徐佳+毛煜

摘 要 目的：評價SPH0396與乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）的關(guān)系，從而推測其在臨床上與其底物或抑制劑合用時發(fā)生藥物-藥物相互作用的可能性，為臨床研究提供參考。方法：采用Caco-2細(xì)胞模型，測定SPH0396（1 μmol/L）的校正外排比（corrected efflux ratio，CER），并且以E3S為底物時1 μmol/L和5 μmol/L的SPH0396對BCRP的抑制率。結(jié)果：SPH0396的校正外排比為1.33，對BCRP的抑制率不到陽性抑制劑KO143的50%。結(jié)論：SPH0396不是BCRP潛在底物和抑制劑，因此SPH0396與BCRP的底物和抑制劑發(fā)生藥物-藥物相互作用的可能性很低。

關(guān)鍵詞 酪氨酸激酶抑制劑 乳腺癌耐藥蛋白 藥物-藥物相互作用

中圖分類號：R969.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-1533（2017）15-0083-05

Interactions of anti-tumor candidate SPH0396 with breast cancer resistance protein

XU Jia， MAO Yu

（Central Research Institute， Shanghai Pharmaceuticals Holding Co.， Ltd. Shanghai 201203， China）

ABSTRACT Objective： To evaluate the interactions of anti-tumor candidate SPH0396 with breast cancer resistance protein （BCRP）， and its potential drug-drug interaction （DDI） with BCRP substrates or inhibitors in clinic， which can provide a reference for clinical drug-drug interaction study. Methods： Caco-2 cells in vitro were used throughout the experiment to determine the corrected efflux ratio of SPH0396 at 1 μmol/L and the inhibition rate of SPH0396 at 1 μmol/L and 5 μmol/L when estrone-3-sulfate was used as a substrate. Results： The corrected efflux rate of SPH0396 was 1.33. The inhibitory rate of SPH0396 on BCRP was less than 50% of KO143 positive inhibitors. Conclusion： The present studies demonstrate that SPH0396 may be neither a substrate nor an inhibitor for BCRP， and have low potential to cause drug-drug interactions with BCRP substrate drugs.

KEY WORDS tyrosine kinase inhibitors； breast cancer resistance protein； drug-drug interaction

眾多癌癥的發(fā)生和發(fā)展被證明與酪氨酸激酶的活性紊亂有關(guān)，多種小分子酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors，TKIs）被批準(zhǔn)上市用于治療腫瘤[1-3] 。針對Bcr-Abl靶點(diǎn)，我院自主設(shè)計并合成的SPH0396（圖1）在激酶和細(xì)胞水平的抗腫瘤活性、體內(nèi)外藥代特性均表現(xiàn)良好，與上市藥物博舒替尼相當(dāng)甚至更優(yōu)[4-5]，因此將其作為候選化合物進(jìn)一步研究。

乳腺癌耐藥蛋白BCRP（breast cancer resistance protein， BCRP/ABCG2）是由655個氨基酸包含6個跨膜區(qū)域和1個核苷酸結(jié)合區(qū)域的外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[6-8]，在人體腫瘤細(xì)胞中廣泛表達(dá)[9-10]，與癌癥及炎癥化療耐藥相關(guān)[11-13]。BCRP對藥物吸收形成障礙并影響藥物的口服生物利用度，同時對肝膽的排泄產(chǎn)生影響[14-15]。文獻(xiàn)報道BCRP限制拓?fù)涮婵翟诶鲜蠛腿梭w內(nèi)的口服吸收[16]。藥物與轉(zhuǎn)運(yùn)體的相互作用是藥物理化性質(zhì)之外決定藥物體內(nèi)藥動學(xué)性質(zhì)的決定性因素，因此，在新藥開發(fā)早期應(yīng)考察藥物與轉(zhuǎn)運(yùn)體的相互作用，篩選并優(yōu)化藥物，使其到達(dá)作用靶點(diǎn) [17-19]。

