方子妍郭彩鳳吳逢春秦家明寧玉萍周列民

·論 著·

普朗尼克P85修飾的苯妥英鈉納米粒對顳葉內側癲癇大鼠模型的腦靶向作用

方子妍*郭彩鳳*吳逢春*秦家明△寧玉萍*周列民△

目的觀察普朗尼克P85修飾的聚氰基丙烯酸正丁酯構建的苯妥英鈉納米粒能否避開顳葉內側癲癇大鼠模型腦中P糖蛋白（P-glycoprotein，Pgp）的外排作用將苯妥英鈉靶向輸送到腦組織中。方法鋰-匹羅卡品誘導大鼠形成慢性顳葉內側癲癇模型。免疫組化檢測腦組織中Pgp的表達水平。界面聚合法制備苯妥英鈉納米粒，與普通苯妥英鈉比較，觀察兩組不同給藥的模型鼠（苯妥英鈉納米粒組6只，普通苯妥英鈉組7只）在給藥后30、60、120、180、240、300 min時其腦組織中苯妥英鈉的藥物分布情況。采用立體定向活體微透析技術采集腦微透析液，高效液相色譜法檢測待測標本中苯妥英鈉的藥物濃度。結果兩組不同給藥的模型鼠的腦/血漿的時間藥物濃度曲線的曲線下面積比值差異有統(tǒng)計學意義[即苯妥英鈉納米粒組（0.37±0.10，n=6）明顯高于普通苯妥英鈉組（0.19±0.06，n=7），P<0.05]。與正常大鼠相比，模型鼠海馬CA1、CA3及DG區(qū)Pgp表達上調。結論普朗尼克P85修飾的聚氰基丙烯酸正丁酯納米?？娠@著地提高抗癲癇藥物苯妥英鈉靶向進入Pgp高表達的顳葉內側癲癇模型鼠腦中的濃度。

納米粒 顳葉癲癇 P糖蛋白 苯妥英鈉 靶向

癲癇是中樞神經系統(tǒng)的第二大常見病。盡管近年來癲癇在治療方法上已取得了長足的進步，但合理、規(guī)則地服用抗癲癇藥物（antiepileptic drugs，AEDs）仍是治療癲癇的主要手段。雖經正規(guī)的AEDs治療，仍有約30%的癲癇患者其發(fā)作無法控制，即耐藥性癲癇[1-3]。而臨床上耐藥性癲癇以顳葉內側癲癇 （mesial temporal lobe epilepsy，MTLE）為多見。雖耐藥性癲癇的病理生理機制存在多種假說，但一個非常重要的特性就是該類癲癇對多種AEDs產生耐藥，盡管這些AEDs具有不同的作用機制[4]。因此更多的指向于多藥轉運體過度表達學說。研究發(fā)現(xiàn)耐藥性癲癇患者手術切除的腦組織中Pgp（多藥轉運體之一）過度表達，而幾乎所有的AEDs都是Pgp的底物。動物實驗也進一步證實腦中Pgp過度表達導致了藥物耐受[5]。因此如何規(guī)避Pgp過度表達導致的耐藥，保證AEDs靶向進入癲癇灶是耐藥性癲癇治療領域的研究熱點。近年來，納米及相關材料技術飛速發(fā)展，在生物醫(yī)學領域得到了廣泛的研究與應用。有研究發(fā)現(xiàn)聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒是目前少數(shù)可通過血腦屏障的納米微粒之一[6]。而普朗尼克P85是一種具有藥理活性的多功能藥用輔料，在藥物穿越血腦屏障的過程中起著重要作用，此外，普朗尼克P85還具有Pgp抑制作用[7-9]。因此，本研究采用聚氰基丙烯酸正丁酯作為苯妥英鈉的載藥材料，添加普朗尼克P85作為納米粒的表面修飾，制作成苯妥英鈉納米粒，以考察其在MTLE大鼠模型中的腦靶向輸送苯妥英鈉的效用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物32只雌性6～8周SD大鼠，體重160～180 g，由廣東省實驗動物研究所提供。

