涂紅艷，唐 敏，何晉浙，邵 平

(1.湖州出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心，浙江 湖州 313000； 2.杭州食品藥品檢測(cè)研究院，浙江 杭州 3230001； 3.浙江工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)系，浙江 杭州 310014)

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近紅外漫反射光譜云芝提取物快速摻假識(shí)別研究

涂紅艷1，唐 敏2*，何晉浙3，邵 平3

(1.湖州出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心，浙江 湖州 313000； 2.杭州食品藥品檢測(cè)研究院，浙江 杭州 3230001； 3.浙江工業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)系，浙江 杭州 310014)

為探索準(zhǔn)確識(shí)別云芝提取物摻假(糊精)的方法，采用近紅外漫反射光譜技術(shù)，對(duì)不同產(chǎn)地云芝提取物及摻假樣品進(jìn)行定性識(shí)別研究。在12 500～4 000 cm-1波段范圍，采集樣品的光譜，應(yīng)用偏最小二乘判別法(PLS-DA)建立云芝提取物摻假識(shí)別模型。通過(guò)Kolmogorov-Smirnov法檢驗(yàn)?zāi)Ｐ椭性浦ヌ崛∥锓诸?lèi)變量值的分布規(guī)律，從而建立識(shí)別云芝提取物的最佳閾值區(qū)間，以實(shí)現(xiàn)對(duì)云芝提取物的摻假研究。結(jié)果表明，使用一階導(dǎo)數(shù)(FD)和多元散射校正(MSC)的預(yù)處理方法，在主因子數(shù)為2，以及分別設(shè)置云芝提取物及摻假樣品的分類(lèi)變量為1、0時(shí)，云芝提取物的分類(lèi)變量值服從正態(tài)分布，其最佳閾值區(qū)間為0.54～1.28(包含0.54和1.28)。建立偏最小二乘判別(PLS-DA)模型，對(duì)驗(yàn)證集樣品進(jìn)行識(shí)別，正確率可達(dá)100%。因此，該方法可較好地對(duì)云芝提取物進(jìn)行摻假識(shí)別，同時(shí)為云芝提取物摻假識(shí)別模型的界限值確立、建立最佳閾值區(qū)間提供理論依據(jù)和方法。

云芝提取物； 摻假； 近紅外； 閾值區(qū)間

云芝是一種常見(jiàn)的食用菌，也是一種名貴的中藥材[1]。其提取物中富含多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(多糖、萜類(lèi)等)，可顯著提高人體免疫力、增強(qiáng)機(jī)體耐缺氧能力、有效抑制腫瘤、輻射等作用。隨著經(jīng)濟(jì)和生活水平的提高，云芝提取物的需求量也在不斷的增長(zhǎng)[2]。然而市面上的生產(chǎn)廠家的良莠不齊、品質(zhì)不一也給部分不良廠商的摻假謀利帶來(lái)可乘之機(jī)[3]。常見(jiàn)利用的糊精、淀粉等廉價(jià)多糖的摻假，不僅阻礙企業(yè)的發(fā)展，同時(shí)也嚴(yán)重的損害到廣大消費(fèi)者的權(quán)益[4]。

傳統(tǒng)的摻假鑒別方法主要有感官鑒別、顯微鑒別、物理鑒別(排水法、熱重分析法、微量升華法等)、化學(xué)鑒別(薄層色譜等)等[5-7]。然而，這些方法的樣品前處理過(guò)程復(fù)雜，鑒別時(shí)間長(zhǎng)且操作繁瑣[8]。因此，建立一種快速、無(wú)損的鑒別云芝提取物摻假的方法，具有顯著的實(shí)用價(jià)值。

