劉建飛+匡瑾瑾+傅暉

摘 要 通過(guò)使用管式離心機(jī)替代轉(zhuǎn)子離心機(jī)對(duì)rhG-CSF（賽格力）包含體處理工藝進(jìn)行改進(jìn)，使4個(gè)亞批次處理的包含體合并為1個(gè)批次進(jìn)行處理，操作時(shí)間縮短4倍。通過(guò)改進(jìn)前后的質(zhì)量對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，本工序變性蛋白的純度、內(nèi)毒素及殘余DNA與原工藝相比均無(wú)明顯差異，且符合企業(yè)質(zhì)量要求，而人工和動(dòng)力成本下降了75%。

關(guān)鍵詞 包含體 rhG-CSF 變性蛋白

中圖分類號(hào)：TQ464.7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-1533（2017）15-0075-04

Process improvement of inclusion-body of rhG-CSF

LIU Jianfei*， KUANG Jinjin， FU Hui

（Shanghai Sunway Biotech Co.， Ltd.， Shanghai 201206， China）

ABSTRACT An improved process for the treatment of rhG-CSF inclusion body was established by using tubular centrifuge instead of rotor centrifuge， which could make 4 sub-batches treatment of inclusion bodies in the original process into only one and total operation time be reduced to one fourth. It was found that the purity of denatured protein and the contaimination of endotoxin and residual DNA in the improved process was comparable to those in the original process and the quality could meet the requirements of enterprises while the costs of labor and power could be reduced by 75%.

KEY WORDS inclusion body； rhG-CSF； denatured protein

人粒細(xì)胞集落刺激因子是一個(gè)小的弱酸性蛋白，分子量為18.8 kD。重組人粒細(xì)胞集落刺激因子（rhG-CSF）為利用基因重組技術(shù)通過(guò)工程菌的發(fā)酵生產(chǎn)的，與天然產(chǎn)品相比，生物活性在體內(nèi)、外基本一致。rhG-CSF是調(diào)節(jié)骨髓中粒系造血的主要細(xì)胞因子之一，選擇性作用于粒系造血祖細(xì)胞，促進(jìn)其增殖、分化，并可增加粒系終末分化細(xì)胞的功能[1]。它對(duì)于治療由腫瘤放化療、骨髓移植所引起的粒細(xì)胞減少癥具有顯著療效[2-4]

賽格力（SunGran）為我們公司生產(chǎn)的重組人粒細(xì)胞集落刺激因子注射液的商品名，是以大腸埃希氏菌為表達(dá)載體，表達(dá)的rhG-CSF以包含體[5]形式存在與大腸埃希氏菌細(xì)胞質(zhì)中，須經(jīng)細(xì)胞破碎后收集包含體，再經(jīng)包含體處理、復(fù)性、純化，制備成賽格力原液[5-7]。

包含體處理一般采用多種緩沖液對(duì)其進(jìn)行洗滌，最后用高濃度變性劑（6 mol/L鹽酸胍或8 mol/L尿素）對(duì)其進(jìn)行溶解。由于包含體難溶解和密度的特異性，緩沖液洗滌后，都用離心機(jī)來(lái)進(jìn)行固液分離，重新收集包含體[8-11]。目前廣泛運(yùn)用的轉(zhuǎn)子離心機(jī)由于處理量小，效率較低。管式離心機(jī)利用連續(xù)離心的原理，可以在短時(shí)間內(nèi)一次離心大量的液體。本研究利用管式離心機(jī)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的轉(zhuǎn)子離心機(jī)，對(duì)包含體處理工藝進(jìn)行改進(jìn)，實(shí)踐證明工藝改進(jìn)后的產(chǎn)量和質(zhì)量無(wú)明顯變化，而工作效率大大提高了。

1 材料與方法

1.1 材料

基因工程大腸埃希氏菌在發(fā)酵罐中進(jìn)行高密度發(fā)酵[12-13]，最終獲得50 L發(fā)酵液，離心收集到2 800 g菌體，收集的大腸埃希氏菌經(jīng)超聲破碎、離心后獲得的固體物質(zhì)約600 g。