來源于人結(jié)腸腺癌的Caco-2細(xì)胞很容易在體外培養(yǎng)并保持穩(wěn)定，培養(yǎng)成熟的Caco-2細(xì)胞與小腸上皮細(xì)胞類似，分化出絨毛面AP（apical，腸腔一側(cè)） 和基底面BL （basolateral，腸內(nèi)壁一側(cè)），表達(dá)多種轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)相關(guān)蛋白（例如BCRP等）[20-21]，BCRP已經(jīng)被證明存在于腸道上皮細(xì)胞頂膜[16]，本研究利用Caco-2細(xì)胞模型初步預(yù)測SPH0396與BCRP的底物或抑制劑發(fā)生藥物-藥物相互作用（drug-drug interaction，DDI）的可能性，為臨床DDI研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

SPH0396來源于中央研究院藥化室；高糖DMEM培養(yǎng)基、谷氨酰胺、雙抗生素、胎牛血清、胰蛋白酶-EDTA均購自美國Gibco公司；普萘洛爾、阿替洛爾和雙氯芬酸購自中國藥品生物制品檢定所；肝素和阿霉素購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；替硝唑、環(huán)孢素A（簡稱CsA）、Estrone-3-Sulfate（簡稱E3S）、 KO143購自美國Sigma公司；人結(jié)腸癌細(xì)胞系Caco-2細(xì)胞（中國科學(xué)院上海生化細(xì)胞所細(xì)胞庫）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

API4000 QTRAP 型串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國 Applied Biosystem 公司）；Waters Acquity UPLC 系統(tǒng)（美國Waters 公司）；生物安全柜（美國Labconco公司）；CO2恒溫培養(yǎng)箱和酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；細(xì)胞電阻儀（美國Millipore 公司）；TS100 型倒置顯微鏡（日本尼康公司）；3K15臺式離心機(jī)（美國Sigma公司）；ZHWY-103B多振幅軌道式恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）；插入式培養(yǎng)器（美國Millipore 公司）；24孔培養(yǎng)板（美國Corning公司）。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞按6×104個細(xì)胞/ml的濃度接種到Caco-2細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)（圖2）的絨毛面（apical，A側(cè)，簡稱AP，腸腔一側(cè)），每孔0.4 ml，向基底面（basolateral，B側(cè)，簡稱BL；腸內(nèi)壁一側(cè)）加入空白細(xì)胞培養(yǎng)液0.6 ml，接種后間隔1 d更換新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)至21 d。

1.3.2 細(xì)胞模型的建立及驗(yàn)證

Caco-2細(xì)胞接種后的21 d內(nèi)測定Caco-2細(xì)胞單層膜上的跨膜電阻TEER值。實(shí)驗(yàn)同時選用普萘洛爾（Hanks）作為高滲透的陽性對照，阿替洛爾（Hanks）作為低滲透的陰性對照，驗(yàn)證Caco-2細(xì)胞單層的完整性。

1.3.3 評價SPH0396是否為BCRP的底物

細(xì)胞培養(yǎng)至第21天，測定細(xì)胞的TEER值，進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)體實(shí)驗(yàn)。AP側(cè)和BL側(cè)的給藥體積分別是0.4 ml和0.6 ml，37 ℃震蕩孵育90 min后，用移液器吸取接收側(cè)樣品。具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計見表1。

1.3.4 評價SPH0396是否抑制BCRP

細(xì)胞培養(yǎng)至第21天，測定細(xì)胞的TEER值，進(jìn)行轉(zhuǎn)運(yùn)體實(shí)驗(yàn)。AP側(cè)和BL側(cè)的給藥體積分別是0.4 ml和0.6 ml，37 ℃震蕩孵育90 min后，用移液器吸取接收側(cè)樣品。具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計見表2。

1.3.5 樣品處理及測定

取接收側(cè)樣品100 ml，加入100 ml含內(nèi)標(biāo)的乙腈（E3S內(nèi)標(biāo)為含0.5 μmol/L的雙氯芬酸，剩余化合物內(nèi)標(biāo)為0.1 mg/mL的替硝唑）沉淀蛋白，震蕩、離心（6 000 g，10 min）后取70 ml測定。