近年來(lái)，隨著光譜學(xué)和計(jì)算機(jī)的迅速發(fā)展，建立在近紅外光譜技術(shù)上的無(wú)損檢測(cè)，具有分析速度快、效率高、成本低等諸多優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用在食品等領(lǐng)域[9]。Ruth等[10]采用PLS-DA模型識(shí)別動(dòng)物油脂和植物油脂，其識(shí)別率可達(dá)100%。Chen等[11]通過(guò)建立PLS-DA模型對(duì)靈芝提取物進(jìn)行溯源分析時(shí)，提出以±0.25作為界限值，識(shí)別率達(dá)到100%。邵平等[12]在建立PLS-DA模型識(shí)別靈芝提取物和云芝提取物時(shí)，提出以±0.5作為界限值，其識(shí)別率也達(dá)到100%。在建立識(shí)別模型中，確立界限值，建立識(shí)別模型的閾值區(qū)間，將直接影響樣品摻假與否的判定。但以上研究，界限值的確立均為研究者自行設(shè)定而沒(méi)有給出嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目茖W(xué)確立方法，且對(duì)于恰好達(dá)到界限值的樣品無(wú)法判定其有無(wú)摻假。為進(jìn)一步探索界限值確立的方法，建立最佳模型閾值區(qū)間，并準(zhǔn)確判定界限值樣品的摻假與否，本試驗(yàn)擬采用近紅外漫反射光譜技術(shù)，運(yùn)用偏最小二乘判別模型并結(jié)合Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)方法，對(duì)云芝提取進(jìn)行摻假定性識(shí)別，同時(shí)也為云芝提取物摻假識(shí)別模型的界限值確立、建立最佳閾值區(qū)間提供理論依據(jù)和方法。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

試驗(yàn)中云芝提取物來(lái)自不同產(chǎn)地(東北、龍泉、長(zhǎng)白山、安徽大別山、大興安嶺)，摻假用的糊精來(lái)自河南(河南大田食品添加劑有限公司)，共計(jì)140個(gè)樣品，云芝提取物和摻假樣品各70個(gè)。運(yùn)用直觀分類(lèi)的方法，按照4∶1的比例，將所有的樣品分為建模集和驗(yàn)證集，其中建模集中樣品數(shù)為56個(gè)，驗(yàn)證集14個(gè)。儀器有德國(guó)布魯克光學(xué)儀器公司(Bruker Optics Inc.)MPA TM傅里葉變換近紅外光譜儀及稱(chēng)量瓶等附件，TE-InGaAs檢測(cè)器，OPUS 6.5光譜采集。

1.2 近紅外光譜的采集

將樣品放置于環(huán)境溫度為(20±2)℃，濕度為(50±5)%的實(shí)驗(yàn)室24 h[13]。以儀器內(nèi)置背景為參比，將混合均勻的樣品倒入到稱(chēng)量皿中壓實(shí)，采集樣品的近紅外漫反射光譜[14]。光譜波數(shù)范圍為12 400～4 000 cm-1，分辨率為8 cm-1，掃描次數(shù)為16次，取其平均光譜作為該樣品的原始光譜[15]。

1.3 偏最小二乘判別法

偏最小二乘判別法(PLS-DA)是一種用于判別分析的多變量統(tǒng)計(jì)分析方法。其原理是對(duì)不同處理樣本(如觀測(cè)樣本、對(duì)照樣本)的特性分別進(jìn)行訓(xùn)練，產(chǎn)生訓(xùn)練集，并檢驗(yàn)訓(xùn)練集的可信度[16]。在光譜分析中，PLS-DA算法可通過(guò)提取有效信息與標(biāo)準(zhǔn)值之間建立回歸模型，并采用交互驗(yàn)證的方式對(duì)模型驗(yàn)證可防止過(guò)擬合現(xiàn)象的出現(xiàn)[17]。

1.4 Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)

Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)[18]是一種基于累積分布函數(shù)，用以檢驗(yàn)1個(gè)經(jīng)驗(yàn)分布是否符合某種理論分布或比較2個(gè)經(jīng)驗(yàn)分布是否具有顯著性差異檢驗(yàn)。對(duì)來(lái)自樣本數(shù)據(jù)的累計(jì)頻數(shù)分布與特定理論分布比較，通過(guò)兩者間的差距比較推論樣本取自某特定分布族[19]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)采用TQ Analyst 8.6和SPSS 18分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品光譜圖的采集

