任志華 王亞超 鄧俊良*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，成都611130；2.西南科技大學(xué)，綿陽(yáng)621010)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇與玉米赤霉烯酮聯(lián)合暴露對(duì)體外培養(yǎng)雞脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的影響

任志華1王亞超2鄧俊良1*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，成都611130；2.西南科技大學(xué)，綿陽(yáng)621010)

本試驗(yàn)旨在研究脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)與玉米赤霉烯酮與(ZEA)聯(lián)合暴露對(duì)體外培養(yǎng)雞脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的影響。分別以0.012 50 μg/mL DON+0.006 25 μg/mL ZEA、0.050 μg/mL DON+0.025 μg/mL ZEA、0.2 μg/mL DON+0.1 μg/mL ZEA、0.8 μg/mL DON+0.4 μg/mL ZEA對(duì)體外培養(yǎng)雞脾臟淋巴細(xì)胞進(jìn)行聯(lián)合暴露培養(yǎng)，48 h后測(cè)定細(xì)胞膜ATP酶(Ca2+-ATP酶、Na+/K+-ATP酶)活性以及細(xì)胞內(nèi)pH、Ca2+水平和鈣調(diào)蛋白(CaM)的mRNA表達(dá)水平。同時(shí)設(shè)不添加毒素的空白對(duì)照組。結(jié)果表明：添加毒素的各試驗(yàn)組間，細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平、CaMmRNA表達(dá)水平隨毒素濃度的升高而增加，且添加毒素的各試驗(yàn)組均顯著或極顯著高于空白對(duì)照組(P<0.05或P<0.01)。細(xì)胞內(nèi)pH以及細(xì)胞膜Ca2+-ATP酶與Na+/K+-ATP酶活性均隨毒素濃度的升高而降低，且添加毒素的各試驗(yàn)組均顯著或極顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05或P<0.01)。由此得出，DON、ZEA聯(lián)合暴露導(dǎo)致體外培養(yǎng)雞脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)酸化、離子平衡失調(diào)等一系列細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡，且呈劑量依賴性。

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇；玉米赤霉烯酮；聯(lián)合暴露；脾臟淋巴細(xì)胞；內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)

脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)和玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEA)是飼料中2種最常見的霉菌毒素。霉菌毒素不僅會(huì)使動(dòng)物生長(zhǎng)性能、繁殖性能下降，還會(huì)造成免疫抑制，引起疾病高發(fā)。細(xì)胞是生物體的基本單位，細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定是維持細(xì)胞正常功能的必要條件[1]。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境失調(diào)時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)糖類、脂類、蛋白質(zhì)三大物質(zhì)代謝紊亂，基因表達(dá)復(fù)制異常，蛋白質(zhì)合成異常，細(xì)胞結(jié)構(gòu)、功能異常[1]。脾臟是機(jī)體重要的免疫器官，體外培養(yǎng)雞脾臟淋巴細(xì)胞已成為重要的研究模型[2-3]。在前期的預(yù)試驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)DON與ZEA聯(lián)合暴露會(huì)導(dǎo)致體外培養(yǎng)雞淋巴細(xì)胞的凋亡(數(shù)據(jù)未列出)。在細(xì)胞凋亡過程中，多伴隨細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡，其中細(xì)胞內(nèi)氧化還原、酸堿度與離子濃度平衡狀態(tài)失調(diào)既是細(xì)胞凋亡的特征，又在一定程度上促進(jìn)細(xì)胞凋亡[4]。我們的前期研究表明單獨(dú)染毒DON[5]或ZEA[6]均可導(dǎo)致雞體外脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)環(huán)境失衡，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡，但兩者聯(lián)合暴露對(duì)體外培養(yǎng)雞脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)影響的研究報(bào)道較少。本研究以原代培養(yǎng)雞脾臟淋巴細(xì)胞為模型，重點(diǎn)研究DON與ZEA聯(lián)合暴露后細(xì)胞膜ATP酶(Ca2+-ATP酶、Na+/K+-ATP酶)活性及細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平、pH及鈣調(diào)蛋白(calmodulin，CaM)mRNA表達(dá)水平變化，為闡明DON與ZEA聯(lián)合暴露致細(xì)胞凋亡的機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