E3S為負(fù)離子檢測，其余均是正離子檢測，用于定量分析的質(zhì)譜條件見表3。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

評價SPH0396是否為BCRP的底物，通過表觀透過系數(shù)Papp來判定，校正外排比（corrected efflux ratio，CER）表示BCRP外排能力[19]，評價SPH0396是否是BCRP的抑制劑抑制率（inhibition degree）按文獻(xiàn)[22]計算。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 細(xì)胞模型的完整性考察

2.1.1 光學(xué)顯微鏡觀察

通過光學(xué)顯微鏡觀察到細(xì)胞生長均勻，邊界清晰（圖3）。

2.1.2 TEER值

對Caco-2單層細(xì)胞進(jìn)行跨膜電阻檢測，結(jié)果顯示：隨著生長時間的延長，細(xì)胞跨膜電阻逐漸增大，在第21天會達(dá)到平臺（圖4），用于藥物吸收轉(zhuǎn)運(yùn)的研究具有良好的準(zhǔn)確性。

2.1.3 細(xì)胞功能完整性檢測

跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)陽性對照藥物普萘洛爾（5 μmol/L）的表觀透過系數(shù)Papp為1.04×10-5 cm/s，與文獻(xiàn)報道（3.0×10-5 cm/s）相似[20]?？缂?xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)陰性對照藥物阿替洛爾（1 μmol/L）的表觀透過系數(shù)Papp為8.71×10-7 cm/s，滿足試驗(yàn)要求。結(jié)果表明，本研究建立的Caco-2細(xì)胞模型用于評價藥物透過性具有良好的準(zhǔn)確性。

2.2 評價SPH0396是否為BCRP的底物

以BCRP的底物E3S作為陽性藥，KO143為抑制劑，計算E3S的校正外排比為9.08，這就驗(yàn)證多藥耐藥轉(zhuǎn)運(yùn)體BCRP。SPH0396的校正外排比為1.33（表4），F(xiàn)DA規(guī)定大于2即為BCRP的潛在底物[19]，所以SPH0396不是BCRP的潛在底物。

2.3 評價SPH0396是否抑制BCRP

阿霉素是P-GP和BCRP的共同底物，CsA是P-GP和BCRP的共同抑制劑[23]，以阿霉素為底物時， SPH0396對外排轉(zhuǎn)運(yùn)體P-GP和BCRP有抑制，E3S為BCRP的特異性底物，1 μmol/L和5 μmol/L的SPH0396對BCRP無抑制。

3 討論

隨著藥代動力學(xué)體外研究技術(shù)的發(fā)展進(jìn)步，利用臨床前的體外試驗(yàn)預(yù)測藥物在體內(nèi)發(fā)生相互作用，可以大大減少上市后因嚴(yán)重相互作用而被淘汰的巨大風(fēng)險，對開發(fā)新藥具有重大意義[24]。乳腺癌、肺癌、白血病等惡性腫瘤均有BCRP的相關(guān)文獻(xiàn)報道，大部分研究提示其與預(yù)后有關(guān)[25-27]。研究抗腫瘤候選藥SPH0396與乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）的關(guān)系，可以為臨床試驗(yàn)提供一定的理論依據(jù)。

