李廷芳，吳淑華，季英華，趙文浩，周益軍，郭青云

(1.青海大學農(nóng)牧學院，青海西寧 810016； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所/江蘇省食品質(zhì)量安全重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培養(yǎng)基地，江蘇南京 210014； 3.青海省農(nóng)林科學院/農(nóng)業(yè)部西寧作物有害生物科學觀測實驗站/青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點實驗室，青海西寧 810016)

?

青海BYDV-GAV青稞分離物基因組克隆及結(jié)構(gòu)特征分析

李廷芳1,2,3，吳淑華2，季英華2，趙文浩2，周益軍2，郭青云1,3

(1.青海大學農(nóng)牧學院，青海西寧 810016； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院植物保護研究所/江蘇省食品質(zhì)量安全重點實驗室-省部共建國家重點實驗室培養(yǎng)基地，江蘇南京 210014； 3.青海省農(nóng)林科學院/農(nóng)業(yè)部西寧作物有害生物科學觀測實驗站/青海省農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理重點實驗室，青海西寧 810016)

大麥黃矮病毒(Barley yellow dwarf viruses，BYDVs)病是一種在世界范圍內(nèi)發(fā)生危害的禾谷類作物病毒病害。2014年筆者在對青海重要作物病毒病調(diào)查時發(fā)現(xiàn)田間青稞作物上有疑似BYDVs危害的癥狀，利用BYDVs引物對田間采集的9份典型癥狀病樣進行了RT-PCR檢測，結(jié)果均擴增到目的條帶(約300 bp)，隨機抽選樣品進行序列測定，BLAST分析結(jié)果顯示其與BYDV-GAV同源性最為接近(99.2%)。為進一步明確該分離物的分類地位及基因組結(jié)構(gòu)特征，根據(jù)已測定的BYDV-GAV序列設計全長擴增引物，利用分段法克隆了其全基因組序列，發(fā)現(xiàn)其全長為5 683 bp，具有典型的黃癥病毒屬的特征，編碼6個ORF，有4個非編碼區(qū)(UTR)?；蚪M序列聚類進化分析結(jié)果顯示，其與BYDV-GAV聚類于同一分支，與中國陜西渭南小麥分離物親緣關系較近。以上結(jié)果說明，該分離物是BYDV-GAV的一個分離物，這是青海BYDV-GAV青稞分離物全基因組的首次報道。

大麥黃矮病毒；青稞；BYDV-GAV；青海

大麥黃矮病毒(Barley yellow dwarf viruses，BYDVs)是一種在世界范圍內(nèi)發(fā)生危害的植物病毒，主要由蚜蟲以持久非增殖方式傳播，可侵染小麥、大麥、燕麥、玉米等150多種禾本科植物，伴隨葉片黃化和植株矮縮等發(fā)病癥狀，影響作物的產(chǎn)量和品質(zhì)[1-3]。由BYDVs危害麥類作物引起黃矮病早在1951年于美國加州被報道過，而在我國于20世紀60年代在陜西、甘肅小麥上才開始出現(xiàn)該病危害，后陸續(xù)擴散蔓延，目前已成為北方麥類作物上的流行性病害，受害小麥常減產(chǎn)40%左右[4-5]。根據(jù)病毒血清學、基因組結(jié)構(gòu)及傳播介體的?；缘忍卣鳎珺YDVs分為BYDV-PAV、-MAV、-PAS、-GAV、-RPV、-GPV、-RMV、-SGV等種[6-7]，分類上它們都屬于黃癥病毒科的成員，其中BYDV-PAV、-MAV和-PAS屬于黃癥病毒屬(Luteovirus)的確定種，BYDV-GAV屬黃癥病毒屬暫定種，BYDV-RPV(新名稱Cereal yellow dwarf virus-RPV，CYDV-RPV)屬于馬鈴薯卷葉病毒屬(Polerovirus)的確定種，BYDV-GPV、-RMV和-SGV屬黃癥病毒科成員，暫時未列入任何屬[8]。目前，我國報道的有4種，分別為BYDV-GAV、-GPV、-PAV和-RMV[9-11]。其中，BYDV-GPV在血清學上與其他病毒不相關[11-12]，是我國特有種[9, 13-14]，主要由禾谷縊管蚜(Rhopalosiphumpadi)和麥二叉蚜(Schizaphisgraminum)以持久非增殖方式傳播[15]。BYDV-GAV主要由麥二叉蚜(S.graminum)和麥長管蚜(Sitobionavenae)傳播[16]，與BYDV-MAV血清學相關[10]。