脫氧膽酸鈉、十二烷基肌氨酸鈉、Acrylamide/bisacrylamide，30% solution（分析純，Sigma公司）；二巰蘇糖醇、Tris（分析純，Promega公司）；低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白（marker，中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所，分子量依次為97.4、66.2、43.0、31.0、20.1和14.4 kD）；細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（10 EU/ml及1 000 EU/ml）、鱟試劑（湛江安度斯生物有限公司）；鹽酸胍（分析純，英濰捷基上海貿(mào)易有限公司）；DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter KIT（Roche公司）；其他常用化學(xué)試劑為市售分析純或藥用輔料。

1.2 設(shè)備

GQ76管式離心機(jī)、GL-21M高速冷凍離心機(jī)（上海離心機(jī)研究所）；PowerPac HV電泳儀、GelDocXR凝膠成像儀（Bio-Rad公司）。J98-Ⅲ DN型超聲儀（寧波新芝生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 溶液制備

破菌緩沖液：20 mmol/L pH 8.0 Tris-EDTA-2Na鹽酸緩沖液；水溶性洗滌液（A液）：1 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉、0.1 mol/L氯化鈉；脂溶性洗滌液（B液）：含1%脫氧膽酸鈉、5 mmol/L二巰蘇糖醇、5 mmol/L乙二胺四乙酸二鈉的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 9.0）；蛋白溶解液（C液）：含2%十二烷基肌氨酸鈉、20 mmol/L硫酸銅的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）；變性液（D液）：含6 mol/L鹽酸胍的40 mmol/L的HAc-NaAc緩沖液（pH 4.0）。

1.3.2 原工藝和改進(jìn)后工藝

賽格力一批發(fā)酵所獲得的包含體分成4個(gè)亞批進(jìn)行處理。首先，包含體分別經(jīng)純化水、A液、B液洗滌，每次洗滌后均離心收集沉淀。B液洗滌后收集的沉淀，用C液溶解后，收集上清液，然后在上清液中加入冷凍后的丙酮（在冰浴條件下）進(jìn)行攪拌離心，收集沉淀，最后用變性劑D液溶解，離心獲得含變性蛋白的上清液（圖1）。

改進(jìn)后工藝流程和改進(jìn)前一樣，只是前5步用管式離心機(jī)代替轉(zhuǎn)子離心機(jī)，但是考慮到安全原因，丙酮沉淀后的步驟還是保留使用轉(zhuǎn)子離心機(jī)。

1.4 檢測(cè)方法

內(nèi)毒素檢測(cè)：按照《中國(guó)藥典》2015年版通則1143方法1 凝膠法進(jìn)行檢測(cè)。

殘余DNA測(cè)定：按照《中國(guó)藥典》2015年版通則3407第一法 DNA探針雜交法進(jìn)行檢測(cè)。

電泳方法：按照《中國(guó)藥典》2015年版通則0541第五法SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)量比較

采用管式離心機(jī)勞動(dòng)效率得到了大大提高，但是兩者所采用的離心模式以及離心力還是有所不同的。管式離心機(jī)是否能夠把洗滌液中的包含體全部離心收集起來(lái)，將是影響其產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。分別選取了工藝改進(jìn)前和后連續(xù)的3批包含體處理后所得到的蛋白量進(jìn)行比較（表1）。結(jié)果表明，改進(jìn)前后產(chǎn)量無(wú)明顯差異。同時(shí)改進(jìn)后3批RSD為3.9%較改進(jìn)前的8.7%有著更好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

對(duì)采用改進(jìn)工藝的F004處理時(shí)的純化水、A液、B液丟棄上清取樣，進(jìn)行電泳檢測(cè)（圖2）。丟棄的上清中含有大量的雜質(zhì)蛋白。對(duì)照rhG-CSF分子量為18.8 kD，在電泳的相應(yīng)分子量位置未見(jiàn)有大量目標(biāo)蛋白存在。經(jīng)電泳圖譜掃描，損失蛋白大約在10%以下，與原有工藝基本持平。