通過(guò)傅里葉變換近紅外光譜儀采集全部樣品的原始光譜，分別求云芝提取物和摻假樣品的平均光譜見(jiàn)圖1。

圖1 樣品原始近紅外光譜圖

由圖1可知，兩者之間具有一些相同的吸收峰位，但是兩者之間具有明顯的差異，摻假樣品的吸光度明顯高于云芝提取物的吸光度。在8 000～4 000 cm-1二者近紅外光譜差異較大，這主要是與兩者表面顏色和發(fā)色集團(tuán)的差異有關(guān)；在12 500～8 000 cm-1，二者區(qū)別較小。這些差異的存在使得近紅外漫反射光譜技術(shù)應(yīng)用于二者的鑒別分析成為可能。

2.2 光譜的預(yù)處理

光譜數(shù)據(jù)中往往會(huì)含有環(huán)境以及儀器帶來(lái)的噪聲[20]。為去除光譜噪聲以及基線漂移等的影響，本試驗(yàn)分別采用多元散射校正(MSC)、變量標(biāo)準(zhǔn)化(SNV)、一階導(dǎo)數(shù)(FD)、二階導(dǎo)數(shù)(SD)、驗(yàn)證決定系數(shù)(R2)、校正均方根差(RMSECV)等方法進(jìn)行預(yù)處理。不同的預(yù)處理方法建立識(shí)別模型的結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 建模集中不同預(yù)處理的結(jié)果

由表1可知，采用FD并結(jié)合MSC建立模型的R2為0.988，RMSECV為0.078，此時(shí)RMSECV值最低，預(yù)處理效果達(dá)到最優(yōu)。

2.3 主因子數(shù)的確定

在FD并結(jié)合MSC預(yù)處理下，建立PLS-DA模型，采用預(yù)測(cè)殘差平方和(pediction residual error sum of squares，PRESS)值來(lái)確定最佳主因子數(shù)。PLS-DA模型中PRESS值隨主因子數(shù)的變化見(jiàn)圖2，在避免過(guò)擬合的前提下，選取最低PRESS值所對(duì)應(yīng)的主因子數(shù)。由圖2可知，在選擇主因子數(shù)為2時(shí)，預(yù)測(cè)殘差平方和較低，模型的優(yōu)化效果較好。

圖2 PLS-DA模型PRES值隨主因子數(shù)的變化

2.4 模型的建立及閾值區(qū)間的確定

采用FD并結(jié)合MSC的預(yù)處理方法，在最佳主成分因子數(shù)為2時(shí)，設(shè)置云芝提取物的分類(lèi)變量為1，摻假樣品的分類(lèi)變量為0，建立偏最小二乘判別模型。對(duì)模型的結(jié)果進(jìn)行Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)。

由表2可知，云芝提取物樣品在Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)下，其Asymp.Sig.(2-tailed)值為0.200，大于顯著水平0.05，即云芝提取物的預(yù)測(cè)變量值服從均值μ為0.912，標(biāo)準(zhǔn)偏差σ為0.124的正態(tài)分布；同理可知，摻假樣品的預(yù)測(cè)變量值并不服從正態(tài)分布。由正態(tài)分布的規(guī)律及其3σ原則可知，云芝提取物分類(lèi)變量值的最佳閾值區(qū)間可確定為0.54～1.28(包含0.54和1.28)，云芝提取物摻假樣品變量值的閾值區(qū)間為小于0.54，而閾值大于1.28的變量值即可判定為異常樣品。

2.5 模型的預(yù)測(cè)和評(píng)價(jià)

運(yùn)用建立的識(shí)別模型，對(duì)驗(yàn)證集中28個(gè)樣品(14個(gè)云芝提取物樣品和14個(gè)摻假樣品)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果如圖3，表3所示。