青稞是禾本科大麥屬的一種裸大麥(HordeumvulgareL.var.nudumHook-.F.)，在青海、甘肅、四川、西藏、云南等高原地區(qū)有廣泛種植，青海種植面積已達到39.3×103hm2，是當?shù)刂匾Z食作物之一[17-19]。近年來，黃矮病在青稞上的危害在各種植區(qū)屢有報道，造成青稞產(chǎn)量減少，局部地區(qū)甚至有絕收的報道[18]。但我國針對青稞黃矮病的研究還相對較少，目前尚未有針對該類病毒的全基因組序列相關報道。我國BYDVs的種類較多，開展此類工作有利于明確病毒種類、指導生產(chǎn)防控。筆者對2014年在青海地區(qū)青稞作物上采集的9份典型病樣利用BYDVs引物進行了RT-PCR檢測，經(jīng) BLAST分析結(jié)果顯示其與BYDV-GAV同源性最為接近(99.2%)。為進一步明確該分離物的基因組結(jié)構(gòu)特征及分類地位，利用分段法克隆其全基因組序列后對序列結(jié)構(gòu)特征及系統(tǒng)進化關系進行了分析。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣 品

2014年6月采集青海省海東市田間表現(xiàn)為葉片黃化、植株輕微矮縮的發(fā)病青稞葉片，于-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 化學試劑

Trizol Reagent購自北京康為世紀生物技術有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimerScriptTMRT Master Mix和DNA LATaq酶購自大連寶生物公司；其他常用化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 樣品總RNA的提取

取典型癥狀樣品0.1 g，采用Trizol法提取總RNA。將RNA溶于35 μL 0.1%DEPC水中，檢測RNA的含量和質(zhì)量后，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 BYDVs的RT-PCR檢測

樣品RNA反轉(zhuǎn)錄采用PrimeScriptTMRT Master Mix反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TakaRa)進行，反應體系：5×PrimeScriptTMRT Master Mix buffer 2 μL，500 ng樣品RNA，最終DEPC水定容10 μL。反應條件：37 ℃反應15 min，85 ℃ 5 s終止反應。以合成的cDNA為模板，進行PCR檢測，引物(PAVL1/PAVR1)及反應體系參照Deb等[20]。擴增結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物，采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，培清JS-680D全自動凝膠成像系統(tǒng)記錄結(jié)果，編號為14Qh1-1和14Qh8-1的陽性樣品送金斯瑞生物技術有限公司進行序列測定。

1.2.3 BYDVs青海分離物基因組的克隆

根據(jù)1.2.2中BYDVs檢測結(jié)果及相應的序列分析結(jié)果設計BYDVs青海分離物的全基因組擴增引物，利用分段克隆法擴增其全基因組，其中BYD-1sbF(5′-GGCCTGCAGGTAGTGAAG ATTGACCATCTCACAAAAG-3′)與BYD-1R(5′-GCGGTTATTTCTACGGCCTACT-3′)組合(退火溫度54 ℃)擴增第一個片段14Qh8-1F(2 888 bp)，BYD-2bsF(5′-GGTGTACATTAG CTCTCTCCTACTTYAT-3′)與BYD-2xmR(5′-CCCCCGGGGGGTTGCCGAACTGCTCTTT-3′)組合(退火溫度55 ℃)擴增第二個片段14Qh8-1R(2 892 bp)。PCR反應體系：PrimeSTAR Max 12.5 μL，cDNA 1 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1.5 μL，最終DEPC水定容至25 μL。反應程序：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性45 s，54/55 ℃退火45 s，72 ℃ 延伸3.5 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴增結(jié)束后，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，由Axygen DNA凝膠回收試劑盒分離純化，回收產(chǎn)物連接PMD18-T載體，熱擊法轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans10，挑選陽性克隆，送金斯瑞生物技術有限公司進行序列測定。

1.2.4 序列分析

測序結(jié)果BLAST分析由NCBI網(wǎng)站上的BLAST程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/Blast.cgi)完成，序列拼接及同源性分析分別由DNASTAR軟件的Seqman、MegAlign完成，序列多重比對、聚類分析及進化樹構(gòu)建采用MEGA 6.0軟件的臨近法(Neighbor-Joining)完成，進化樹的可信度使用1 000次自導復制驗證[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間病株癥狀

田間發(fā)病青稞植株葉尖多表現(xiàn)明顯的黃化，有些甚至出現(xiàn)紅化(圖1)，早期侵染的植株會伴有矮化癥狀，影響青稞抽穗，對產(chǎn)量影響較大。在調(diào)查過程中還發(fā)現(xiàn)，雖然田塊間發(fā)病程度存在差異，但各調(diào)查田塊中均有植株發(fā)病，矮化癥狀也零星見到，暗示該病害在當?shù)厍囡弦殉食０l(fā)態(tài)勢。