胎牛血清(FBS)(美國(guó)Gibco)，DON、ZEA及無(wú)酚紅的RPMI1640培養(yǎng)基(美國(guó)Sigma)，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)(日本Dojindo)，細(xì)胞內(nèi)pH熒光探針BCECF-AM染液(日本Dojindo)，細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光探針Fluo-3/AM染液(美國(guó)Molecular Probes)，活化Taq酶等PCR反應(yīng)試劑(日本TaKaRa)，Trizol試劑盒、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(美國(guó)Invitrogen)，溴化乙錠(EB)(美國(guó)Sigma)，聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)(美國(guó)Sigma)，三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl)緩沖液(美國(guó)Sigma)，細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(Lorry法)、細(xì)胞膜ATP酶(Ca2+-ATP酶與Na+/K+-ATP酶)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 試驗(yàn)方法

脾臟淋巴細(xì)胞懸液的制備：在無(wú)菌條件下，將由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供的40～60日齡健康的伊莎公雞的脾臟取出，放入盛有磷酸鹽緩沖液(PBS)的培養(yǎng)皿里，用PBS輕輕洗滌脾臟周圍的血液殘?jiān)屑?xì)剝?nèi)テ⑴K周圍的結(jié)締組織，將其移入另一個(gè)盛有PBS的浸泡有200目網(wǎng)篩的培養(yǎng)皿中，用鑷子將脾臟放在200目銅網(wǎng)上，用20 mL一次性注射器的內(nèi)芯輕輕研磨，過濾，將濾液適當(dāng)稀釋成一定濃度的細(xì)胞懸液，再將細(xì)胞懸液移入預(yù)先裝有雞淋巴分離液的離心管里，立即緩緩以1∶1體積比將細(xì)胞懸液移入到雞淋巴分離液上層，室溫下2 000 r/min離心15 min，用巴氏吸管移取淋巴細(xì)胞，加入冷的PBS洗滌，4 ℃下1 500 r/min離心5 min，棄去上清液，加入不含毒素的RPMI1640完全培養(yǎng)液(加胎牛血清)再洗滌1次，重懸，制備5×106細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液，并用臺(tái)盼藍(lán)檢測(cè)細(xì)胞活力大于95%即表明脾臟淋巴細(xì)胞懸液制備成功。

DON與ZEA聯(lián)合暴露濃度的確定：本試驗(yàn)應(yīng)用CCK-8法分別檢測(cè)了DON、ZEA對(duì)體外培養(yǎng)的雞脾臟淋巴細(xì)胞的活性的影響。染毒48 h時(shí)，DON的半數(shù)抑制濃度(IC50)為(30.82±10.48) μg/mL，ZEA的IC50為(23.91±4.96) μg/mL。通過IC50，篩選出DON、ZEA單獨(dú)的作用濃度，由于在前期預(yù)試驗(yàn)中DON、ZEA單獨(dú)染毒時(shí)高濃度組均造成脾臟淋巴細(xì)胞的嚴(yán)重?fù)p傷。因此，在正式試驗(yàn)中以DON、ZEA低濃度進(jìn)行聯(lián)合暴露，即確定聯(lián)合暴露劑量為0.012 50 μg/mL DON+0.006 25 μg/mL ZEA(DZ-1組)、0.050 μg/mL DON+0.025 μg/mL ZEA(DZ-2組)、0.2 μg/mL DON+0.1 μg/mL ZEA(DZ-3組)、0.8 μg/mL DON+0.4 μg/mL ZEA(DZ-4組)。同時(shí)設(shè)不添加毒素的空白對(duì)照組。

1.3 細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平測(cè)定

染毒培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，1 500 r/min離心3 min，后用PBS洗滌細(xì)胞3次。用PBS懸浮細(xì)胞，加入細(xì)胞內(nèi)鈣離子熒光探針Fluo-3/AM染液使其終濃度為1 μmol/L，混勻，37 ℃避光孵育30 min，PBS洗滌3次，在流式細(xì)胞儀上測(cè)定其平均熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm)。