表2 樣品正態(tài)性檢驗(yàn)結(jié)果

注：a，鑒定分配常態(tài)；b，從資料計(jì)算；c，Lilliefors顯著更正；d，true顯著下限。

圖3 云芝提取物摻假識(shí)別預(yù)測(cè)結(jié)果

識(shí)別效果樣品云芝提取物摻假樣品分類(lèi)變量值10預(yù)測(cè)的變量值0.85～1.07-0.11～0.15可接受的預(yù)測(cè)范圍0.54～1.28<0.54正確率/%100100

由上述結(jié)果可知，通過(guò)建立的PLS-DA模型，對(duì)驗(yàn)證集中的14個(gè)云芝提取物樣品分類(lèi)準(zhǔn)確度達(dá)到100%，14個(gè)摻假樣品的分類(lèi)準(zhǔn)確度也達(dá)到100%。因此，采用該方法將二者準(zhǔn)確識(shí)別可行，同時(shí)也為PLS-DA模型確立界限值，建立最佳閾值區(qū)間提供了一種可行的方法。

3 小結(jié)與討論

目前，對(duì)云芝提取物摻假產(chǎn)品的鑒別試驗(yàn)尚無(wú)統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)[21-22]。近紅外光譜分析技術(shù)通過(guò)采集樣品的漫反射光譜，直接獲取樣品的信息，從而可以達(dá)到對(duì)樣品進(jìn)行定量和定性的分析[23-24]。本試驗(yàn)針對(duì)不同的云芝提取物及摻假樣品的定性分析，相對(duì)于原始光譜，通過(guò)MSC并結(jié)合FD預(yù)處理的模型精確度可得到較好的提高，剔除了一些無(wú)用的信息[25]。但模型中對(duì)云芝提取物的摻假樣品沒(méi)有建立準(zhǔn)確的閾值區(qū)間范圍[26]。其主要原因是沒(méi)有分析出云芝提取物的摻假樣品變量值分布規(guī)律，針對(duì)云芝提取物摻假樣品閾值區(qū)間的確定需要進(jìn)一步的研究[27]。此外，本研究采集的樣本的品種和數(shù)量有限，是否具有典型的代表性在后續(xù)工作中需進(jìn)一步驗(yàn)證。

基于近紅外漫反射光譜技術(shù)，采用PLS-DA法結(jié)合Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)，可作為一種快速、無(wú)損識(shí)別云芝提取物摻假的方法。研究采集不同產(chǎn)地的云芝提取物及摻假樣品進(jìn)行定性識(shí)別研究[28]。在12 500～4 000 cm-1波段，采集樣品的近紅外漫反射光譜，應(yīng)用偏最小二乘判別法結(jié)合Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)?zāi)Ｐ椭性浦ヌ崛∥锓诸?lèi)變量的分布規(guī)律，建立云芝提取物摻假定性識(shí)別模型的最佳閾值區(qū)間。對(duì)驗(yàn)證集進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果表明，結(jié)合Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)，采用PLS-DA方法建立的識(shí)別模型能較好地對(duì)云芝提取物的摻假進(jìn)行識(shí)別，驗(yàn)證集樣品的識(shí)別正確率為100%。因此，偏最小二乘判別法結(jié)合Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)建立識(shí)別云芝提取物摻假模型是可行的，同時(shí)也為云芝提取物摻假識(shí)別模型建立最佳閾值區(qū)間提供一種理論依據(jù)和方法。

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(責(zé)任編輯：張瑞麟)

2017-02-15

浙江省公益技術(shù)應(yīng)用研究項(xiàng)目(2016C32SA501036)；湖州市公益技術(shù)應(yīng)用研究項(xiàng)目(2016GY02)；杭州市科技項(xiàng)目20170432B20)

涂紅艷，碩士，從事食品檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用研究工作，E-mail：19808164@qq.com。

唐 敏，碩士，從事食品檢測(cè)技術(shù)應(yīng)用研究工作，E-mail：41700770@qq.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170731

O657；S567

A

0528-9017(2017)07-1992-04

文獻(xiàn)著錄格式：涂紅艷，唐敏，何晉浙，等. 近紅外漫反射光譜云芝提取物快速摻假識(shí)別研究[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58(7)：1192-1195，1198.