陳愛蘭，林峰丞，潘秀娣，何志裕，王慧勇，許玲玲，范婷婷

（1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣州510120；2廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科，廣州510120）

·實驗研究·

神經(jīng)肽Y受體亞型在壓力超負荷大鼠心肌中的動態(tài)表達△

陳愛蘭1，林峰丞1，潘秀娣1，何志裕1，王慧勇1，許玲玲1，范婷婷2

（1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣州510120；2廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科，廣州510120）

目的觀察神經(jīng)肽Y受體亞型Y1、Y2、Y5在壓力超負荷大鼠心肌中的動態(tài)表達變化。方法手術(shù)組采用腹主動脈部分縮窄法建立壓力超負荷的動物模型，對照組為假手術(shù)組，每組6只老鼠，每組再分2、7、14 d三個時間點動態(tài)觀察Wistar大鼠。無創(chuàng)鼠尾測血壓；測全心質(zhì)量/體質(zhì)量的比值；蘇木素伊紅（HE）染色測心肌細胞橫截面積；實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，QTPCR）法檢測Y1、Y2、Y5mRNA表達；采用蛋白印跡法檢測Y1、Y2、Y5受體蛋白含量。結(jié)果手術(shù)組術(shù)后2、7、14 d血壓進行性升高，與對照組各時間點比較，收縮壓顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；手術(shù)組全心質(zhì)量/體質(zhì)量的比值于術(shù)后14 d升高，心肌細胞橫截面積的變化與全心質(zhì)量/體質(zhì)量的比值一致。手術(shù)組心肌Y1、Y2及Y5mRNA和蛋白的表達一致，與各時間點對照組比較，術(shù)后2、7 d心肌Y1、Y2及Y5mRNA和蛋白的表達上調(diào)，至14 d下降。結(jié)論壓力超負荷模型建立成功，手術(shù)組術(shù)后2、7 d處于壓力超負荷早期階段，14 d進入壓力超負荷心肌肥大代償階段；神經(jīng)肽Y受體亞型Y1、Y2和Y5在壓力超負荷大鼠心肌中的表達呈動態(tài)過程，在早期上調(diào)，心肌肥大的代償期下降。

神經(jīng)肽Y受體亞型；壓力超負荷；心肌

神經(jīng)肽Y（neuropeptide Y，NPY）是心臟組織表達最豐富的肽類，NPY于1982年從豬腦中分離提純出來［1］。NPY的作用主要通過與其受體相結(jié)合而發(fā)揮，包括受體 Y1、Y2、Y4、Y5和 Y6，均屬于 G蛋白偶聯(lián)受體，Y4與心肌親和力低，關(guān)于其在心肌的研究比較少，Y6在人是沒有功能，在大鼠是缺失的，Y1、Y2、Y5是心臟主要的功能受體。在許多心血管疾病發(fā)病如原發(fā)性高血壓（高血壓）、心力衰竭、心肌肥大等，血漿NPY濃度常與疾病嚴重程度呈正相關(guān)［2］。但是NPY各受體亞型在不同的病理刺激下、或同一疾病的不同發(fā)展階段，變化特征均不同［3］。我們的前期研究表明，NPY可以促進心肌細胞肥大，但是3種NPY受體亞型在心肌肥大中的作用存在較大差異［4］，考慮到壓力超負荷大鼠心肌在不同時間段可以呈現(xiàn)不同的特征，因此，明確NPY各受體亞型在壓力超負荷心肌不同時期的變化情況，有重要的病理生理和臨床意義。目前，國內(nèi)、外沒有關(guān)于NPY受體亞型在壓力超負荷大鼠心肌動態(tài)表達的報道，本文將對此展開研究。

1材料和方法

1.1動物模型及分組

實驗動物和分組，無特定病原體（SPF）級Wistar雄性大鼠（南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供），體質(zhì)量100 g，飼養(yǎng)于廣州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。大鼠36只，隨機分6組，每組6只，假手術(shù)組、手術(shù)組每組再分2、7、14 d三個時間點。

1.2壓力超負荷模型的建立方法

采用課題組既往報道的腹主動脈部分縮窄法建立大鼠壓力超負荷模型［5］，假手術(shù)組同樣分離但是不結(jié)扎腹主動脈，術(shù)后經(jīng)腹腔注射青霉素100萬U/（kg·d），共3 d，預(yù)防感染。觀察動物的一般情況如精神狀態(tài)、進食、活動情況。

