吳新義，吳曉花，徐 沛，汪寶根，魯忠富，余曉虹，李國景

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所 省部共建農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全國家重點實驗室培育基地，浙江 杭州 310021)

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瓠瓜浙蒲8號DNA指紋圖譜構(gòu)建及純度檢測

吳新義，吳曉花，徐 沛，汪寶根，魯忠富，余曉虹，李國景*

(浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所 省部共建農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全國家重點實驗室培育基地，浙江 杭州 310021)

浙蒲8號是浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所最新育成的F1代耐熱瓠瓜新品種。為品種權(quán)保護及雜交種純度鑒定提供科學(xué)依據(jù)，該研究從162對瓠瓜InDel標(biāo)記中篩選出8對診斷性標(biāo)記，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建了浙蒲8號的DNA指紋圖譜；利用其中1對標(biāo)記BID046，使用KAPA3G Plant PCR試劑盒建立了快速、準(zhǔn)確鑒定種子純度的技術(shù)，該技術(shù)實現(xiàn)了一步法進行DNA提取和PCR擴增，大大提高了鑒定效率，為浙蒲8號建立了指紋圖譜和種子純度快速鑒定技術(shù)，可以為其他瓠瓜品種鑒定所借鑒，促進了瓠瓜種子產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。

瓠瓜； 指紋圖譜； 種子純度； InDel標(biāo)記

瓠瓜[Lagenariasiceraria(Molina) Standl.]又名瓠子、長瓜、蒲瓜、夜開花、葫蘆等，是中國南方地區(qū)夏季主要的瓜類蔬菜作物，目前全國栽培總面積超過20萬hm2。浙江省為瓠瓜主栽地區(qū)之一，僅設(shè)施栽培面積就超過0.67萬hm2。目前，市場上的商品種子主要有雜交種和常規(guī)自交種，品種繁多，純度不一，同種異名現(xiàn)象嚴(yán)重，種子質(zhì)量糾紛時有發(fā)生。建立能快速準(zhǔn)確地鑒定品種和進行純度分析的技術(shù)對于種子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)化、品種審定、假種辨別、產(chǎn)權(quán)糾紛均有重要作用。

傳統(tǒng)的種子鑒別方法一般有田間種植鑒定、室內(nèi)生化鑒定等方法[1-2]。田間種植需要一定的種植面積，受環(huán)境影響較大，試驗周期長且難以獲得準(zhǔn)確的測試結(jié)果；室內(nèi)生化鑒定包括組織化學(xué)鑒定、同工酶檢測、籽粒醇溶蛋白檢測等方法，雖比田間鑒定準(zhǔn)確，但大部分方法只能用于檢測部分作物的個別品種，且常因材料間遺傳背景相似或操作技術(shù)復(fù)雜降低了檢測的靈敏度。隨著分子標(biāo)記技術(shù)的飛速發(fā)展，越來越多的作物已經(jīng)使用分子標(biāo)記鑒別種子純度和真?zhèn)危⒏鶕?jù)不同標(biāo)記的多態(tài)性建立可以識別品種身份的DNA指紋圖譜[3-5]。分子標(biāo)記源于DNA水平的差異，在植株幼苗階段即可進行檢測，且不受基因表達和環(huán)境條件的影響，技術(shù)簡單、快速，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，目前已經(jīng)廣泛用于作物種子鑒定[6-8]。

浙蒲8號為浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所最新育成的耐熱瓠瓜新品種[9]，于2015年2月通過浙江省非主要農(nóng)作物品種審定委員會審定，目前已在浙江、山東、湖北、福建和安徽等地進行示范，累計推廣約100 hm2，為了保護浙蒲8號的品種權(quán)，為雜交種純度鑒定提供科學(xué)依據(jù)，本研究使用InDels標(biāo)記構(gòu)建了浙蒲8號的DNA指紋圖譜，并建立了快速鑒別種子純度的技術(shù)體系。

1 材料與方法

1.1 材料

浙蒲8號雜交種(F1)及其父本(P1)和母本(P2)。所有材料播于穴盤中，置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)，控制溫度為白天30 ℃，夜晚25 ℃，光照時間為白天14 h，夜晚10 h。

1.2 InDel標(biāo)記信息

本課題組前期對2個瓠瓜品種杭州長瓜和J129進行了簡化基因組測序，利用這2個品種的序列開發(fā)了892對InDels標(biāo)記，本研究使用其中插入-缺失長度超過2 bp的162對標(biāo)記[10]。