2.2 質(zhì)量對(duì)比

2.2.1 純度

包含體內(nèi)除了含有目標(biāo)蛋白外，還含有大量的宿主蛋白。利用包含體的不易溶解的特性，分別用不同的緩沖液來(lái)溶解大腸埃希氏菌本身的蛋白質(zhì)，從而達(dá)到分離宿主蛋白的目的。圖3是工藝改進(jìn)前后各1批處理后獲得變性蛋白的電泳圖譜。工藝改進(jìn)前后的圖譜基本一致，改進(jìn)后未見(jiàn)有新的雜蛋白產(chǎn)生。同時(shí)對(duì)電泳圖譜進(jìn)行掃描，圖形基本一致（圖4）。

表3對(duì)工藝改進(jìn)前后連續(xù)各3批變性蛋白的純度進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)與比較。工藝改進(jìn)后純度均在80%以上，達(dá)到變性蛋白質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)要求，并且RSD值為1.80%，說(shuō)明改進(jìn)工藝具有相當(dāng)穩(wěn)定的重現(xiàn)性。

2.2.2 內(nèi)毒素

工程菌大腸埃希氏菌屬革蘭陰性菌，超聲破壁后收集包含體時(shí)，裂解液中也含有大量的細(xì)菌內(nèi)毒素，須盡可能地去除掉。經(jīng)我們檢測(cè)，未經(jīng)處理的包含體，其細(xì)菌內(nèi)毒素含量大于1 000萬(wàn)EU/ml。檢測(cè)連續(xù)3批包含體處理后樣品的內(nèi)毒素含量，值均在100～1 000 EU/ml之間，達(dá)到要求。

2.2.3 殘余DNA

隨著超聲破碎，大腸埃希氏菌的宿主DNA也與包含體粘連在一起。由于微生物來(lái)源的基因組DNA富含CpG和非甲基化序列，故殘余DNA增加了重組蛋白藥物在體內(nèi)的免疫源性風(fēng)險(xiǎn)[14-15]，一直是國(guó)內(nèi)外藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)關(guān)注的重點(diǎn)。目前檢測(cè)的方法為半定量法，通過(guò)樣品與標(biāo)準(zhǔn)品顏色深淺的比較，來(lái)確定殘余宿主DNA含量的范圍。從圖5可以看出，工藝改進(jìn)前后2批次的樣品F001和F004顏色深淺幾乎一樣，介于標(biāo)準(zhǔn)品100 ng和10 ng之間，滿足變性蛋白質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中殘余DNA≤100 ng/ml的要求。表4統(tǒng)計(jì)了連續(xù)3批工藝改進(jìn)處理后最終樣品的殘余DNA含量，均小于100 ng/ml，達(dá)到要求。

2.3 生產(chǎn)效率

用轉(zhuǎn)子離心機(jī)處理一批高密度發(fā)酵所獲得的包含體，必須分成4個(gè)亞批次進(jìn)行處理。每個(gè)亞批次的時(shí)間為2個(gè)工作日，也就是處理完1批完整的包含體需要8個(gè)工作日。用管式離心代替轉(zhuǎn)子離心機(jī)可以一次性處理完整的一批包含體，并且只需要2個(gè)工作日。生產(chǎn)效率提高了4倍。節(jié)約了6 d操作時(shí)間。勞動(dòng)效率的提升，帶來(lái)了生產(chǎn)成本的降低。1批發(fā)酵按照上海市人2017年人均工資計(jì)算，改進(jìn)后節(jié)省人工成本1 740元，同時(shí)動(dòng)力消耗也節(jié)省9 000元。

1批發(fā)酵獲得的包含體通過(guò)處理，一般可以獲得22 g蛋白。原工藝的人工和動(dòng)力成本為14 320元，而改進(jìn)后的成本為3 580元。獲得的粗蛋白的成本從651元/g下降到163元/g，成本下降了75%。

3 討論

從產(chǎn)量、蛋白純度、內(nèi)毒素和殘余DNA幾個(gè)方面對(duì)賽格力包含體洗滌改進(jìn)工藝與原工藝進(jìn)行了比較，改進(jìn)工藝在產(chǎn)量和質(zhì)量上與原工藝基本持平，具有相當(dāng)好的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，同時(shí)大大提高了勞動(dòng)效率，降低了生產(chǎn)成本，表明改進(jìn)工藝在實(shí)際生產(chǎn)上是可行的。

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