1.2 MTLE模型的構建

1.2.1匹羅卡品誘導大鼠出現(xiàn)MTLE 32只大鼠腹腔注射氯化鋰 （127.2 mg/kg）（Sigma L9650-100G）；18～24 h后腹腔注射東莨菪堿 （1 mg/kg）（Sigma S8502-1G）；之后30 min，腹腔注射匹羅卡品 （30 mg/kg）（Sigma P6503-10G）；當大鼠出現(xiàn)RacineⅣ/Ⅴ發(fā)作后開始計時，等待發(fā)作持續(xù)90 min后再腹腔注射地西泮注射液 （10 mg/kg）終止發(fā)作；存活的大鼠飼養(yǎng)出現(xiàn)慢性反復自發(fā)性發(fā)作（即MTLE）。并記錄相關視頻腦電資料。

1.2.2大鼠癲癇發(fā)作評估按Racine標準[10]進行分級 Ⅰ級：面部陣攣；Ⅱ級：面部陣攣+節(jié)律點頭；Ⅲ級：面部陣攣+節(jié)律點頭+前肢陣攣；Ⅳ級：面部陣攣+節(jié)律點頭+前肢陣攣+后肢站立；Ⅴ級：面部陣攣+節(jié)律點頭+前肢陣攣+后肢站立+跌倒+豎尾。

1.2.3腦電圖描記 大鼠用10%水合氯醛麻醉后固定。電極插入大鼠頭頂部雙側外耳門連線內外1/3位點處頭皮下固定于顱骨內，對照電極插入后頸部皮下，描記腦電活動。

1.3 Pgp表達水平檢測腦組織切片以非免疫性動物血清封閉，采用單克隆小鼠抗大鼠Mdr C-19抗體（sc-1517，Santa Cruz Biotechnology，USA）混合稀釋孵育，最后免疫組化試劑盒 Dako K5007（DAB＋CHROMOGEN×50，5 mL）染色[11]。

1.4 苯妥英鈉納米粒的制備及檢測

1.4.1納米粒的制備 將α-BCA（1%，v/v）（氰基丙烯酸正丁酯單體，1 mL，廣州白云醫(yī)用膠公司）溶于 15 mL丙酮，Dextran-70（1%，w/v）（Sigma-Aldrich，Inc.St.Louis，Missouri，USA）及125 mg苯妥英鈉溶于15 mL超純水，將有機相緩慢滴加入水相，800 rpm攪拌3 h，減壓蒸餾去除丙酮，添加1%普朗尼克P85[12]，0.45 μm膜過濾后4℃保存。

1.4.2物理性征檢測 利用投射電鏡、粒度儀（英國馬爾文）、zeta電位儀檢測納米粒的粒徑、粒徑分布及zeta電位。

1.4.3載藥量和包封率的測定 采用SephadexG75凝膠柱純化苯妥英鈉納米粒，HPLC測定苯妥英鈉濃度。計算載藥量和包封率。

1.4.4納米粒的體外釋放 苯妥英鈉納米粒0.5 mL于透析袋中 （截留分子量7000），40 mL生理鹽水為釋放介質，置于37℃恒溫搖床中70 rpm旋轉，于15 min、30 min、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、8 h、12 h、36 h、48 h取樣 1 mL，HPLC測定苯妥英鈉濃度，計算各時間點累積釋放度。

1.5 苯妥英鈉納米粒在MTLE模型鼠上的應用

1.5.1微透析探針局部立體定位[12]13只MTLE模型鼠頸靜脈置管后固定在立體定位儀上。坐標位置為：前囟后5.2 mm，左側5.0 mm，探針置入前囟下7.5 mm。