1.3 DNA指紋圖譜構(gòu)建

取生長2周的浙蒲8號幼嫩葉片，液氮研磨后利用DNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取基因組DNA。PCR反應(yīng)體積為12.5 μL，包含2 μL 模板DNA(10～20 ng·μL-1)，1.25 μL 10×PCR buffer(成分為15 mmol·L-1MgCl2，100 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.3，500 mmol·L-1KCl)，1 μL dNTP(2.5 mmol·L-1)，上下游引物各0.3 μL，0.01 μLTaq聚合酶(5 U·μL-1)，7.64 μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 3 min；94 ℃30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min，4 ℃保存。取3 μL PCR產(chǎn)物在8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳(AcrBis為19∶1或39∶1)，指示劑為二甲苯青，電泳電壓為200 V，電泳時間1 h，用銀染法染色顯帶[11]，照相后用Photoshop軟件對圖片進行處理，觀察。

1.4 種子純度鑒定

待浙蒲8號單株生長至1葉1心期，用打孔器取直徑約0.3～0.5 cm的葉片，加入KAPA3G Plant PCR試劑(KAPABIOSYSTEMS，KK7251)和引物，直接放入PCR儀進行擴增。PCR反應(yīng)體系為50 μL：25 μL 2×KAPA Plant PCR Buffer，10 μL MgCl2(25 mmol·L-1)，上下游引物各1 μL，0.4 μL KAPA3G植物DNA聚合酶(2.5 U·μL-1)，加入ddH2O使終體積為50 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min，4 ℃保存。采用普通的PAGE凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行分離和觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 浙蒲8號DNA指紋圖譜構(gòu)建

根據(jù)162對標(biāo)記在浙蒲8號和其他8份材料中的擴增情況，從擴增條帶的穩(wěn)定性、引物多態(tài)性和多態(tài)性條帶的易分辨程度綜合考慮，從中選擇了BID039、BID046、BID052、BID089、BID096、BID105、BID122、BID137共8對標(biāo)記，作為浙蒲8號的診斷性標(biāo)記(表1)。這8對標(biāo)記均為共顯性標(biāo)記，據(jù)此構(gòu)建了浙蒲8號基于InDel標(biāo)記的DNA指紋圖譜(圖1)。

表1 8對診斷性InDel標(biāo)記的引物序列信息

1～8依次為BID039、BID046、BID052、BID089、BID096、BID105、BID122和BID137圖1 浙蒲8號的標(biāo)準(zhǔn)DNA指紋圖譜

2.2 浙蒲8號種子純度檢測

根據(jù)浙蒲8號的指紋圖譜，從中選擇1個標(biāo)記BID046來檢測種子的純度。從圖2可以看出，BID046在浙蒲8號、親本P1和P2中擴增出3種帶型，其中親本P1的帶型較高，親本P2的帶型較低，而浙蒲8號為2條帶型。在檢測的62株中，發(fā)現(xiàn)1株為假雜種，種子純度為98.4%。假雜種單株的帶型為母本P1的帶型，推測可能是自花授粉造成。

a中1、2為標(biāo)準(zhǔn)浙蒲8號，3、4為其母本和父本；b為浙蒲8號的代表性單株，第4株為假雜種圖2 浙蒲8號的純度檢測情況

3 討論

基于全基因組重測序的InDel標(biāo)記，因其具有在基因組內(nèi)分布廣、密度高、變異穩(wěn)定、多態(tài)性強、檢測容易等優(yōu)點，受到越來越多的關(guān)注。與傳統(tǒng)的SSR標(biāo)記相比，InDel標(biāo)記擴增出的帶型簡單，特異性更強，在遺傳分析和基因診斷中準(zhǔn)確性和分辨率更高。目前，InDel標(biāo)記已經(jīng)應(yīng)用于黃瓜、水稻等作物種子鑒定[12-13]。本研究從162對InDel標(biāo)記中篩選出8對標(biāo)記構(gòu)建了浙蒲8號的指紋圖譜，為該品種未來的生產(chǎn)推廣提供了特殊、唯一的身份證明，有助于品種權(quán)保護和打擊種子偽冒現(xiàn)象。

在傳統(tǒng)的分子標(biāo)記鑒定種子純度過程中，DNA提取耗時費力，是限制大規(guī)模鑒定的主要因素。本研究使用KAPA3G Plant PCR試劑盒，實現(xiàn)了一步法進行DNA提取和PCR擴增，大大提高了工作效率。本研究建立了快速鑒定浙蒲8號種子純度的技術(shù)體系，該體系有以下幾個優(yōu)點：1)耗時短，從

