysfunction and cognitive decline[J].Diabetes,2016,65(11):3482-3494.

[16] ZHOU X,ZHANG F,HU X,etal.Inhibition of inflammation by astaxanthin alleviates cognition deficits in diabetic mice[J].PhysiolBehav,2015,151:412-420.

[17] 楊帆,楊立,許旌,等.老年2型糖尿病患者的炎癥因子水平與認知功能障礙的關(guān)系[J].卒中與神經(jīng)疾病,2014,21(3):169-173.

[18] 李新玲,朱向陽,黃懷宇,等.2型糖尿病認知功能障礙患者血清IL-6、TNF-α的水平[J].腦與神經(jīng)疾病雜志,2012,20(1):40-43.

[19] MIAO Y,HE T,ZHU Y,etal.Activation of hippocampal CREB by rolipram partially recovers balance between TNF-α and IL-10 levels and improves cognitive deficits in diabetic rats[J].CellMolNeurobiol,2015,35(8):1157-1164.

[20] HOSSEINZADEH H,PARVARDEH S.Anticonvulsant effects of thymoquinone,the major constituent of Nigella sativa seeds,in mice[J].Phytomedicine,2004,11(1):56-64.

[21] OJHA S,AZIMULLAH S,MOHANRAJ R,etal.Thymoquinone protects against myocardial ischemic injury by mitigating oxidative stress and inflammation[J].EvidBasedComplementAlternatMed,2015,2015:143629.

[22] HUANG WY,CHAO XJ,OUYANG Y,etal.Tacrine-6-ferulic acid,a novel multifunctional dimer against Alzheimer′s disease,prevents oxidative stress-induced neuronal death through activating Nrf2/ARE/HO-1 pathway in HT22 cells[J].CNSNeurosciTher,2012,18(11):950-951.

[23] FAIZ M,ACARIN L,PELUFFO H,etal.Antioxidant Cu/Zn SOD:expression in postnatal brain progenitor cells[J].NeurosciLett,2006,401(1-2):71-76.

[24] ALHOUAYEK M,MUCCIOLI GG.COX-2-derived endocannabinoid metabolites as novel inflammatory mediators[J].TrendsPharmacolSci,2014,35(6):284-292.

Effects of thymoquinone on oxidative stress and cytokine expression in brain of type 2 diabetic rats

FENG Yong-hao1, CHEN Long2, CHEN Ying-hui2, SHI Xiao-hong1△

(1DepartmentofEndocrinology,2DepartmentofNeurology,JinshanHospital,FudanUniversity,Shanghai201508,China)

type2diabetesmellitus;thymoquinone;oxidativestress;inflammation;cytokines;rat

R

Adoi: 10.3969/j.issn.1672-8467.2017.04.015

2016-11-27;編輯:張秀峰)

△Corresponding author E-mail:shixh80301@163.com