1.4 細(xì)胞內(nèi)pH測(cè)定

染毒培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，1 500 r/min離心3 min，后用PBS洗滌細(xì)胞3次。在收集的細(xì)胞中加入不含胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，制備5×106細(xì)胞/mL的細(xì)胞懸液，加入細(xì)胞內(nèi)pH熒光探針BCECF/AM染液，使其終濃度為2 μmol/L；然后在CO2培養(yǎng)箱(避光，37 ℃)中孵育30 min。收集細(xì)胞，用不含胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液洗滌3次，再用PBS重懸細(xì)胞，在流式細(xì)胞儀上488 nm激發(fā)，相應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)pH根據(jù)其熒光強(qiáng)度大小顯示于一個(gè)二維點(diǎn)陣圖上(X軸525 nm，Y軸610 nm)上。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果，細(xì)胞內(nèi)pH即為綠/與紅熒光強(qiáng)度的比值，每個(gè)樣本至少選用10 000個(gè)細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[7]。

1.5 細(xì)胞膜Ca2+-ATP酶與Na+/K+-ATP酶活性測(cè)定

染毒培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，1 500 r/min離心3 min，后用PBS洗滌細(xì)胞3次。每個(gè)樣品中加入500 μL含0.1% TritonX-100的0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.4)后，進(jìn)行超聲裂解(4 ℃)。將裂解液1 000×g離心10 min，取其上清液進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，并用生理鹽水(無(wú)磷)適當(dāng)稀釋使其蛋白質(zhì)含量控制于3～5 mg/mL。取裂解上清液測(cè)定其細(xì)胞膜Na+/K+-ATP酶與Ca2+-ATP酶活性(定磷法)，詳細(xì)測(cè)定方法見試劑盒說(shuō)明書。

1.6 細(xì)胞內(nèi)CaMmRNA的測(cè)定

應(yīng)用Trizol法提取雞脾臟淋巴細(xì)胞總RNA，使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)GenBank中公布的雞的β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)(L08165)和CaM(NM205005)的全基因序列，應(yīng)用Prime 5.0軟件設(shè)計(jì)特異的上、下游引物，并經(jīng)GenBank Blast進(jìn)行同源性檢索后由Invitrogen公司(上海)合成。引物序列及參數(shù)見表1。按cDNA模板的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系進(jìn)行加樣(30 μL)：10 μL總RNA，1 μL M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，1 μL RNA酶抑制劑，4 μL dNTP，2 μL Oligo dT，4 μL DTT和8 μL 5×Buffer。按反轉(zhuǎn)錄程序進(jìn)行，具體如下：42 ℃，反應(yīng)30 min，99 ℃滅活5 min，5 ℃ 5 min。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物瞬時(shí)離心，保存在-20 ℃?zhèn)溆?。通過Bio-Rad CFX96熒光定量PCR儀對(duì)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR，反應(yīng)條件為：活化Taq酶 95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。

表1 CaM和β-actin基因的引物序列及參數(shù)

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用REST 2009軟件分析毒素處理樣品各目的基因mRNA表達(dá)水平的差異。

應(yīng)用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性F檢驗(yàn)及其相關(guān)性分析，各指標(biāo)的測(cè)定均重復(fù)3個(gè)不同批次的細(xì)胞，每批細(xì)胞每個(gè)組重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 DON、ZEA聯(lián)合暴露對(duì)體外培養(yǎng)雞脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的影響

由表2可知，DON、ZEA聯(lián)合暴露48 h后，雞脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平隨毒素濃度的升高而增加，各試驗(yàn)組均極顯著高于空白對(duì)照組(P<0.01)，除DZ-2與DZ-3組間沒有顯著差異(P>0.05)外，其余各試驗(yàn)組間差異顯著或極顯著(P<0.05或P<0.01)。由此表明，DON、ZEA聯(lián)合暴露可導(dǎo)致體外培養(yǎng)雞脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平隨毒素濃度的升高而增加，具有顯著的劑量依賴關(guān)系。

2.2 DON、ZEA聯(lián)合暴露對(duì)體外培養(yǎng)雞脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)pH的影響

由表2可知，DON、ZEA聯(lián)合暴露48 h后，雞

脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)pH隨毒素濃度的升高而逐漸降低，各試驗(yàn)組均顯著或極顯著低于空白對(duì)照組(P<0.05或P<0.01)，同時(shí)各試驗(yàn)組間差異顯著或極顯著(P<0.05或P<0.01)。由此表明，DON、ZEA聯(lián)合暴露可導(dǎo)致雞脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)pH隨毒素濃度的升高而降低，具有顯著的劑量依賴關(guān)系。

