張婷婷 李游山* 白瑜 陳旺 龐田田 馮自立，2

1．陜西理工大學(xué)維生素D生理與應(yīng)用研究所，陜西漢中723001

2．陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西漢中723001

骨質(zhì)疏松癥是一種代謝性骨骼疾病，其發(fā)病特點(diǎn)是骨量減少和脆性骨折風(fēng)險(xiǎn)增加［1］。依據(jù)病理特點(diǎn)可分為高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松和低轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松，高轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松多發(fā)于婦女絕經(jīng)后早期，而低轉(zhuǎn)換型骨質(zhì)疏松多發(fā)于老人。研究表明，雌激素缺乏是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(postmenopausal osteoporosis，PMOP)發(fā)生的主要原因［2］。因此，本研究用去卵巢大鼠構(gòu)建PMOP模型，注射雌激素以期達(dá)到預(yù)防性治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的效果。本研究利用組織切片和HE染色法來觀察雌激素預(yù)防性給藥對去卵巢大鼠骨、腎、十二指腸、子宮等組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響，并實(shí)時(shí)跟蹤大鼠體重和臟器重量，比較不同處理組間大鼠體重和臟器指數(shù)的差異，進(jìn)而探討雌激素預(yù)防性給藥對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防效果。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物、供試材料和試劑耗材

7周齡SD大鼠購自第四軍醫(yī)大學(xué)。飼養(yǎng)條件:大鼠自由進(jìn)食和飲水，光暗周期12 h/12 h，相對濕度45% ～55%，通風(fēng)良好。水合氯醛、青霉素G鈉鹽(genicillin G sodium salt)、雌二醇(β-estradiol)，北京索萊寶科技有限公司?？晌招酝饪瓶p合線(4－0)，山東博達(dá)醫(yī)療用品有限公司。醫(yī)用真絲編織線(3－0)和醫(yī)用縫合針(Ο1/2，6x20)，上海浦東金環(huán)醫(yī)療用品股份有限公司。醫(yī)用縫合針(Δ1/2，6×14)，上海漢康醫(yī)療器械有限公司。曙紅水溶，天津精細(xì)化工。蘇木色精，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司。

1.2 造模及預(yù)防性給藥

將18只3月齡的SD大鼠隨機(jī)分為3組:假手術(shù)(sham-operated，Sham)組、去卵巢(ovariectomized，OVX)組、去卵巢后預(yù)防性注射雌二醇(β-estradioltreated OVX，OVX/E2)組。向大鼠腹腔注射7%的水合氯醛溶液(350 mg/kg)，注射3～5 min后大鼠即被麻醉［3］。采用背側(cè)部雙切口入路去卵巢手術(shù)建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型［4］。術(shù)后于大鼠大腿肌肉內(nèi)注射50 mg/mL(77500 U/mL)的青霉素G鈉鹽0.2 mL，并用50 mg/mL的注射用頭孢曲松鈉清洗傷口，以防傷口感染，每日1次，連續(xù)3 d。術(shù)后每只大鼠要單籠飼養(yǎng)1周，每2 d更換一次滅菌墊料。

術(shù)后第10天起，每日根據(jù)體重對OVX/E2組大鼠皮下注射雌二醇，注射劑量為10 μg/kg，Sham和OVX組大鼠皮下注射等量的溶劑(含0.01%DMSO的生理鹽水)，每日1次，連續(xù)給藥51 d。在此期間每3 d更換一次滅菌墊料，每5 d稱一次體重，根據(jù)體重來調(diào)整注射量。

1.3 組織樣品采集

連續(xù)注射51 d后，分別稱量Sham組、OVX組和OVX/E2組的大鼠體重，用CO2處死大鼠，稱量每只大鼠肝、肺、腎、脾、胸腺、子宮的重量，用于計(jì)算每只大鼠對應(yīng)的臟器指數(shù)。將股骨、脛骨、子宮、腎和十二指腸置于4%的多聚甲醛中，4℃固定24 h。

1.4 骨組織的脫鈣處理

固定后的股骨和脛骨于25%、50%、75%的酒精中梯度脫水后，保存在75%的酒精中。將骨組織浸在10%的EDTA溶液(pH 8.0)中，在4℃條件下脫鈣20 d。

1.5 組織形態(tài)學(xué)觀察

首先，將脫鈣后的股骨、脛骨以及固定后的子宮、腎和十二指腸置于75%、80%、95%、100%的酒精中梯度脫水，然后，依次進(jìn)行二甲苯透明、石蠟包埋、切片(厚5 μm)、HE染色并觀察組織形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.6 臟器指數(shù)的計(jì)算和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

臟器指數(shù)=臟器重量(g)/體重(g)×1000。利用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素組間方差分析。