Caco-2細(xì)胞上同時存在外排轉(zhuǎn)運(yùn)體P-GP和BCRP，因此Caco-2細(xì)胞可以用來研究藥物與P-GP和BCRP轉(zhuǎn)運(yùn)體的相互關(guān)系。E3S是BCRP的特異性底物，KO143為BCRP特異性抑制劑，E3S的校正外排比為9.08（FDA規(guī)定應(yīng)大于2），說明Caco-2細(xì)胞可用于試驗(yàn)研究。結(jié)果顯示，SPH0396的校正外排比為1.33，說明其不是BCRP的潛在底物。阿霉素是P-GP和BCRP的共同底物，而CsA是P-GP和BCRP共同的抑制劑[26]，1 μmol/L和5 μmol/L的SPH0396可不同程度地減小底物阿霉素的轉(zhuǎn)運(yùn)外排比（從11.14降到2.78和1.15），同時還發(fā)現(xiàn)抑制率有濃度依耐性（1 μmol/L的SPH0396的抑制率3.98%，5 μmol/L的SPH0396的抑制率72.03%），但以E3S為底物時，1 μmol/L的SPH0396的抑制率14.93%，5 μmol/L的SPH0396的抑制率28.85%，本實(shí)驗(yàn)可以確認(rèn)SPH0396抑制P-GP的程度比抑制BCRP的大。

BCRP已經(jīng)被證明存在于腸道上皮細(xì)胞頂膜[16]，即AP側(cè)，以E3S為底物時，1 μmol/L和5 μmol/L的SPH0396并沒有增大底物E3S的轉(zhuǎn)運(yùn)，Papp（AP-BL）值從2.19E-07到2.31E-07和1.90E-07，進(jìn)一步說明SPH0396沒有抑制BCRP對底物E3S的外排作用，同時抑制率也達(dá)不到陽性抑制劑KO143的50%[19]，根據(jù)文獻(xiàn)報道，認(rèn)為化合物達(dá)到陽性藥抑制率的50%即為抑制劑[19]，所以初步認(rèn)為SPH0396不抑制BCRP。

我們的結(jié)果表明SPH0396既不是BCRP的底物也不是抑制劑，所以SPH0396與BCRP的抑制劑和底物發(fā)生DDI的可能性并不高，臨床無需特別關(guān)注。

參考文獻(xiàn)

[1] Levitzki A. Tyrosine kinase inhibitors： views of selectivity， sensitivity， and clinical performance[J]. Annu Rev Pharmacol Toxicol， 2013， 53（1）： 161-185.

[2] 李欣， 高金恒， 陳國良. 蛋白酪氨酸激酶抑制劑的研究進(jìn)展[J]. 沈陽藥科大學(xué)學(xué)報， 2011， 28（12）： 1005-1021.

[3] 劉舒暢， 張健存， 陳賽娟. BCR-ABL蛋白酪氨酸激酶抑制劑的研究進(jìn)展[J]. 中國醫(yī)藥工業(yè)雜志， 2010， 41（4）： 293-297.

[4] 鄭敏， 白秋江， 胡躍民. 慢性髓性白血病治療藥博舒替尼[J]. 藥物流行病學(xué)雜志， 2014， 23（1）： 58-60.

[5] Rabbani S A， Valentino M L， Arakelian A， et al. SKI-606（Bosutinib） blocks prostate cancer invasion， growth， and metastasis in vitro and in vivo through regulation of genes involved in cancer growth and skeletal metastasis[J]. Mol Cancer Ther， 2010， 9（5）： 1147-1157.

[6] Kenawi IM， Barsoum BN， Youssef MA. Drug-drug interaction between diclofenac， cetirizine and ranitidine.[J]. J Pharm Biomed Anal， 2005， 37（4）： 655-661.

[7] Staud F， Pavek P. Breast cancer resistance protein （BCRP/ ABCG2）[J]. Int J Biochem Cell Biol， 2005， 37（4）： 720-725.

[8] Fagerholm U. Prediction of human pharmacokinetics--gastrointestinal absorption[J]. J Pharm Pharmacol， 2007， 59（7）： 905-916.

[9] Miyake K， Mickley L， Litman T， et al. Molecular cloning of cDNAs which are highly overexpressed in mitoxantroneresistant cells： demonstration of homology to ABC transport genes.[J]. Cancer Res， 1999， 59（1）： 8-13.

[10] Ayrton A， Morgan P. Role of transport proteins in drug absorption， distribution and excretion[J]. Xenobiotica， 2001， 31（8-9）： 469-497.