2.3 DON、ZEA聯(lián)合暴露對(duì)體外培養(yǎng)雞脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)CaMmRNA表達(dá)水平的影響

由表2可知，DON、ZEA聯(lián)合暴露48 h后，除DZ-1組雞脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)CaMmRNA表達(dá)水平較空白對(duì)照組稍有降低(P>0.05)外，其余試驗(yàn)組均較空白對(duì)照組顯著或極顯著降低(P<0.05或P<0.01)。各試驗(yàn)組間，雞脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)CaMmRNA表達(dá)水平隨著毒素濃度的升高而升高，除DZ-1與DZ-2組差異不顯著(P>0.05)外，其余各試驗(yàn)組間差異顯著或極顯著(P<0.05或P<0.01)。由此表明，DON、ZEA聯(lián)合暴露可導(dǎo)致體外培養(yǎng)雞脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)CaMmRNA表達(dá)水平隨毒素濃度的升高而增加(除DZ-1組低于空白對(duì)照組)，具有顯著的劑量依賴關(guān)系。

表2 DON、ZEA聯(lián)合暴露對(duì)體外培養(yǎng)雞脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平、pH及CaM mRNA表達(dá)水平的影響

同列數(shù)據(jù)上標(biāo)有不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)。下表同。

In the same column, values with different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01), and with different small letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and with the same small letter superscripts mean no significant difference (P>0.05). The same as below.

2.4 DON、ZEA聯(lián)合暴露對(duì)體外培養(yǎng)雞脾臟淋巴細(xì)胞膜ATP酶活性的影響

由表3可知，DON、ZEA聯(lián)合暴露48 h后，雞脾臟淋巴細(xì)胞膜Na+/K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性均隨毒素濃度的升高而逐漸降低，各試驗(yàn)組均極顯著低于空白對(duì)照組(P<0.01)，同時(shí)各試驗(yàn)組間除DZ-3與DZ-4組差異顯著(P<0.05)外，其余試驗(yàn)組間差異均極顯著(P<0.01)。由此表明，DON、ZEA聯(lián)合暴露可導(dǎo)致體外培養(yǎng)雞脾臟淋巴細(xì)胞膜ATP酶活性隨毒素濃度的升高而降低，具有顯著的劑量依賴關(guān)系。隨毒素濃度的升高，Ca2+-ATP酶活性下降比Na+/K+-ATP酶活性下降明顯，表明Ca2+-ATP酶對(duì)DON、ZEA更敏感。

表3 DON、ZEA聯(lián)合暴露對(duì)體外培養(yǎng)雞脾臟淋巴細(xì)胞膜ATP酶活性的影響

3 討 論

Tonshin等[8]研究表明，DON對(duì)小鼠肝臟線粒體內(nèi)進(jìn)行了氧化磷酸化，引起了線粒體的膜電位、H+、K+及其他離子水平的變化，線粒體腫脹，K+滲透性增強(qiáng)，Ca2+也流出，損害了線粒體膜的功能，造成鈣穩(wěn)態(tài)失衡。彭雙清等[9]的研究表明，DON對(duì)體外培養(yǎng)的人心肌細(xì)胞B、L、T三型Ca2+通道均有明顯的阻滯作用，減少三型Ca2+通道的開放概率，縮短開放時(shí)間，延長(zhǎng)關(guān)閉時(shí)間。上述研究結(jié)果說(shuō)明DON能夠?qū)е滦∈蟾渭?xì)胞及人心肌細(xì)胞內(nèi)的鈣穩(wěn)態(tài)失衡，干擾與Ca2+相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙。而細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。研究表明，細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載主要通過激活Ca2+/Mg2+依賴性核酸內(nèi)切酶和激活Ca2+/CaM依賴性相關(guān)酶活性而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10]。細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載與線粒體功能關(guān)系密切，一方面，線粒體作為細(xì)胞內(nèi)鈣存儲(chǔ)器而在細(xì)胞內(nèi)Ca2+內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定過程中發(fā)揮重要作用[11]，線粒體功能受損所引起的ATP水平降低直接介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平增加[12]；另一方面，細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載可以促進(jìn)線粒體氧化磷酸化解耦聯(lián)與線粒體通透性轉(zhuǎn)移孔的開放，這將導(dǎo)致氧化磷酸化作用的抑制、質(zhì)子動(dòng)力勢(shì)降低、線粒體腫脹、線粒體內(nèi)Ca2+釋放進(jìn)入胞漿而促進(jìn)細(xì)胞死亡[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，DON、ZEA聯(lián)合暴露導(dǎo)致體外培養(yǎng)雞脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，造成線粒體功能障礙，這可能是DON、ZEA導(dǎo)致雞脾臟淋巴細(xì)胞發(fā)生凋亡的一條重要機(jī)制，這與Busk等[14]應(yīng)用定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析ZEA對(duì)人的腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞株H295R的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)ZEA影響氧化磷酸化途徑和線粒體功能障礙的途徑相一致。