播種到獲得鑒定結(jié)果，最快只需5 d，其中植株生長4 d，鑒定1天；2)效率高，無論是子葉還是真葉，PCR擴增效果基本沒有差別，可以在子葉露出后立即取樣，無需提取基因組DNA，大大節(jié)省了時間和工作量；3)純度鑒定取樣很少，其余整株可以用來做其他鑒定，如CGMMV檢測，實現(xiàn)1次發(fā)苗檢測多個指標(biāo)；4)費用低，普通的試劑盒每個樣品僅DNA提取的費用為6元以上，KAPA3G試劑盒從提DNA到PCR擴增，每個樣本費用也約為6元。本研究建立的瓠瓜種子純度鑒定技術(shù)體系也可以用于其他蔬菜作物的種子鑒定。

[1] 李淑娟. 種子純度鑒定方法概述[J]. 青海大學(xué)學(xué)報, 2003, 21(1): 16-19.

[2] 穆建新, 李殿榮, 郭藹光, 等. 用SSR分子標(biāo)記檢測雜交油菜秦優(yōu)7號的種子純度[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2010, 19(11): 64-68.

[3] 王玲平, 戴丹麗, 吳曉花, 等. AFLP分子標(biāo)記技術(shù)在浙蒲2號種子純度快速鑒定中的應(yīng)用[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2008, 20(2): 84-87.

[4] 翟文強, 田清震, 賈繼, 等. 哈密瓜雜交種純度的AFLP指紋鑒定[J]. 園藝學(xué)報, 2002, 29(6): 587.

[5] 李麗, 鄭曉鷹. AFLP分子標(biāo)記應(yīng)用于白菜品種鑒定[J]. 分子植物育種, 2006, 4(5): 685-689.

[6] 魯忠富, 徐沛, 吳曉花, 等. SSR分子標(biāo)記技術(shù)在瓠瓜種子純度快速鑒定中的應(yīng)用[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報, 2012, 24(4): 578-581.

[7] 石海波, 王立新, 李宏博, 等. 利用SSR標(biāo)記區(qū)別小麥品種種子混雜和SSR位點不純的研究[J]. 分子植物育種, 2006, 4(4): 513-519.

[8] 郭民華, 王志紅, 黎東亮, 等. 利用SSR標(biāo)記快速檢測玉米品種純度[J]. 農(nóng)學(xué)學(xué)報, 2013, 3(5): 4-7.

[9] 吳曉花, 汪寶根, 魯忠富, 等. 瓠瓜新品種浙蒲8號的選育[J]. 中國蔬菜, 2015 (6): 61-64.

[10] XU P, XU S, WU X, et al. Population genomic analyses from low-coverage RAD-Seq data: a case study on the non-model cucurbit bottle gourd[J]. Plant Journal, 2014, 77(3): 430-442.

[11] BASSAM B J, CAETANO-ANOLLéS G, GRESSHOFF P M. Fast and sensitive silver staining of DNA in polyacrylamide gels [J]. Analytical Biochemistry, 1991, 196(1): 80-83.

[12] 蘭青闊, 張桂華, 王永, 等. 基于InDel標(biāo)記快速檢測黃瓜津優(yōu)38種子純度[J]. 種子, 2011, 30(6): 19-23.

[13] 馮芳君, 羅利軍, 李熒, 等. 水稻InDel和SSR標(biāo)記多態(tài)性的比較分析[J]. 分子植物育種, 2005, 3(5): 725-730.

(責(zé)任編輯：侯春曉)

2017-02-08

浙江省重大科技專項(2016C02051)；浙江省公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201403032)；浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院青年人才培養(yǎng)項目(2016R23R08E04)

吳新義(1984—)，男，河南南陽人，助理研究員，博士，從事蔬菜分子育種工作，E-mail: wuxinyi@mail.zaas.ac.cn。

李國景(1966—)，男，浙江東陽人，研究員，博士，從事蔬菜育種與栽培技術(shù)研究工作，E-mail: ligj@mail.zaas.ac.cn。

10.16178/j.issn.0528-9017.20170717

S642.9

A

0528-9017(2017)07-1150-03

文獻著錄格式：吳新義，吳曉花，徐沛，等. 瓠瓜浙蒲8號DNA指紋圖譜構(gòu)建及純度檢測[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，58(7)：1150-1152.