1.5.2微透析步驟 微透析探針 （CMA/12，3-mm polycarbonate membrane，cut off 20 kD，Carnegie Medicine，Sweden）置入后穩(wěn)定2 h，普通苯妥英鈉組（n＝7）及苯妥英鈉納米粒組（n＝6）分別一次性靜脈予苯妥英鈉及苯妥英鈉納米粒 （35 mg/kg）。于 30 min、60 min、120 min、180 min、240 min和300 min取全血300 μL，12000 rpm離心4 min取上清，-20℃保存。同時收集0～30 min、30～60 min、60～120 min、120～180 min、180～240 min和 240～300 min的微透析液，-20℃保存。微透析實驗后取腦做切片驗證探針針道位置。

1.5.3HPLC檢測苯妥英鈉濃度[12]取待測樣品90μL，加入內標卡馬西平標準工作液10 μL，乙酸乙酯萃取。真空干燥箱揮干后流動相復溶。HPLC色譜柱為Waters XTerra MS C18 column（5 μm，4.6×150 mm，Waters，Milford，USA），流動相為10 mmol/L磷酸鹽緩沖液/乙腈 （65/35，V/V，pH 5.0），流速1.0 mL/min，檢測波長UV 205 nm，進樣體積10 μL，分析時間7 min。

1.6 統(tǒng)計學方法采用 SPSS 20.0 （SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）進行統(tǒng)計學分析。數(shù)據(jù)資料以（±s）表示，比較采用t檢驗 （或Wilcoxon秩和檢驗）。檢驗水準α＝0.05，雙側檢驗。

2 結果

2.1 鋰-匹羅卡品誘導的MTLE大鼠模型的構建

2.1.1MTLE大鼠模型構建 鋰-匹羅卡品化學誘導大鼠急性期出現(xiàn)持續(xù)狀態(tài)的成功率為93.75%（30/32），大鼠持續(xù)狀態(tài)死亡率為10.0%（3/30）。MTLE建模成功率為48.14%（13/27）。

2.1.2免疫組化檢測腦中Pgp表達 模型鼠在海馬CA1、CA3及DG區(qū)上Pgp的表達較正常大鼠增高（圖1）。

2.2 苯妥英鈉納米粒的物理特性

圖1 海馬CA1，CA3及DG區(qū)中Pgp的表達情況（高倍鏡400×）棕褐色著色顆粒為Pgp的表達水平。A、B、C分別為正常大鼠海馬CA1、CA3、DG區(qū)，D、E、F分別為MTLE模型鼠海馬CA1、CA3、DG區(qū)

2.2.1苯妥英鈉納米粒的性征 電鏡下，納米藥物為200 nm左右的圓形粒子，大小均一，分散均勻。粒徑為（268.00±2.54）nm，分散系數(shù)為0.19±0.01。zeta電位為（-36.60±0.45）mv。包封率為96.63%± 5.53%。載藥量為22.00%±3.95%。

2.2.2苯妥英鈉納米粒的體外緩釋能力 本研究制備的苯妥英鈉納米粒在1 h內具有突釋現(xiàn)象，之后開始緩慢釋放，經60 h累積釋放度超過80%，具有緩釋效果。

2.3 苯妥英鈉納米粒應用于MTLE模型鼠的藥代動力學結果

2.3.1腦微透析液中藥物濃度 （如圖2）兩組模型鼠于一次給藥后60 min普通苯妥英鈉組腦微透析液中藥物濃度為最高，之后逐漸下降。而苯妥英鈉納米粒組腦微透析液中藥物濃度于120 min時為最高，之后逐漸下降，并且下降較前者稍迅速。兩組在每個時間點，其腦微透析液中藥物濃度差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），即苯妥英鈉納米粒組顯著高于普通苯妥英鈉組 （30 min：4.97±0.94與2.14±0.16；60 min：5.14±0.95與2.93±0.58；120 min：5.32±1.42與 2.52±0.71；180 min：4.48±1.00與2.19±0.74；240 min：3.36±1.06與 1.90±0.71；300 min：3.20±0.49與1.83±0.65）。