2 結(jié)果

2.1 不同處理組股骨和脛骨的組織形態(tài)學(xué)觀察

為檢測雌激素預(yù)防性給藥對去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松癥的防治效果，我們對Sham組、OVX組、OVX/E2組大鼠的股骨和脛骨進(jìn)行了組織切片和HE染色(圖1)。結(jié)果表明，Sham組大鼠骨小梁結(jié)構(gòu)清晰、面積較大，而OVX組大鼠的骨小梁斷裂、間距變大、結(jié)構(gòu)紊亂，且其周圍存在大量的破骨細(xì)胞。與OVX組相比，OVX/E2組大鼠股骨和脛骨中均未出現(xiàn)明顯的骨質(zhì)疏松癥狀，其骨小梁間距較小，結(jié)構(gòu)較為清晰，骨小梁周圍的破骨細(xì)胞也較少，這表明雌激素在防治骨質(zhì)疏松中起到一定的作用。

血清CA125水平與子宮內(nèi)膜異位癥有一定的相關(guān)性已經(jīng)得到公認(rèn)，作者試圖通過Meta分析說明這一現(xiàn)象并無新意，關(guān)鍵是通過分析得出一些對臨床更有參考價(jià)值的數(shù)據(jù)，建議作者對文章再做修改。

2.2 子宮、十二指腸和腎的組織形態(tài)學(xué)觀察

圖1 不同處理組中大鼠股骨和脛骨的HE染色TB:骨小梁;BM:骨髓腔Fig．1 HE staining of femur and tibia in rats received different treatmentTB:trabecular bone;BM:bone marrow cavity

圖2 不同處理中大鼠子宮、十二指腸和腎的HE染色圖Ep:黏膜上皮;Ug:子宮腺;Gl:腎小球Fig．2 HE staining of uterine，duodenum and kidney in rats received different treatmentEp:endometrial mucosal epithelium;Ug:uterine gland;Gl:glomerulus

為了研究雌激素預(yù)防性給藥對子宮、十二指腸和腎的影響，我們對3組中大鼠的子宮、十二指腸和腎進(jìn)行了石蠟組織切片和HE染色實(shí)驗(yàn)。如圖2所示，相較于Sham組，OVX組大鼠子宮內(nèi)膜固有層中的子宮腺數(shù)目增多，腺腔增大，子宮黏膜上皮明顯增厚。OVX/E2組的子宮腺腺腔雖略有增大，但腺體形態(tài)較為規(guī)則，其子宮內(nèi)膜也未發(fā)生明顯的增厚現(xiàn)象。不同組間大鼠的十二指腸、腎皮質(zhì)區(qū)和腎髓質(zhì)區(qū)在組織形態(tài)上未發(fā)現(xiàn)明顯差異。以上結(jié)果表明，雌激素缺乏會導(dǎo)致子宮形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，一定劑量的雌激素預(yù)防性給藥能夠較好的防治子宮病變，且不會引起其他臟器的的組織形態(tài)學(xué)變化。

2.3 預(yù)防性注射雌激素對大鼠體重的影響

我們對3組的大鼠體重進(jìn)行了定時(shí)稱量，從而探討雌激素預(yù)防性給藥對去卵巢大鼠體重的影響。從注射第1天(即術(shù)后第10天)起稱量大鼠體重，每5 d稱量1次。注射第1、6天時(shí)，OVX組和OVX/E2組的大鼠體重顯著高于Sham組大鼠，注射第16、21、26天的OVX/E2組的大鼠體重也顯著高于Sham組大鼠。盡管其余各個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)(注射第11、31、36、41、46、51 天)的 OVX 組和 OVX/E2組的大鼠體重與Sham組大鼠間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但其平均體重均高于與Sham組大鼠。另外，OVX/E2組與OVX組的大鼠體重在各個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)差異都無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上結(jié)果表明，摘除卵巢會引起大鼠術(shù)后早期的體重增加，而在受試時(shí)間內(nèi)雌激素預(yù)防性給藥不能有效抑制去卵巢手術(shù)引起的大鼠體重增加。

圖3 不同處理組間大鼠體重變化趨勢n=6;*P ＜0.05;＊＊P ＜0.01Fig．3 Trends of rat body weight change among different treatment groups