[11] Choudhuri S， Klaassen CD. Structure， function， expression， genomic organization， and single nucleotide polymorphisms of human ABCB1 （MDR1）， ABCC （MRP）， and ABCG2（BCRP） efflux transporters.[J]. Int J Toxicol， 1900， 25（4）： 231-259.

[12] Dm VDK， Vellenga E， Scheffer GL， et al. Expression and activity of breast cancer resistance protein （BCRP） in de novo and relapsed acute myeloid leukemia[J]. Blood， 2002， 99（10）： 3763-3770.

[13] Steinbach D， Sell W， Voigt A， et al. BCRP gene expression is associated with a poor response to remission induction therapy in childhood acute myeloid leukemia.[J]. Leukemia， 2002， 16（8）： 1443-1447.

[14] Maliepaard M， Scheffer GL， Faneyte IF， et al. Subcellular localization and distribution of the breast cancer resistance protein transporter in normal human tissues[J]. Cancer Res， 2001， 61（8）： 3458-3464.

[15] Aronica E， Gorter JA， Redeker S， et al. Localization of breast cancer resistance protein （BCRP） in microvessel endothelium of human control and epileptic brain[J]. Epilepsia， 2005， 46（6）： 849-857.

[16] Jonker JW， Smit JW， Brinkhuis RF， et al. Role of breast cancer protein in the bioavailability and fetal penetration of topotecan[J]. J Nat Cancer Inst， 2000， 92（20）： 1651-1656.

[17] Shitara Y， Horie T， Sugiyama Y. Transporters as a determinant of drug clearance and tissue distribution[J]. Eur J Pharm Sci， 2006， 27（5）： 425-446.

[18] Ho RH， Kim RB. Transporters and drug therapy： implications for drug disposition and disease[J]. Clin Pharmacol Ther， 2005， 78（3）： 260-277.

[19] Guidance for industry： drug interaction studies -study design， data analysis， implications for dosing， and labeling recommendations[EB/OL]. [2017-05-05]. http： //www. fda. gov/downloads/Drugs/ GuidanceComplianceRegulatoryInformation/Guidances/ ucm292362. pdf.

[20] Li J， Volpe DA， Wang Y， et al. Use of transporter knockdown Caco-2 cells to investigate the in vitro efflux of statin drugs[J]. Drug Metab Dispos， 2011， 39（7）： 1196-1202.

[21] Takano M， Yumoto R， Murakami T. Expression and function of efflux drug transporters in the intestine [J]. Pharmacol Ther， 2006， 109（1-2）： 137-161.

[22] Balimane PV， Patel K， Marino A， et al. Utility of 96 well Caco-2 cell system for increased throughput of P-gp screening in drug discovery[J]. EurJ Pharm Biopharm， 2004， 58（1）： 99-105.

[23] Xia CQ， Liu N， Miwa GT， et al. Interactions of cyclosporine A with breast cancer resistance protein[J]. Drug Metab Dispos， 2007， 35（4）： 576-582.

[24] 唐靖， 彭文興. 細(xì)胞色素P450酶和P-GP介導(dǎo)藥物相互作用的體外研究方法[J] 中南藥學(xué)， 2007， 5（6）： 535-539.

[25] Burger H， Foekens JA. RNA expression of breast cancer resistance protein， lung resistance-related protein， multidrug resistance-associated proteins 1 and 2， and multidrug resistance gene 1 in breast cancer： correlation with chemotherapeutic[J]. J Clin Cancer Res， 2003， 9（2）： 827-836.

[26] Benderra Z， Faussat AM， Sayada L， et al. Breast cancer resistance protein and P-glycoprotein in 149 adult acute myeloid leukemias[J]. Clin Cancer Res， 2004， 10（23）： 7896-7902.

[27] Yoh K， Ishii G， Yokose T， et al. Breast cancer resistance protein impacts clinical outcome in platinum-based chemotherapy for advanced non-small cell lung cancer.[J]. Clin Cancer Res， 2004， 10（5）： 1691-1697.