圖1 青海省海東市受BYDVs侵染的青稞病株癥狀Fig.1 Symptom of the hulless barley infected by BYDVs in Haidong, Qinghai province

2.2 病樣的RT-PCR檢測結(jié)果

參照Deb等[20]的方法對田間采集的9份典型癥狀樣品中的BYDVs進行了RT-PCR分子檢測，結(jié)果(圖2)顯示，BYDV-PAV引物擴增到了約300 bp的目的片段，與預期目的條帶大小符合。為了進一步明確檢測到的BYDVs種類，隨機抽選樣品(14Qh1-1和14Qh8-1)進行序列測定，序列BLAST分析結(jié)果顯示，它們與BYDV-GAV(EU402390)的同源性最高，相似性達99.2%。

M:核酸分子量標準 DL4500;14Qh1-1至14Qh1-9為9份感病青稞樣品; CK為健康青稞樣品；箭頭所指為目的片段。下同。
M: DNA marker DL4500; 14Qh1-1-14Qh1-9 indicated nine samples of infected hulless barley; CK indicated samples of healthy hulless barley;The target fragments is pointed with an arrow;The same in Fig.3.
圖2 引物PAVL1/PAVR1的PCR擴增結(jié)果
Fig.2 Results of PCR amplified with primers PAVL1/PAVR1

2.3 全基因組序列克隆結(jié)果

以典型樣品14Qh8-1總RNA為模板，利用分段的兩對引物BYD-1sbF/BYD-1R和BYD-2bsF/BYD-2xmR進行RT-PCR，分別擴增到兩條大小約2.8 kb的特異性目的片段(圖3)。片段回收純化后連接pMD18-T載體，PCR法篩選陽性克隆，送測序公司測定序列。

14Qh8-1-F和14Qh8-1-R: 用引物BYD-1sbF/BYD-1R和BYD-2bsF/BYD-2xmR擴增出的片段。
14Qh8-1-F and 14Qh8-1-R indicated the target fragments amplified with BYD-1sbF/BYD-1R and BYD-2bsF/BYD-2xmR, respectively.
圖3 引物BYD-1sbF/BYD-1R和BYD-2bsF/BYD-2xmR的PCR擴增結(jié)果
Fig.3 Results of PCR amplified with primers BYD-1sbF/BYD-1R and BYD-2bsF/BYD-2xmR

2.4 基因組結(jié)構(gòu)分析

利用Seqman軟件將2.3測定的序列進行拼接，獲得14Qh8-1的全基因組序列。序列分析結(jié)果顯示，14Qh8-1的基因組全長為5 683 bp，編碼6個ORF，ORF1(140～1 159 bp)編碼一個含339個氨基酸、分子量約39 kDa的蛋白P1；ORF2與ORF1會通讀(140～2 742 bp)，編碼一個含867個氨基酸、分子量約99 kDa的融合蛋白P1-P2，是病毒復制酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRp)；ORF3(2 856～3 455 bp)編碼一個含199個氨基酸、分子量約22 kDa的蛋白P3，是病毒的外殼蛋白(Coat protein，CP)；ORF3內(nèi)部含有一個較小的閱讀框ORF4(2 893～3 357 bp)，編碼一個含154個氨基酸、分子量約17 kDa的蛋白P4，是病毒的運動蛋白(Movement protein，MP)；ORF3、ORF4、ORF5(2 856～4 832 bp)會以通讀的方式編碼一個含659個氨基酸、分子量約72 kDa的蛋白P3-P5，是病毒的蚜傳相關蛋白(Aphid transmission protein)；ORF6(1 939～5 070 bp)編碼一個含43個氨基酸、分子量約4.3 kDa的蛋白P6。除6個ORF外，14Qh8-1還含有4個非編碼區(qū)(Untranslated regions)，其中3′和5′末端各一個，一個位于RdRp與CP之間，另一個位于蚜傳蛋白與P6之間。

2.5 同源性及聚類進化分析

對14Qh8-1進行BLAST分析可知，其與BYDV-GAV的同源性最高(98.9%)。將14Qh8-1與已報道的黃癥病毒屬相關病毒及其分離物(結(jié)合黃癥病毒屬分類標準[8])及BYDVs在我國的發(fā)生種類進行同源性分析，結(jié)果表明，14Qh8-1與中國報道的BYDV-GAV同源性最高(97.0%～98.9%)。將14Qh8-1與黃癥病毒屬的成員聚類進行系統(tǒng)進化分析，結(jié)果也顯示，14Qh8-1聚類到BYDV-GAV分支中(圖4)。說明14Qh8-1是BYDV-GAV的一個分離物。

