林天寶，魏 佳，劉 巖，朱 燕，計(jì)東風(fēng)，呂志強(qiáng)

（浙江省農(nóng)科院 蠶桑所，浙江 杭州 310021）

中晚秋“強(qiáng)桑1號(hào)”葉片生理生化變化的研究

林天寶，魏 佳，劉 巖，朱 燕，計(jì)東風(fēng)，呂志強(qiáng)＊

（浙江省農(nóng)科院 蠶桑所，浙江 杭州 310021）

本研究以桑樹品種“強(qiáng)桑1號(hào)”的葉片為試驗(yàn)材料，針對(duì)其葉綠素、可溶性蛋白、脯氨酸（PRO）、丙二醛（MDA）含量以及抗氧化酶等生理生化指標(biāo)在中晚秋的變化，研究桑樹在自然降溫、桑葉逐漸老化過程中的生理特點(diǎn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，“強(qiáng)桑1號(hào)”桑葉逐漸老化的過程中，葉綠素、可溶性蛋白含量降低，SOD、POD、CAT活性下降，脯氨酸和丙二醛的含量上升，抗氧化酶系統(tǒng)在桑葉的衰老過程中發(fā)揮了重要作用。

強(qiáng)桑1號(hào)；葉片；生理生化

桑樹（Morus L.）是傳統(tǒng)蠶桑產(chǎn)業(yè)的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，桑樹新品種“強(qiáng)桑1號(hào)”具有秋季產(chǎn)葉量高、葉質(zhì)優(yōu)、秋葉硬化遲的特點(diǎn)，它的秋葉硬化要比農(nóng)桑14號(hào)晚20天左右［1］，這對(duì)提高晚秋蠶繭產(chǎn)質(zhì)量具有重要意義。目前，對(duì)桑樹葉片衰老的生理機(jī)制研究較少，本研究以“強(qiáng)桑1號(hào)”為材料，選取在其它植物葉片衰老中起重要作用的生理指標(biāo)如葉綠素、可溶性蛋白、脯氨酸（PRO）、丙二醛（MDA）含量以及抗氧化酶等，研究其在桑樹葉片衰老進(jìn)程中的變化情況，以期能找出與桑樹葉片衰老關(guān)聯(lián)性較強(qiáng)的一些指標(biāo)，為桑樹育種提供參考依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料取自浙江省農(nóng)科院蠶桑所內(nèi)資源圃中保存的桑樹品種“強(qiáng)桑1號(hào)”，6年生。每次試驗(yàn)取成熟葉第10片葉子（較嫩的上部葉）和第40片葉子（最大中部葉），“強(qiáng)桑1號(hào)”枝條共有80片葉子左右。

蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購于上海生工生物技術(shù)有限公司。脯氨酸（PRO）、丙二醛（MDA）、抗氧化酶CAT、POD和SOD活性檢測(cè)試劑盒購于南京建成生物技術(shù)有限公司。Infinite M200酶標(biāo)儀為瑞士TECAN公司產(chǎn)品。

1.2試驗(yàn)方法

2014年10月至11月，每隔15 d（10月5日，10月20日，11月5日，11月20日。）分別從5株桑樹上取成熟葉第10片葉和第40片葉。進(jìn)行葉綠素、游離脯氨酸（PRO）、可溶性蛋白質(zhì)、丙二醛含量、過氧化氫酶（CAT）以及過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性的測(cè)定。

1.2.1葉綠素測(cè)定

取待測(cè)葉片0.1 g，加入10 ml 96%乙醇，室溫放置于暗處48 h后，取出搖勻，用酶標(biāo)儀于665 nm和649 nm處測(cè)定樣品的吸光值。每個(gè)樣品設(shè)三個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)酶標(biāo)儀檢測(cè)時(shí)設(shè)置2個(gè)復(fù)孔，用下列公式計(jì)算葉綠素a（Ca）和葉綠素b（Cb）的含量，Ct為總含量。

1.2.2可溶性蛋白含量測(cè)定

葉片采摘后于液氮中研磨，取100 mg于離心管中，按照Bradford法蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海生工）說明書操作進(jìn)行檢測(cè)。每個(gè)樣品設(shè)三個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)酶標(biāo)儀檢測(cè)時(shí)設(shè)置2個(gè)復(fù)孔。

1.2.3PRO與MDA測(cè)定

葉片采摘后于液氮中速凍、研磨，取100 mg于離心管中，按照脯氨酸和丙二醛檢測(cè)試劑盒說明，用比色法檢測(cè)二者濃度。每個(gè)樣品設(shè)三個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)酶標(biāo)儀檢測(cè)時(shí)設(shè)置2個(gè)復(fù)孔。

1.2.4酶活性檢測(cè)

稱取1 g新鮮葉片，液氮研磨后加入9 ml生理鹽水，冰上混勻，2500轉(zhuǎn)離心10 min后取上清，分別檢測(cè)CAT、SOD和POD活性，檢測(cè)步驟分別參看南京建成CAT、SOD和POD檢測(cè)試劑盒說明書。每個(gè)樣品設(shè)三個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)酶標(biāo)儀檢測(cè)時(shí)設(shè)置2個(gè)復(fù)孔。