1.3主要的試劑和儀器

IE33彩色超聲檢測儀（Philips，荷蘭）、Power Lab ML125無創(chuàng)尾動脈血壓測定分析系統(tǒng)（壓尾器、脈搏傳感器、電子自動加壓泵、兩道生理記錄儀）（ADInstruments，澳大利亞生產(chǎn)）、Trizol（Invit rogen，美國）、ReverTra Ace? qPCR RT Kit試劑盒（TOYOBO，日本）、GoTaq?qPCR Master MixReal timePCR試劑盒（Promega，美國）、熒光實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative realtime polymerase chain reaction，QTPCR）儀（美國 7500型，美國）、紫外分光光度計（Enpendorf，美國）、NPY1R（Abnova，臺灣）、NPY2R（D42）（Bioworld，美國）、NPY5R（M264）（Bioworld，美國）、3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde3phosphate dehydrogenase，GAP?DH）（14C10）（Cell signaling，美國）、聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Millipore，美國）、Whatman濾紙（Milli pore，美國）、化學(xué)發(fā)光儀（Promega，美國）。

1.4血流動力學(xué)檢測

采用ML125型無創(chuàng)尾動脈血壓測定分析系統(tǒng)測定大鼠尾動脈收縮壓，每只動物血壓共測定3次，取其平均值。

1.5心臟標本的處理

血流動力學(xué)檢查后，處死大鼠，取出心臟，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗干凈，電子天平稱取全心重量（heart weight，HW），計算 HW（mg）/體質(zhì)量（body weight，BW）（g），同時將心肌組織凍存于液氮罐內(nèi)，用于后續(xù)實驗。

1.6引物設(shè)計與合成

Y1、Y2、Y5及βactin的mRNA序列通過mRNA庫（Gene Bank，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/fulltext.htlm）獲得，引物設(shè)計結(jié)合參考文獻和Premier 5.0設(shè)計。均由上海生工有限公司合成。引物合成后用純水溶解，使其濃度均為100 μmol/L，分裝后于70℃貯存?zhèn)溆?，使用的濃度?0 μmol/L。序列如表1。

1.7熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)法

檢測心肌組織 Y1、Y2、Y5及βactin的表達情況，取心肌組織塊，Trizol法提取總RNA。用RTkit逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以QTPCR kit熒光定量法檢測目的基因mRNA表達。每個樣品做2個復(fù)孔，并重復(fù)3次熒光定量PCR的檢測，結(jié)果取3次的平均值。經(jīng)熒光信號理論方程推導(dǎo)出mRNA表達量計算公式：相對含量=2－ΔΔCT。

表1 Y1、Y2、Y5及β-actin的引物序列

1.8Western blot檢測方法

取各組大鼠心肌100 mg提取蛋白，上十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE），并將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上；加入兔抗大鼠NPY1R、NPY2R（D42）、NPY5R（M264）多克隆抗體，4℃孵育過夜；二抗常溫下孵育2 h行二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色和定量分析，利用圖像分析軟件測定電泳條帶的光密度值，目的蛋白相對定量值＝目的蛋白條帶光密度值/GAPDH蛋白條帶光密度值。

1.9病理學(xué)觀察

心肌標本梯度乙醇脫水，進行石蠟包埋，石蠟包埋心肌標本切片，切片厚4 μm，進行蘇木精伊紅染色，光鏡下觀察心肌組織形態(tài)學(xué)改變。

1.10心肌細胞橫截面積測定

心臟蘇木精-伊紅染色切片于攝影顯微鏡下拍照（400倍），每個切片隨機選取100個橫切的心肌細胞（要求盡量呈圓形，中間有完整的細胞核），測量其橫截面積，取其平均值。采用圖像分析軟件IPP6.0處理。

1.11統(tǒng)計學(xué)分析

采用IBM SPSS 22.0軟件分析數(shù)據(jù)。計量數(shù)據(jù)以（）表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間的比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié) 果

2.1兩組大鼠不同時間點收縮壓比較

手術(shù)組大鼠術(shù)后2、7、14 d收縮壓與假手術(shù)組的相同時間點比較顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），詳見圖1。

圖1 兩組不同時間點收縮壓比較圖（n=6）

2.2兩組大鼠不同時間點心臟指數(shù)比較

手術(shù)組大鼠術(shù)后2、7 d的HW/BW與假手術(shù)組相同時間點比較有升高，但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.052）；手術(shù)組術(shù)后14 d的HW/BW與假手術(shù)組相同時間點比較顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖2。

圖2 兩組不同時間點HW/BW比較圖（n=6）

2.3兩組不同時間點心肌細胞橫截面積比較

各組心肌細胞核染色呈藍色，胞質(zhì)均勻粉紅色，手術(shù)組術(shù)后2、7、14 d大鼠心肌細胞橫截面積分別為（140.43±29.00）μm2、（163.23±55.47）μm2、（250.91±44.79）μm2（圖3b、d、f），假手術(shù)組分別為（135.51±27.92）μm2、（150.49±36.67）μm2、（179.78±27）μm2（圖3a、c、e）。與假手術(shù)組比較，手術(shù)組大鼠在2、7 d的橫截面積有增大，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；手術(shù)組大鼠14 d的心肌細胞橫截面積明顯增大，與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），說明心肌細胞已經(jīng)發(fā)生肥大。