在系統(tǒng)進化關系上，BYDV-GAV分離物聚類到3個簇(圖4)：陜西渭南分離物(05WN2、05WN3、05WN5)、陜西咸陽楊凌分離物(05YL6)、陜西寶雞扶風分離物(FF1)及38W、30W等分離物聚類于一個簇(Cluster I)；陜西咸陽楊凌分離物(YL4)單獨形成第二個簇(Cluster II)；陜西寶雞鳳翔分離物(04FX1)、陜西渭南分離物(05WN7、WN5)、陜西安康分離物(AK2)、甘肅天水分離物(TS1)聚類于第三個簇(Cluster III)。其中，14Qh8-1聚類于第一個簇(Cluster I)，與陜西渭南分離物(05WN5、05WN2、05WN3)分離物的同源性較近，與其他分離物的同源性相對較遠。

3 討 論

大麥黃矮病毒是危害麥類作物的一類重要病毒病，目前我國報道的有四種[9]，其中，BYDV-GAV是根據(jù)Rochow[22]系統(tǒng)命名的一個中國分離物，分類上屬于黃癥病毒屬的暫定種。近年來的調(diào)查結(jié)果顯示，該病毒在我國很多地方上升為當?shù)卮篼滭S矮病毒的優(yōu)勢種群[11]。本文對青海分離的一個青稞分離物14Qh8-1全基因組序列進行了克隆測序，發(fā)現(xiàn)其為BYDV-GAV的一個分離物。參照Deb等[20]的方法對樣品進行分子檢測時，采用的引物包括PAVL1/PAVR1(檢測BYDV-PAV)、MAVL1/MAVR1(檢測BYDV-MAV)、SGVL2/SGVR2(檢測BYDV-SGV)、RMVL1/RMVR2(檢測BYDV-RMV)和RPVL/RPVR(檢測CYDV-RPV)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PAVL1/PAVR1和MAVL1/MAVR1都有檢出目的條帶(部分結(jié)果未呈現(xiàn))，而測序結(jié)果顯示序列既不是BYDV-PAV，也不是BYDV-MAV，而都與BYDV-GAV同源性最高，說明這兩對引物在BYDV-GAV上也有匹配位點，而針對14Qh8-1序列的分析結(jié)果也印證了這一結(jié)論(圖5)。除Deb等[20]的方法外，筆者也采用馬鈴薯卷葉病毒屬[23]及黃癥病毒屬[24]的通用引物進行了檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，黃癥病毒屬的通用引物也可以檢測到目的條帶，測序結(jié)果也顯示其與BYDV-GAV(EU402389)的同源性最高(99.8%)。

■：本試驗測定的序列；各枝上的數(shù)字是1 000次Bootstrap自導復制的置信度。
■: The sequence studied in this research；Bootstrap confidence values of each branch are indicated above the branch.
圖4 根據(jù)病毒核苷酸序列一致性構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹
Fig.4 Phylogenetic tree based on nucleotide sequence identities ofLuteovirus

圖5 14Qh8-1引物結(jié)合位點的分析Fig.5 Analysis of the possible binding sites of primers on 14Qh8-1

目前在我國發(fā)生的四種BYDVs中，已有多個全基因組序列得到了克隆[10-11, 25-26]，這些工作不僅為我國BYDVs的分類提供了基礎，也為針對病毒培育抗性品種及提出有針對性的防控策略奠定了基礎，但這些研究大多集中在小麥等作物上，青稞上的研究就相對較少，雖然也有報道顯示大麥黃矮病毒也可以侵染青稞[18-19]，但尚未見到相關基因組報道。14Qh8-1是第一個報道的BYDV-GAV青稞分離物基因組。在對其與國內(nèi)BYDV-GAV分離物聚類分析時發(fā)現(xiàn)，它們共同聚類于一個大的分枝，該分枝雖然可以分為三個簇，但各分離物在進化關系上既沒有表現(xiàn)出地理相關性，也沒有表現(xiàn)出寄主相關性。分析可能的原因有兩個：第一，BYDV-GAV目前僅在我國有報道，其基因組序列相對保守(同源性超過97.0%)，可能未出現(xiàn)地理隔離或者寄主?；?；第二，目前有報道基因組的BYDV-GAV分離物數(shù)量有限，主要集中在陜西、甘肅等西北地區(qū)，而寄主目前主要集中在小麥上，樣本量小可能是導致規(guī)律不明顯的原因。在BYDV-GAV第一個簇中，14Qh8-1與陜西渭南分離物(05WN5、05WN2、05WN3)相對近緣，暗示了陜西渭南可能是該病毒的來源。