2.4 不同處理組間大鼠臟器指數(shù)分析

為了進(jìn)一步探討雌激素對去卵巢大鼠不同臟器的影響，我們在術(shù)后第62天處死大鼠后稱量大鼠臟器濕重，并計(jì)算出大鼠的臟器指數(shù)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，OVX組與OVX/E2組大鼠的肝臟重量均顯著高于Sham組大鼠，且OVX組與OVX/E2組大鼠的肝臟重量無顯著性差異;OVX組大鼠的肺和胸腺重量顯著高于Sham組和OVX/E2組，且OVX/E2組與Sham組間大鼠的肺和胸腺的重量均無顯著性差異;OVX組大鼠的腎的重量顯著高于Sham組大鼠，雌激素預(yù)防性給藥后OVX/E2組的腎臟重量略有降低;3組間大鼠的脾和子宮的的重量均無顯著性差異(圖4 A)。由圖4B可以看出，OVX組和OVX/E2組大鼠的肝指數(shù)均顯著高于Sham組，而OVX組與OVX/E2組大鼠的肝指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;相較于Sham組，OVX組大鼠的肺和胸腺指數(shù)略有提高，而雌激素預(yù)防性給藥后去卵巢大鼠(OVX/E2組)的肺和胸腺指數(shù)顯著降低。3組間的腎、脾、子宮的臟器指數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠是研究絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥最佳模型之一［5，6］。本研究利用去卵巢大鼠構(gòu)建絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型，探討雌激素預(yù)防性給藥對絕經(jīng)后大鼠骨和部分臟器的影響。結(jié)果表明，本研究采用的雌激素濃度和給藥方式能夠較好的防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥，而且不會引起子宮、腎、十二指腸等臟器的病變，還能一定程度上緩解去卵巢手術(shù)引發(fā)的臟器指數(shù)的異常變化。

前人的研究證實(shí)，去卵巢手術(shù)8周后，能夠成功構(gòu)建大鼠骨質(zhì)疏松模型［7］。本研究于去卵巢60 d時(shí)采集組織樣品進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OVX組大鼠的股骨和脛骨出現(xiàn)明顯的骨質(zhì)疏松癥狀，這與前人研究是一致的。

腎和十二指腸是維生素D作用的主要靶組織，在骨代謝平衡中發(fā)揮重要作用［8］。Sham、OVX和OVX/E2組大鼠的腎和十二指腸的組織結(jié)構(gòu)未發(fā)現(xiàn)明顯病變，且其腎指數(shù)和十二指腸指數(shù)均無顯著性差異。卵巢的功能之一是合成并分泌類固醇激素(雌激素、孕激素、雄激素等)，維持子宮的生理功能。宋雙紅等［9］采用3月齡SD雌性大鼠構(gòu)建絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松動物模型，利用17β-雌二醇灌胃治療12周后，發(fā)現(xiàn)17β-雌二醇治療組的子宮指數(shù)顯著高于OVX組大鼠。本研究發(fā)現(xiàn)OVX組和OVX/E2組的子宮重量與臟器指數(shù)均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與建模大鼠月齡、雌激素給藥時(shí)間和給藥量的不同有關(guān)。OVX組大鼠的肺和胸腺指數(shù)高于Sham組，而OVX/E2組的肺和胸腺指數(shù)顯著低于OVX組，表明雌激素一定程度上能夠抑制去卵巢手術(shù)引起的臟器指數(shù)升高。需要指出的是，去卵巢后大鼠的肝指數(shù)顯著升高，雌激素給藥組的肝指數(shù)卻未見明顯降低，這可能是去卵巢手術(shù)帶來其他因素變化引起的，具體機(jī)制尚需要進(jìn)一步研究。

子宮是雌激素的重要靶器官，長期大量的給藥雌激素可能會導(dǎo)致子宮內(nèi)腺體增生及鱗化，有增加子宮內(nèi)膜癌的危險(xiǎn)性［10-13］。另有研究［14］表明，子宮內(nèi)膜增厚與子宮內(nèi)膜癌密切相關(guān)。采用合適的雌激素給藥方式、劑量和時(shí)間是有可能實(shí)現(xiàn)既防治骨質(zhì)疏松，又不引起子宮黏膜上皮病變的效果，進(jìn)而最大程度上降低子宮內(nèi)膜癌發(fā)生的可能性。本研究中，相較于Sham組，OVX/E2組的子宮腺腺腔雖略有增大，但腺體形態(tài)較為規(guī)則，其子宮內(nèi)膜也未發(fā)生明顯的增厚和磷化現(xiàn)象，這暗示雌激素給藥的方式和劑量較為合適。

有研究［15-18］報(bào)道雌激素對脂肪的合成代謝有抑制作用，雌激素水平降低后出現(xiàn)脂肪沉積，從而造成體重增加。本研究發(fā)現(xiàn)去卵巢手術(shù)后的OVX組大鼠體重均明顯高于Sham組，這與前人的研究是一致的。然而，注射雌激素后的OVX/E2組大鼠的體重沒有明顯降低，這可能與雌激素給藥時(shí)間較短、給藥劑量較小有關(guān)，也不排除卵巢摘除引起的其他激素變化對去卵巢大鼠早期體重影響的可能性。

綜上所述，本研究去卵巢大鼠絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型構(gòu)建是成功的，且注射雌激素有預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的療效。注射雌激素的量也較為合適，沒有出現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌變等癥狀，腎、十二指腸等一些重要的臟器從組織形態(tài)結(jié)構(gòu)上沒有大的變化。需要指出的是，本研究只是從組織形態(tài)學(xué)和計(jì)量學(xué)上研究雌激素預(yù)防性給藥對去卵巢大鼠骨和臟器的影響，尚需進(jìn)一步研究其對機(jī)體各組織、器官生理功能的影響。