2.4大鼠心肌神經(jīng)肽Y受體Y1、Y2、Y5mRNA表達量的變化

手術(shù)組大鼠術(shù)后2、7 d與假手術(shù)組相同時間點比較，Y1、Y2、Y5受體mRNA表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；然而，與假手術(shù)組比較，手術(shù)組大鼠術(shù)后 14 d的 Y1、Y2、Y5受體 mRNA 表達下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖46。

圖3 兩組不同時間點心肌細胞橫截面積病理圖片比較

圖4 兩組不同時間點Y1 mRNA相對表達量比較線圖（n=6）

圖5 兩組不同時間點Y2 mRNA相對表達量比較線圖（n=6）

2.5兩組不同時間點心肌神經(jīng)肽Y受體Y1、Y2、Y5蛋白表達含量比較

圖6 兩組不同時間點Y3 mRNA相對表達量比較線圖（n=6）

與假手術(shù)組相同時間點比較，手術(shù)組大鼠術(shù)后2 d的 Y1、Y2、Y5受體蛋白表達分別升高了2.82、1.53、3.26倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖7A、圖7B）；術(shù)后7 d的Y1、Y2、Y5受體蛋白表達分別升高了 2.73、1.31、2.31倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖8A、圖8B）；然而，術(shù)后14 d的Y1、Y2、Y5受體蛋白表達顯著下降，分別下降了45%，19%，51%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖9A、圖9B）。

3討論

高血壓是最常見的心血管疾病之一，可繼發(fā)心、腦、腎等重要器官的損害［6］。高血壓的發(fā)病過程中往往表現(xiàn)出神經(jīng)系統(tǒng)和內(nèi)分泌系統(tǒng)所構(gòu)成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)的功能紊亂，其間的信息聯(lián)系主要是通過神經(jīng)肽、內(nèi)分泌激素、細胞因子來完成的，它們的具體作用十分復(fù)雜［7］。NPY是心臟組織表達最豐富的肽類，已有大量證據(jù)證明NPY在高血壓、心肌肥大、心力衰竭的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用［89］，其相應(yīng)受體在高血壓致心肌病變中的內(nèi)在規(guī)律仍然不明確。

圖7 兩組術(shù)后2 d的Y1受體蛋白表達量比較（n=3；A：蛋白電泳圖；B：Y1蛋白相對表達量線圖）

圖8 兩組術(shù)后2 d的Y2受體蛋白表達量比較（n=3；A：蛋白電泳圖；B：Y1蛋白相對表達量線圖）

圖9 兩組術(shù)后2 d的Y3受體蛋白表達量比較（n=3；A：蛋白電泳圖；B：Y1蛋白相對表達量線圖）

本實驗結(jié)果表明，手術(shù)組術(shù)后血壓明顯升高，組織學(xué)HW/BW、心肌細胞蘇木素伊紅染色計算橫截面積結(jié)果表明2、7 d心肌未發(fā)生肥大，處于壓力超負荷早期階段，14 d心肌具有肥大的特征，已經(jīng)進入壓力超負荷心肌肥大代償階段，提示壓力超負荷模型建立成功，跟既往研究結(jié)果一致［5］。在不同的時期NPY受體亞型Y1、Y2和Y5的表達不同，呈動態(tài)過程，在早期階段各受體表達上調(diào)，而在心肌肥大代償期受體表達下降，提示NPY受體的高表達可能參與了壓力超負荷心肌肥大的形成，在心肌肥大形成以后，又由于某種負反饋機制的存在，使其表達量有下降。

有資料顯示交感神經(jīng)興奮時，NPY與去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）共同釋放到外周，釋放的NPY又可作用于突觸前神經(jīng)末梢Y2受體，調(diào)節(jié)NE的釋放，從而通過負反饋機制避免心臟活動調(diào)節(jié)過度［10］。腹主動脈結(jié)扎以后早期心肌組織中NPY受體升高是否與突然增加大量壓力負荷交感神經(jīng)緊張性升高有關(guān)，或是與突然增加大量壓力負荷心肌缺血缺氧有關(guān)，有待于進一步的研究。最近Sah等［11］研究表明NPY可以增加機體三磷酸腺苷（ATP）供應(yīng)，在急性應(yīng)激期有利于機體的康復(fù)。既往在容量負荷導(dǎo)致的充血性心力衰竭大鼠模型研究表明，血漿NPY濃度增高，心肌Y1受體表達明顯減少，而Y2受體在心臟和腎臟的表達均增加，且與心力衰竭和心肌肥厚的程度呈正比［3］。Allen等［12］的研究表明在假手術(shù)組大鼠，20周出現(xiàn)心肌肥大時，左心室心肌細胞Y1和Y2表達均顯著降低。董頎等［13］的研究表明，在壓力超負荷4周時誘導(dǎo)的心肌肥厚大鼠心肌中NPY受體各亞型表達量均顯著降低。