細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平是由多種因素所調(diào)控的，除線粒體對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的調(diào)控作用外，細(xì)胞膜Na+/K+-ATP酶與Ca2+-ATP酶在細(xì)胞內(nèi)Ca2+內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)過程中發(fā)揮重要作用，它們主要參與將胞漿內(nèi)游離Ca2+跨越細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外液過程，同時(shí)還參與其他離子轉(zhuǎn)運(yùn)及ATP合成；若二者活性降低，將導(dǎo)致胞漿內(nèi)Ca2+超載[15]，而CaM是真核細(xì)胞內(nèi)Ca2+的重要受體，通過傳遞Ca2+調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的各種信息。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+達(dá)到一定水平(>10 μmol/L)時(shí)，Ca2+便與CaM結(jié)合，使CaM活化，被活化的CaM再去激活Ca2+-ATP酶，使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)維持較低水平的鈣，行駛第二信使的功能[16]。本研究結(jié)果表明，不同劑量的DON、ZEA聯(lián)合暴露均可使雞脾臟淋巴細(xì)胞膜Na+/K+-ATP酶與Ca2+-ATP酶活性顯著或極顯著降低，這可能是細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載的原因之一。Na+/K+-ATP酶與Ca2+-ATP酶均為ATP依賴性酶，細(xì)胞內(nèi)充足的ATP對(duì)于維持二者的功能很必要，線粒體呼吸功能抑制而導(dǎo)致的細(xì)胞內(nèi)ATP水平降低將會(huì)導(dǎo)致Na+/K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性受到抑制[17]。本研究中2種ATP酶活性的降低可能是由于DON、ZEA對(duì)細(xì)胞膜的氧化損傷和對(duì)細(xì)胞內(nèi)能量代謝的干擾[18]。本試驗(yàn)中，各試驗(yàn)組體外培養(yǎng)雞脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)CaMmRNA表達(dá)水平顯著或極顯著高于空白對(duì)照組，說(shuō)明DON、ZEA可通過影響胞內(nèi)鈣池釋放Ca2+，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平升高，Ca2+便與CaM結(jié)合，使CaM活化，被活化的CaM再去激活Ca2+-ATP酶，使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)維持較低的Ca2+水平，而Ca2+-ATP酶活性降低，不能將進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的Ca2+及時(shí)排出，從而呈現(xiàn)胞內(nèi)Ca2+的超載，這可能是雞脾臟淋巴細(xì)胞發(fā)生凋亡的一條重要機(jī)制。