大麥黃矮病毒自1960年在陜西、甘肅的小麥上發(fā)現(xiàn)以來，給小麥的生產(chǎn)造成了嚴重的損失，成為制約小麥產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要限制因素之一，因此，在生產(chǎn)上，BYDVs在小麥上的危害一直備受關注。但是在一些其他寄主作物上，則關注相對比較少。有研究結(jié)果顯示，BYDVs能侵染150多種禾本科植物，這些寄主植物一方面是BYDVs的潛在危害對象，另一方面又是BYDVs的中間寄主，在BYDVs周年循環(huán)中是重要的病毒侵染來源。本研究明確了侵染青海青稞的病毒為BYDV-GAV，翟 浩等[27]在2010年對青海麥類作物上BYDVs調(diào)查時也發(fā)現(xiàn)BYDV-GAV是當?shù)貎?yōu)勢的大麥黃矮病毒種群，而青稞在當?shù)厥侵匾霓r(nóng)作物，因此，生產(chǎn)上應當密切關注該病毒在青稞等作物上的危害，加大監(jiān)控力度，盡早開展青稞抗BYDV-GAV種質(zhì)資源篩選，防止BYDVs在青稞等作物上造成更大的危害。

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Genomic Cloning and Structural Characterization of an Isolate of BYDV-GAV Infecting Hulless Barley in Qinghai Province

LI Tingfang1,2,3，WU Shuhua2，JI Yinghua2，ZHAO Wenhao2，ZHOU Yijun2，GUO Qingyun1,3

(1.College of Agriculture and Animal Husbandry,Qinghai University,Xining,Qinghai 810016,China; 2.Institute of Plant Protection, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/Key Lab of Food Quality and Safety of Jiangsu Province -State Key Laboratory Breeding Base,Nanjing,Jiangsu 210014,China; 3.Qinghai Academy of Agricultural Sciences/Scientific Observing and Experimental Station of Crop Pest in Xining,Ministry of Agriculture/Qinghai Key Laboratory of Agricultural Integrated Pest Management,Xining,Qinghai 810016,China)

Barley yellow dwarf viruses (BYDVs) cause substantial losses throughout the world wherever their hosts, mainly wheat, barley, and oats, occasionally rice and maize, are grown.In 2004, an investigation on crop virus was carried out in Qinghai province and a kind of yellow dwarf disease on hulless barley was found.Based on the symptom and the vector occurred in the fields, nine samples with typical symptom were collected and detected by RT-PCR using BYDVs primers.The result of RT-PCR showed there was a kind of BYDVs associated with the disease.The sequencing and BLAST analysis indicated the virus shared the highest similarity with BYDV-GAV (about 99.2%) and might be an isolate of BYDV-GAV.To further clarify the taxonomic status of the isolate and the characterization of its genome, three pairs of PCR primers were designed and the full genome of the isolate was cloned using three fragments strategy.The sequences were assembled and the complete genome sequence was determined (5 683 bp), which was composed of 6 ORFs and 4 UTRs, showing typical characters ofLuteovirus.Phylogenetic analysis with other members ofLuteovirusshowed the isolate clustered with BYDV-GAV in the same branch and shared the highest similarity with the isolates from Shaanxi, China.These results indicated that the virus associated with hulless barley yellow dwarf disease in Qinghai province is an isolate of BYDV-GAV.To our knowledge, this is the first report on complete genome of BYDV-GAV infecting hulless barley in Qinghai province.

Barley yellow dwarf viruses; Hulless barley; BYDV-GAV; Qinghai

時間：2017-07-07

網(wǎng)絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20170707.1815.014.html

2017-02-21

2017-06-16

國家自然科學基金項目(31572074)；江蘇省“333”高層次人才培養(yǎng)工程科研項目(BRA2013262)；江蘇省科技基礎設施建設計劃項目(4911406)；公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項經(jīng)費項目(201303021)

E-mail：916716296@qq.com(李廷芳)；Wushuhau@jaas.ac.cn(吳淑華，與第一作者同等貢獻)

郭青云(E-mail：guoqingyunqh@163.com)；周益軍(E-mail：yjzhou@jaas.ac.cn)

S512.3；S330

A

1009-1041(2017)07-0900-07