圖2 兩組模型鼠腦微透析液藥物濃度比較

2.3.2血漿中藥物濃度 如圖3，兩組模型鼠于一次給藥后30 min均為最高，之后逐漸下降，而苯妥英鈉納米粒組藥物濃度下降速度較快。兩組在60 min、120 min、180 min、240 min及300 min其外周血中藥物濃度差異均無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05）（60 min：19.15±5.07 與 14.67±2.54；120 min：12.71±3.51與 12.46±3.22；180 min：9.12±2.86與 9.50±3.26；240 min：6.46±2.53與 9.50±3.26；300 min：4.96±2.57與 8.60±3.04），而在 30 min，苯妥英鈉納米粒組藥物濃度高于普通苯妥英鈉組，具有統(tǒng)計學差異 （P＜0.05）（30 min：21.51±1.55與18.82±2.00）。

圖3 兩組模型鼠血漿藥物濃度比較

2.3.3腦中藥物分布 如圖4，兩組模型鼠的腦/血漿的時間藥物濃度曲線的AUC比值之間差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），即藥物在腦中的分布情況為苯妥英鈉納米粒組顯著高于普通苯妥英鈉組）（0.37±0.10與0.1±0.06）。

圖4 海馬組織ECF/血漿的時間藥物濃度曲線的曲線下面積比值的比較

3 討論

本研究證實在海馬錐體細胞層的神經元上可見免疫組化陽性染色表達，這種棕褐色陽性染色在MTLE模型鼠海馬的CA1、CA3、DG區(qū)更多，即Pgp蛋白表達增高。近來研究證實，在杏仁核電刺激點燃模型鼠中，特別是在苯妥英鈉耐藥模型鼠的杏仁核點燃同側腦組織，相對于苯妥英鈉藥物反應模型鼠，其腦組織中Pgp的表達存在著顯著性的差異，Pgp陽性..表達的標記區(qū)域也增高將近2倍[13]。除此之外，L?O SCHER等[5]提出杏仁核電點燃模型鼠中，苯巴比妥耐藥模型鼠的腦中Pgp表達水平也高于苯巴比妥反應組。這些研究結果均表明耐藥模型鼠腦中Pgp表達增高，給多藥轉運體與癲癇耐藥的假說提供了支持理論[13]。由此推測在MTLE模型中由于癇性發(fā)作誘導了Pgp過度表達，而Pgp的過度表達將使其作用即藥物主動外向轉運增強，使到達藥物作用靶點即致癇灶的藥物濃度下降，導致癲癇發(fā)作不能控制，最終耐藥性癲癇形成。

研究發(fā)現(xiàn)，P85修飾的氰基丙烯酸正丁酯合成的納米藥物能顯著地增加苯妥英鈉在腦組織中的分布，使腦/血的時間藥物濃度曲線下AUC的比增高至正常藥物的近兩倍水平。一次性靜脈給藥后，普通苯妥英鈉給藥的模型鼠的海馬組織ECF的藥物濃度于60 min時為最高，之后隨著時間下降，而給予苯妥英鈉納米粒的模型組的藥物濃度則于120 min時為最高，之后再隨著時間下降。而藥物濃度在達到最高值后，苯妥英鈉納米粒組的海馬組織ECF及血漿中的苯妥英鈉濃度的下降速度均快于普通苯妥英鈉給藥的模型組。在血漿中，從給藥后120 min開始，苯妥英鈉濃度逐漸明顯的低于普通苯妥英鈉組，但在相同時間點，苯妥英鈉納米粒組的海馬組織ECF的藥物濃度卻仍顯著地高于普通苯妥英鈉組的水平。由此可見，本課題構建的載藥納米粒具有較明顯的腦靶向作用。雖然結果中已經證明苯妥英鈉納米粒具有較好的體外緩釋效果，但是相比于傳統(tǒng)苯妥英鈉，在血循環(huán)中其藥物濃度下降更為迅速，可能與循環(huán)中單核吞噬細胞系統(tǒng)清除納米粒有關[14]，鑒于此，可以進一步優(yōu)化苯妥英鈉納米粒物理性征來減少其清除率。