1.2.5數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 16.0軟件單因素方差分析并進(jìn)行多重比較；Excel計(jì)算回歸方程和繪圖分析。

2結(jié)果與分析

2.1中晚秋桑葉葉綠素含量的經(jīng)時(shí)變化

由圖1可知，從10月至11月，中部葉（第40片葉）與上部葉（第10片片）的葉綠素含量相對(duì)10月份分別下降了21.92%和25.05%，中部葉的葉綠素含量各月均高于上部葉的含量，中部葉葉綠素含量的平均值為3.287 mg/g，上部葉葉綠素含量的平均值為2.319 mg/g，二者相差0.968 mg/g，兩者之間差異極顯著（P＜0.01）。說明隨著溫度的降低，桑葉的老化，桑葉中葉綠素含量都呈逐月下降趨勢(shì)，且下降明顯。

圖1 中晚秋桑葉葉綠素含量變化（mg/g）Figure 1 Changes of chlorophyll content(mg/g)

2.2中晚秋桑葉可溶性蛋白含量的經(jīng)時(shí)變化

由圖2可知，桑葉上部葉中的蛋白含量要高于同期中部葉，隨著時(shí)間的推移，蛋白含量逐漸下降，上部葉中的蛋白含量下降明顯，由最初的4.12 mg/g降低到2.86 mg/g，降低了30.8%，而中部葉中的蛋白含量則降幅較低，由2.93 mg/g降低到2.66 mg/g，降低了9.3%。說明可溶性蛋白含量與桑樹葉片衰老呈負(fù)相關(guān)。

圖2 中晚秋桑葉可溶性蛋白含量變化（mg/g）Figure 2 Changes of soluble protein content(mg/g)

2.3中晚秋桑葉PRO含量的經(jīng)時(shí)變化

從圖3中可以看出，中部葉中的PRO含量要高于上部葉，隨著桑葉的老化，PRO含量急劇上升，中部葉由最初的627.95 μg/g上升到2057.58 μg/g，上部葉從551.68 μg/g上升到1828.08 μg/g，增幅都高達(dá)3倍以上，尤其是11月份，PRO含量增加越快。說明PRO含量與桑樹葉片衰老呈正相關(guān)，桑葉越是老化，PRO含量越高，且變化明顯。

圖3 中晚秋桑葉PRO含量變化（μg/g）Figure 3 Changes of PRO content(μg/g)

2.4中晚秋桑葉MDA含量的經(jīng)時(shí)變化

從圖4中可以看出，中部葉中的MDA含量要高于上部葉，隨著桑葉的老化，MDA含量上升，中部葉由最初的1.93 nmol/mgprot上升到2.64 nmol/mgprot，上升了36.8%，上部葉從1.57 nmol/mgprot上升到2.258 nmol/mgprot，上升了43.3%，尤其是越到后面，MDA的含量增加越快。說明MDA含量與桑樹葉片衰老呈正相關(guān)，桑葉越是老化，MDA含量越高。

圖4 中晚秋桑葉MDA含量變化（nmol/mgprot）Figure 4 changes of MDA content(mg/g)

2.5中晚秋桑葉CAT活力的經(jīng)時(shí)變化

從圖5中可以看出，中部葉中的CAT活力要高于上部葉，隨著桑葉的老化，CAT活力下降，中部葉由最初的22.77 U/mgprot下降到13.17 U/mgprot，下降了42.2%，上部葉從17.23 U/mgprot下降到12.24 U/mgprot，下降了29.0%，尤其是隨著桑葉的老化，CAT活力下降越快。說明CAT活力會(huì)隨著桑葉的老葉而降低。

圖5 中晚秋桑葉CAT活力變化（U/mgprot）Figure 5 Changes of CAT activity(U/mgprot)

2.6中晚秋桑葉POD活力的經(jīng)時(shí)變化

從圖6中可以看出，中部葉的POD活力由最初的879.65 U/mgprot下降到285.38 U/mgprot下降了67.6%，上部葉從729.24 U/mgpro下降到271.36 U/ mgprot，下降了62.8%，中部葉中的POD活力要高于上部葉。說明隨著桑葉的老化，POD活力逐漸下降。

圖6 中晚秋桑葉POD活力變化（U/mgprot）Figure 6 Changes of POD activity(U/mgprot)

2.7中晚秋桑葉SOD活力的經(jīng)時(shí)變化

從圖7中可以看出，中部葉的SOD活力由最初的8.51 U/mgprot下降到4.60 U/mgprot，下降了46.0%，上部葉從7.68 U/mgpro下降到2.51 U/mgprot，下降了67.4%，說明中部葉中的SOD活力要高于上部葉，而且隨著桑葉的老化，SOD活力下降明顯。

圖7 中晚秋桑葉SOD活力變化（U/mgprot）Figure 7 Changes of SOD activity(U/mgprot)