細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定是維持細(xì)胞正常功能的必要條件，細(xì)胞膜Ca2+-ATP酶，它分解1個(gè)ATP分子可將1～2個(gè)Ca2+跨膜轉(zhuǎn)移到胞外，同時(shí)以1∶2比例將H+轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)，使離子交換結(jié)果為電中性，質(zhì)膜兩側(cè)膜電位差不致影響Ca2+的轉(zhuǎn)運(yùn)，細(xì)胞膜特別是質(zhì)膜的Na+/Ca2+交換，已被認(rèn)為是鈣穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)過程中的一個(gè)重要組分，而酸堿平衡的調(diào)節(jié)則是內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的前提。細(xì)胞內(nèi)pH的調(diào)節(jié)是通過離子轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制以及胞漿強(qiáng)大的緩沖能力來(lái)完成的，這種離子轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制包括：Na+/H+對(duì)流、ATP驅(qū)動(dòng)的H+泵以及幾種碳酸氫鹽交換器，而Na+/H+對(duì)流在細(xì)胞調(diào)控pH中起主要作用[19]。細(xì)胞內(nèi)酸化程度與細(xì)胞凋亡發(fā)生率存在量效關(guān)系，研究表明，細(xì)胞內(nèi)pH變化直接參與線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而胞內(nèi)酸化可以促進(jìn)細(xì)胞色素c介導(dǎo)的半胱天冬酶的激活[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，DON、ZEA聯(lián)合暴露可引起體外培養(yǎng)雞脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)pH降低，因此，可以認(rèn)為DON、ZEA所致的線粒體膜功能受損是胞內(nèi)酸化的主要原因，而胞內(nèi)酸化又進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞凋亡。

4 結(jié) 論

DON、ZEA聯(lián)合暴露導(dǎo)致體外培養(yǎng)雞脾臟淋巴細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)失衡，主要包括細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載(上調(diào)細(xì)胞內(nèi)CaMmRNA表達(dá)、增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平)、胞內(nèi)酸化、細(xì)胞膜ATP酶(Na+/K+-ATP酶與Ca2+-ATP酶)活性降低。

致謝：

感謝東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院徐世文教授、李艷飛教授、李金龍教授、王偉老師、張志剛老師、張子威博士、蘇健碩士、張博碩士、關(guān)博碩士在試驗(yàn)期間給予的幫助。

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*Corresponding author, professor, E-mail: dengjl213@126.com

(責(zé)任編輯 菅景穎)

Effects of Combined Exposure to Deoxynivalenol and Zearalenone on Homeostasis of Chicken Splenic Lymphocytes CulturedinVitro

REN Zhihua1WANG Yachao2DENG Junliang1*

(1.CollegeofVeterinaryMedicine,SichuanAgriculturalUniversity,Chengdu611130,China; 2.SouthwestUniversityofScienceandTechnology,Mianyang621010,China)

The aim of this experiment was conducted to study the effects of combined exposure to deoxynivalenol (DON) and zearalenone (ZEA) on the homeostasis of chicken splenic lymphocytes culturedinvitro. The chicken splenic lymphocytes were culturedinvitrowith different doses of DON and ZEA in cultured fluid, and the combined exposure doses were DON 0.012 50 μg/mL and ZEA 0.006 25 μg/mL, DON 0.050 μg/mL and ZEA 0.025 μg/mL, DON 0.2 μg/mL and ZEA 0.1 μg/mL, DON 0.8 μg/mL and ZEA 0.4 μg/mL, individually. After cultured 48 hours, the activities of cellular membrane ATPases (Ca2+-ATPase and Na+/K+-ATPase), and the intracellular Ca2+level, pH and calmodulin (CaM) mRNA expression level in chicken splenic lymphocytes were determined. And the blank contrast group was set separately. The results showed as follows: the intracellular Ca2+level andCaMmRNA expression level in the treated groups were increased with the increase of toxin concentration, which were significantly or extremely significantly higher than those in the blank control group (P<0.05 orP<0.01). The intracellular pH and the activities of cellular membrane Ca2+-ATPase and Na+/K+-ATPase in the treated groups were decreased with the increase of toxin concentration, which were significantly or extremely significantly lower than those in the control group (P<0.05 orP<0.01). In conclusion, combined exposure to DON and ZEA can lead to a series of intracellular homeostasis, such as intracellular acidification and imbalance of ion homeostasis, which is dose dependent.[ChineseJournalofAnimalNutrition, 2017, 29(8)：2836-2842]

DON; ZEA; combined exposure; splenic lymphocyte; homeostasis

10.3969/j.issn.1006-267x.2017.08.028

2017-01-24

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31402269)

任志華(1982—)，女，河南開封人，副教授，博士，從事動(dòng)物中毒病研究。E-mail: zhihua_ren@126.com

*通信作者:鄧俊良，教授，博士生導(dǎo)師，E-mail: dengjl213@126.com

S859.87

A

1006-267X(2017)08-2836-07