納米載體介導藥物通過血腦屏障的機制目前尚未完全闡述清楚。近年來一些新的機制陸續(xù)被提出并證實[15]。據(jù)研究，經過聚山梨醇酯80修飾的聚氰基丙烯酸正丁酯載藥納米粒在進入外周血循環(huán)后吸附血液中的載脂蛋白ApoE和ApoB，而聚山梨醇酯80做為結合脂蛋白和納米粒的鏈接點[16]。其中，ApoE在低密度脂蛋白的腦轉運中有重要作用[17-19]。而普朗尼克P85是否起到與聚山梨醇酯80類似作用，使苯妥英鈉納米粒模仿低密度脂蛋白與腦中毛細血管內皮細胞相互作用，最終將藥物通過受體介導的細胞內吞方式而進入腦組織中。進一步的研究提出，通過抗生物素蛋白的方式將載脂蛋白ApoE與包裹人類血清蛋白的納米粒相連接，再包裹左旋多巴，能證明載脂蛋白ApoE在腦給藥轉運中具有呈劑量依賴性的作用。近來也有研究其它載脂蛋白ApoE3、B-100和A-I在腦靶向給藥系統(tǒng)中所起的作用[20-21]。但關于該研究中的聚氰基丙烯酸正丁酯包裹的苯妥英鈉納米粒的腦靶向的作用機制尚需進一步的研究證實，并且在本研究的基礎上將苯妥英鈉納米粒進一步優(yōu)化，為耐藥性癲癇尋找一個切實有效的治療方法。

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The study on the construction of Pluronic P85 coated poly(butylcyanoacrylate)nanoparticles and its braintarget effect on a rat model of mesial temporal lobe epilepsy.

FANG Ziyan，GUO Caifeng，WU Fengchun，QINJiaming，NING Yuping*，ZHOU Liemin.Department of Neurology，The Affiliated Brain Hospital of Guangzhou Medical University (Guangzhou Huiai Hospital)，36th Mingxin Road，Guangzhou，510370.Department of Neurology，The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University，58thZhongshan 2ndRoad，Guangzhou 510080,China.Tel:020-81268212

ObjectiveIn order to evaluate that whether Pluronic P85 coated poly(butylcyanoacrylate)nanoparticles was able to deliver antiepileptic drug phenytoin into the brain va bypassing mesial temporal lobe epilepsy(MTLE) -induced Pgp in a rat model of MTLE.MethodsThe rat model of MTLE,induced by li-pilocarpine,was divided into two groups(6 for nanoparticle drug group and 7 for PHT drug group).Immunohistochemistry assay was performed to detect Pgp expression at the hippocampus.Nanoparticles were prepared by interfacial polymerization method.Dialysate samples of brain were collected at 30,60,120,180,240 and 300 min after drug administration by microdialysis technology.Samples were analyzed by high performance liquid chromatography(HPLC).ResultsThe area under the curve (AUC)ratio of brain/plasma in Nanoparticle drug group was 0.37 0.10 which was significantly higher compared with0.19 0.06 in conventional PHT drug group (P＜0.05).The Pgp immunopositive area,as assessed by analysis of labeled surface area,was higher in the DG,CA3 and CA1 sector in the hippocampus of MTLE rats when compared to the normal rats.ConclusionsPluronic P85 coated PBCA nanoparticles can significantly deliver PHT into brain via bypassing MTLE-induced Pgp in a rat model of MTLE.

Nanoparticles Temporal lobe epilepsy P-glycoprotein Phenytoin Targeting

R742.1

A

2016-12-22）

（責任編輯：李立）

10.3969/j.issn.1002-0152.2017.06.008

☆國家自然科學基金面上項目（編號：81071050，81571333）；廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項目（編號：20171A011268，20161A011036）；廣州市科技計劃科技型中小企業(yè)創(chuàng)新-初創(chuàng)項目（編號：2017010160496）；廣州市腦科醫(yī)院廣州市醫(yī)學重點學科建設項目子項目（編號：GBH2014-QN03）

* 廣州醫(yī)科大學附屬腦科醫(yī)院（廣州市惠愛醫(yī)院）（廣州510370）

△中山大學附屬第一醫(yī)院（廣州510080）