劉士輝，李懷志，沈若剛，葛海燕，陳火英，王兆龍

(1.農(nóng)業(yè)部設(shè)施園藝產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201210； 2.上?；莺头N業(yè)有限公司，上海 200051； 3.上海交通大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240)

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石斛種質(zhì)資源遺傳多樣性的SSR分析及指紋圖譜構(gòu)建

劉士輝1，李懷志2，沈若剛2，葛海燕3，陳火英3，王兆龍3

(1.農(nóng)業(yè)部設(shè)施園藝產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201210； 2.上?；莺头N業(yè)有限公司，上海 200051； 3.上海交通大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240)

利用20對SSR標(biāo)記對10個石斛品系進(jìn)行遺傳多樣性分析，共獲得118條擴(kuò)增帶，其中59條具有多態(tài)性，每對引物組合可擴(kuò)增出1～6條多態(tài)性條帶，平均2.95條。10個石斛品系間Jaccard遺傳相似系數(shù)為0.162～0.885，表明孫橋農(nóng)業(yè)園區(qū)的石斛具有較好的遺傳多樣性，同時構(gòu)建了10個石斛品系的特征指紋圖譜。

石斛； 遺傳多樣性； 指紋圖譜； SSR標(biāo)記

石斛屬于蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium)，有些種如鐵皮石斛已大規(guī)模人工栽培用于生產(chǎn)藥材或高檔保健品。野生鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo)，對生長條件要求非常苛刻，且由于大量采集和生境破壞而近乎滅絕，已被列為我國二級保護(hù)植物。目前，鐵皮石斛人工栽培品種來自野生居群，不僅外觀性狀不一，而且生產(chǎn)出的鐵皮石斛在多糖、石斛堿等有效功能成分含量上參差不齊，致使消費(fèi)者難以辨別，從而阻礙石斛產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

SSR是一種基于PCR的分子標(biāo)記，具有操作簡單、豐富多態(tài)性、重演性高且呈共顯性遺傳而被廣泛用于石斛遺傳圖譜構(gòu)建[1]、遺傳多樣性分析與種質(zhì)鑒定[2-5]等方面。本研究通過對各地搜集的表現(xiàn)優(yōu)良的石斛品種進(jìn)行鑒定，構(gòu)建了石斛品種的指紋圖譜，并為下一步培育產(chǎn)量高、質(zhì)量優(yōu)的品系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)在上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院園藝植物資源與種質(zhì)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室完成，所有石斛來自孫橋農(nóng)業(yè)園區(qū)組培中心(表1)，1號是霍山石斛(D.huoshanense)，其余是鐵皮石斛(D.officinale)。芽增殖培養(yǎng)基為MS+2.0 mg·L-16-BA，生根培養(yǎng)基為MS+15%香蕉泥+0.2 mg·L-1NAA，每升生根培養(yǎng)基中加0.5 g活性炭。

表1 供試鐵皮石斛材料及來源

1.2 基因組DNA提取

基因組DNA提取和純化參照CTAB方法，稍作改動。取鮮嫩或凍存葉片200 mg，置液氮中研磨成粉末，移至1.5 mL離心管中加入600 μL預(yù)熱的CTAB提取緩沖液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的CTAB，0.1 mol·L-1Tris-HCl(pH 8.0)，1.4 mol·L-1NaCl，0.02 mol·L-1EDTA，1.5%的巰基乙醇)充分混勻后于60℃保溫50 min，離心取上清液，分別用等體積的酚、氯仿、異戊醇混合液(體積比為25∶24∶1)和氯仿、異戊醇混合液(體積比為24∶1)抽提，水相加2/3體積預(yù)冷異丙醇，快速輕輕混勻。用牙簽挑出絮狀沉淀，70%乙醇洗滌，晾干后溶于適量TE中，加入10 g·L-1RNase至終質(zhì)量濃度50 mg·L-1，于37 ℃溫育50 min。再用等體積的氯仿、異戊醇混合液抽提1～2次，用冰凍2～2.5倍體積的無水乙醇沉淀DNA，風(fēng)干，溶于適量的TE中。用紫外分光光度計(jì)測定其濃度，并用8 g·L-1瓊脂糖凝膠電泳鑒定DNA的質(zhì)量。樣品稀釋到50 ng·μL-1，4 ℃保存。

1.3 PCR擴(kuò)增

引物序列參考文獻(xiàn)[1,6-7]，由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成(表2)。SSR-PCR反應(yīng)重復(fù)2次。體系總體積為10 μL，包括MgCl22.0 mmol·L-1，dNTP 0.2 mmol·L-1，引物0.50 μmol·L-1，模板DNA 50 ng，Taq酶1 U。擴(kuò)增程序如下： 94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性1 min，57 ℃復(fù)性1 min，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物加5 μL上樣緩沖液， 94 ℃變性5 min。采用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠，0.5×TBE緩沖液，60 W恒功率電泳，銀染檢測電泳結(jié)果。