3討論

桑葉在硬化過程中，生理生化代謝均會(huì)發(fā)生變化，本實(shí)驗(yàn)以桑樹品種“強(qiáng)桑1號(hào)”在中晚秋不同部位、不同時(shí)期的葉片為研究材料，研究在桑葉硬化過程中生理指標(biāo)的變化動(dòng)態(tài)，結(jié)果表明，桑葉中葉綠素含量呈下降趨勢(shì)，且下降明顯。許多研究表明，葉片衰老期間，葉綠體的大小數(shù)目均減少［2］，葉綠素含量和衰老之間存在明顯的負(fù)相關(guān)［3］，這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

蛋白質(zhì)降解是葉片衰老的基本特征［4］，強(qiáng)桑1號(hào)上部葉中的蛋白含量要高于同期中部葉，隨著時(shí)間的推移，上部葉與中部葉中蛋白含量都逐漸下降，上部葉中的蛋白含量下降明顯，這可能是植物在衰老過程中，各種蛋白質(zhì)水解反應(yīng)顯著增加，蛋白質(zhì)水解酶的數(shù)量和活性增加［5，6］。

植物生育后期體內(nèi)許多需氧代謝過程產(chǎn)生的活性氧增加，活性氧清除劑減少，使活性氧不能被及時(shí)清除，造成對(duì)細(xì)胞及組織的損害，是導(dǎo)致葉片衰老加速的重要原因［7，8］，因此，很多研究都將SOD、POD、CAT的含量作為研究衰老的指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中，中部葉中的SOD、POD、CAT活性都比上部葉中的高，且都隨著時(shí)間的推移而降低，SOD、POD的降幅均較大，說明抗氧化酶系統(tǒng)在桑葉的衰老過程中發(fā)揮了重要作用。

MDA是一種強(qiáng)烈地與細(xì)胞內(nèi)其他成分發(fā)生氧化反應(yīng)的物質(zhì)，因而易引起對(duì)酶和膜的嚴(yán)重?fù)p傷，導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)完整性及生理功能的破壞［9］，是反映膜質(zhì)過氧化程度的重要指標(biāo)，在衰老的過程中不斷積累，其積累來自不飽和脂肪酸的降解［10］，本實(shí)驗(yàn)中中部葉中的MDA含量要要高于上部葉，隨著桑葉的老化，MDA含量上升，越到后期，MDA的含量增加越快。

PRO是一種重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，當(dāng)植物處于低溫、干旱及重金屬污染等逆境條件時(shí)，游離脯氨酸在植物體內(nèi)積累，而且積累的量與植物的耐脅迫能力正相關(guān)［11］，在本實(shí)驗(yàn)中，中部葉中的PRO含量要高于上部葉，隨著桑葉的老化，PRO含量急劇上升，增幅都高達(dá)3倍以上，尤其是越到后期，PRO的含量增加越快。

綜上所述，強(qiáng)桑1號(hào)葉片在自然降溫、桑葉逐漸老化的過程中，葉綠素、可溶性蛋白含量降低，PRO和MDA的含量上升，SOD、POD、CAT活性下降。其中PRO與POD、SOD的指標(biāo)變化非常顯著，可作為桑樹葉片衰老的重要判定指標(biāo)，為桑樹育種提供一定的參考依據(jù)。

［1］ 呂志強(qiáng)，計(jì)東風(fēng)，周勤，等.桑樹新品種強(qiáng)桑1號(hào)的選育［J］.蠶業(yè)科學(xué)，2011，37（1）：9-12.

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Study on the Changes of Physiological and Biochemical Indexes of‘Qiangsang 1’in Mid and Late Autumn

LIN Tian-bao,WEI Jia,LIU Yan,ZHU Yan,JI Dong-feng,LV Zhi-qiang＊
（Sericulture Research Institute,Zhejiang Academy of Agricultural Sciences,Hangzhou 310021,China）

In order to study the physiological characteristics changes of mulberry leaves during the natural cooling and aging,the leaves of mulberry variety‘Qiangsang 1’were used as experimental material,the physiological and biochemical indexes such as chlorophyll,soluble protein,proline,MDA and antioxidant enzyme were observed.The results show that the content of chlorophyll and soluble protein were decreased,the activity of antioxidant enzymes SOD, POD and CAT were also decreased,while the level of proline and MDA were increased in mulberry leaves during the natural cooling and aging.These results suggest that the antioxidant system plays an important role in the aging process of mulberry leaves.

Qiangsang 1;mulberry leaves;physiological and biochemical

S888.31

A

0258-4069［2017］01-014-04

浙江省農(nóng)業(yè)（畜禽）新品種選育重大科技專項(xiàng)（2016C02054）；浙江省蠶桑產(chǎn)業(yè)科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)（2011R50028）

林天寶（1982-），男，浙江平陽人，助理研究員，大學(xué)本科，主要從事桑樹遺傳育種研究。E-mail：kissumbra@126.com

呂志強(qiáng)，男，研究員。E-mail：13958131715@139.com