由此可見，NPY各受體在心肌的表達受到疾病病理生理狀態(tài)的影響，這或許是NPY調(diào)節(jié)生理機能的關(guān)鍵所在，即各受體亞型之間相互作用，以反饋的形式對靶器官進行精細調(diào)節(jié)。Kundu等［14］回顧系列研究提示壓力超負荷心肌糖代謝異常先于心肌肥大的發(fā)生；與本研究NPY受體亞型Y1、Y2和Y5在壓力超負荷大鼠心肌表達的趨勢相似，是否存在相關(guān)性有待進一步的研究。

腹主動脈縮窄導(dǎo)致的壓力超負荷大鼠心肌的NPY受體亞型Y1、Y2和Y5在早期階段表達上調(diào)，而在心肌肥大代償期表達下降，提示NPY受體亞型的高表達可能參與了壓力超負荷心肌肥大的形成，在心肌肥大形成以后，又由于某種負反饋機制的存在，使其表達量有下降，其原因可能是存在一種負反饋機制，作為心肌對壓力超負荷狀態(tài)的一種保護性適應(yīng)，這種假設(shè)還有待進一步研究證實。

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Dynamic expression of neuropeptide Y receptor subtypes in myocardium of pressure overload rats

CHEN Ailan1，LIN Feng-cheng1，PAN Xiu-di1，HE Zhiyu1，WANG Huiyong1，XU Ling-ling1，F(xiàn)AN Tingting2
（1.Department of Cardiology，The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510120，China；2Department of Laboratory Medicine，The First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical Uni versity，Guangzhou 510120，China）

ObjectivesTo investigate the dynamic changes of expression of neuropeptide Y（NPY）receptor subtypes Y1，Y2 and Y5 in myocardium of pressure overload rats.MethodsTotally 36 Wistar rats were randomly divided into 6 groups，6 rats in each group：2 days，7 days and 14 days groups，each period included sham group and operation group.Operation group was treated with abdominal aortic constriction（AAC）Noninvasive blood pressure was measured by tail artery at day 2，day 7 and day 14 respectivelyRatio of heart weight（HW，mg）/body weight（BW，g）was measuredThe parts of ventricles were fixed in formalin and microtome sections were stained with hematoxylin and eosin（H&E）Cross-sectional area of myocardial cells was measured by using IPP6.0Expressions of Y1，Y2and Y5mRNA in myocardium were detected by fluorescence quantitative real-time polymerase chain reaction（QTPCR）Protein expressions of Y1，Y2and Y5were detected by Western blotting.ResultsBlood pressure of operation group was measured 2 days，7 days and 14 days after operation，and systolic blood pressure significantly increased compared with sham group at each time pointRatio of HW/BW increased significantly at 14 days in operation group compared with sham groupChanges of myocardial cell crosssectional area were consistent with the ratio of HW/BW.Expressions of Y1，Y2and Y5mRNA and protein in the myocardium of operation group were consistent at day 2，day 7 and day 14Expressions of Y1，Y2，Y5mRNA and protein in myocardium were up-regulated at day 2 and day 7，but decreased at day 14 compared with sham rats at each time pointConclusionsPressure overload model was established successfully.In operation group，there was no hypertrophy myocardium at 2 and 7 days，the heart was in the early stage in pressure overload rats；the heart had the cardiac hypertrophy characteristics at day14，that indicates the hearts had entered the cardiac hypertrophy compensatory stage in pressure overload ratsExpression of NPY receptor subtypes Y1，Y2and Y5in the myocardium of pressure overload rats showed a dynamic process，that they upregulate in the early stage and downregulate in the compensatory period of cardiac hypertrophy.

neuropeptide Y receptor subtypes；pressure overload；myocardium

R33

A

10079688（2017）04046206

20170508）

10.3969/j.issn.1007-9688.2017.04.26

廣東省高等學(xué)校優(yōu)秀青年教師培養(yǎng)計劃資助項目（項目編號：YQ2015138）；廣東省自然科學(xué)基金（項目編號：2014A03 0310077）；廣州市科信局基金（項目編號：2014Y200085）。

陳愛蘭（1980-），女，副主任醫(yī)師，研究方向為心力衰竭、高血壓的臨床防治和機制。