表2 供試引物的序列

1.4 數(shù)據(jù)分析

只統(tǒng)計(jì)清晰、再現(xiàn)性強(qiáng)的條帶。擴(kuò)增產(chǎn)物按同一位點(diǎn)條帶有或無分別賦值，有帶記為1， 無帶記為0; 采用NTSYS-pc version 2.10[15]軟件計(jì)算Jaccard相似指數(shù)， 按照UPGMA法進(jìn)行聚類。

2 結(jié)果與分析

2.1 品種遺傳多樣性分析

在95對用于篩選的SSR標(biāo)記中，選擇20對帶型清晰、多態(tài)性好的引物用于石斛種質(zhì)鑒定，共擴(kuò)增出 118條帶，其中差異條帶59條，多態(tài)性比率為50%，擴(kuò)增片段大小為110～280 bp。平均每個引物組合擴(kuò)增出2.95條多態(tài)性條帶，其中引物BWH015擴(kuò)增的多態(tài)性條帶最多，為6條(表3)。引物ER45和ER49在10種鐵皮石斛中的擴(kuò)增結(jié)果見圖1。10個石斛品種中相似系數(shù)最大為0.885(7號和10號)，相似系數(shù)最小為0.162(1號和8號)。

表3 使用SSR引物擴(kuò)增石斛多態(tài)性

1～10編號同表1； M為1 000 bp marker圖1 引物ER45和ER49 在10份石斛品系的SSR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 品系聚類分析和指紋圖譜構(gòu)建

根據(jù)Jaccard相似系數(shù)，利用非加權(quán)組平均法(UPGMA)對供試材料進(jìn)行聚類分析(圖2)。在相似系數(shù)0.400處可以把霍山石斛和鐵皮石斛歸為兩個不同類群。其余9個鐵皮石斛品系進(jìn)一步可劃分為兩個類群，第一個類群包括2號、3號、5號、6號、7號和10號，這些材料主要來源于浙江、安徽等地；第二個類群包括4號、8號和9號，主要來源于上海。由于鐵皮石斛材料主要來自于浙江、上海、安徽等地理上相近地區(qū)，因此與地理位置上的相關(guān)性還有待于進(jìn)一步研究。

圖2 10個石斛品系的UPGMA聚類樹

2.3 品種指紋圖譜構(gòu)建

根據(jù)每個品系DNA擴(kuò)增圖譜中SSR標(biāo)記的特異性條帶的有無，由1和0形成的有序數(shù)字串，構(gòu)成某個品種的特征指紋圖譜。表4列出了10份石斛材料的特征指紋圖譜。從擴(kuò)增出的59條特征條帶中選擇了11條譜帶把供試10份石斛材料完全區(qū)分開，這11條帶是由HL016、BWH004、BWH015、ER36、ER45、ER49和ER75共7對引物擴(kuò)增得到的。

3 小結(jié)與討論

本研究利用篩選出的20對SSR引物組合對10個鐵皮石斛品系進(jìn)行了遺傳多樣性分析，等位基因數(shù)為2.95條。Lu等[1]利用20個EST-SSR對19個鐵皮石斛的遺傳多樣性分析表明，每個位點(diǎn)的等位基因數(shù)是2.5個。Gu等[2]對22個鐵皮石斛品系進(jìn)行了遺傳多樣性分析，其中12對引物呈多態(tài)性，結(jié)果表明，每個位點(diǎn)的等位基因數(shù)在3～12，平均5.67?；蚪M中編碼區(qū)比非編碼區(qū)存在更多的堿基變異，因此使用基因組SSR所做的遺傳多樣性分析比使用EST-SSR所做的遺傳多樣性高[8-9]，本試驗(yàn)中采用的標(biāo)記基本上是EST-SSR標(biāo)記，因此等位基因數(shù)與Lu等[1]的結(jié)果相近，而與Gu等[2]的研究有較大差異。也有可能是因?yàn)樗鸭蔫F皮石斛來源于上海、浙江、安徽等相對狹窄的地理范圍。除了對鐵皮石斛種質(zhì)進(jìn)行分子評價外，還需要對其農(nóng)藝性狀和品質(zhì)差異進(jìn)行評價，尤其是決定鐵皮石斛品質(zhì)的重要指標(biāo)多糖和石斛堿含量，為優(yōu)質(zhì)鐵皮石斛選育奠定基礎(chǔ)。

表4 10個石斛品系的SSR 特征指紋圖譜

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(責(zé)任編輯：張 韻)

2017-03-07

浦東新區(qū)科技發(fā)展基金創(chuàng)新資金(PKJ2014-N17)

劉士輝(1977—)，男，安徽宿州人，在讀博士，主要從事植物生產(chǎn)調(diào)控研究工作，Email: liushihui2005@163.com。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170728

S567

A

0528-9017(2017)07-1183-03

文獻(xiàn)著錄格式：劉士輝，李懷志，沈若剛，等. 石斛種質(zhì)資源遺傳多樣性的SSR分析及指紋圖譜構(gòu)建[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58(7)：1183-1185，1189.