李曉寧單筱淳吳 磊梁雪松遲 蕾劉雙嶺梅繼林李 諾

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江哈爾濱 150040）

·實驗報告·

急性脊髓損傷后最佳干預時間窗的實驗研究*

李曉寧1單筱淳2吳 磊2梁雪松2遲 蕾2劉雙嶺1梅繼林2李 諾2

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江哈爾濱 150040）

目的觀察急性脊髓損傷（ASCI）后大鼠神經(jīng)細胞凋亡出現(xiàn)的最早時間，明確早期干預的時間點。方法 將48只雌性Wistar大鼠，隨機平分為兩組：假手術組（Sham）及急性脊髓損傷組（ASCI），每組各分為4個亞組即1 h、3 h、6 h和8 h。于相應時間點進行造模后取材。HE染色法觀察大鼠脊髓組織病理學形態(tài)變化；TUNEL染色法檢測大鼠神經(jīng)細胞凋亡情況，篩選出神經(jīng)細胞凋亡出現(xiàn)最早時間點，確定早期干預的最佳時間點。結(jié)果1）HE染色結(jié)果顯示，ASCI組大鼠術后1 h和3 h可見灰質(zhì)小灶性斑片狀出血；術后6 h細胞形態(tài)明顯變化，神經(jīng)細胞出現(xiàn)凋亡；術后8 h細胞損傷加重，形態(tài)進一步變小，僅見殘存的神經(jīng)細胞。2）TUNEL檢測顯示，ASCI組術后6 h細胞形態(tài)改變顯著，可見凋散在凋亡神經(jīng)細胞，與Sham組比較有顯著差異（P＜0.05）；8 h后神經(jīng)凋亡細胞數(shù)量明顯增多，與Sham組比較具有顯著性差異（P＜0.05）。結(jié)論急性脊髓損傷后6 h內(nèi)為本病最佳干預時間窗。

脊髓損傷 細胞凋亡 最佳干預時間窗

急性脊髓損傷（ASCI）是臨床常見的嚴重疾病之一，年發(fā)病率約為20～40/100萬，因其缺乏有效的治療手段，ASCI患者死亡率和致殘率都很高［1］。其發(fā)病的病因及病機復雜，神經(jīng)細胞凋亡是本病繼發(fā)性損傷重要的病理機制之一［2］。本研究通過觀察急性脊髓損傷大鼠1 h、3 h、6 h和8 h 4個時間點相應的神經(jīng)細胞病理形態(tài)學變化及神經(jīng)細胞凋亡情況，進而尋求對ASCI大鼠進行干預的最佳時間窗。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取48只健康Wistar雌性大鼠（由遼寧長生生物技術有限公司提供），體質(zhì)量（200±10）g。每日固定人工照明（12：12光/暗周期），在實驗室常規(guī)飼養(yǎng)1周。

1.2 試藥與儀器 二甲苯 （國藥，X112051）；蘇木精（Solarbio，H8070）；曙紅Y，醇溶（國藥，S23025101）；原位細胞死亡檢測工具（羅氏，11684817910）；過氧化氫（國藥，10011218）；DAB顯色液 （Solarbio，DA1010）；Triton X-100（碧云天，ST795）；打擊器（美國Impactor Model-Ⅲspinal lord contusion system）。

1.3 分組與造模 1）動物分組：將48只大鼠依據(jù)隨機數(shù)字表分為兩組4個時間點，分別為假手術組（Sham組，24只）和急性脊髓損傷組（ASCI組，24只），每組又分為1 h、3 h、6 h和8 h 4個亞組，每組6只。Sham組：僅暴露脊髓，不撞擊損傷，手術后常規(guī)飼養(yǎng)，不予任何處置。ASCI組：模型制備成功后，置于單籠飼養(yǎng)，同時不進行任何處置。2）模型制備：急性脊髓損傷模型制備［3-4］，采用打擊器打擊制作大鼠ASCI模型（T10，中度損傷）。用10%水合氯醛腹腔麻醉，常規(guī)消毒，于T10行約3 cm的縱行切口，暴露T9-11棘突，銳性分離肌肉至關節(jié)突，充分暴露棘突和椎板，在T10部位行椎板摘除術，但不破壞硬脊膜。暴露以T10為中心段脊髓，并以10 g×50mm勢能撞擊脊髓，造成該段的急性脊髓中度損傷，沖洗傷口并縫合。

1.4 觀察指標 HE染色觀察脊髓組織病理學形態(tài)變化，經(jīng)切片脫蠟至水、染色、脫水、透明、封片、鏡檢等步驟進行HE染色并鏡下觀察。TUNEL檢測脊髓組織神經(jīng)細胞凋亡，經(jīng)透化、PBS漂洗、封閉、Labeling、蘇木素復染、脫水、透明、封片鏡檢等步驟觀察神經(jīng)細胞凋亡。

1.5 統(tǒng)計學處理 應用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（±s）表示，先進行方差齊性檢驗。組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），多個樣本均數(shù)之間的多重分析行LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

圖1 各組大鼠脊髓組織病理形態(tài)學變化（HE染色，200倍）

2.1 各組脊髓組織病理形態(tài)學變化 見圖1。HE染色結(jié)果顯示，Sham組大鼠脊髓組織灰質(zhì)、白質(zhì)、脊髓前角和后角、中央管結(jié)構(gòu)清晰，細胞核形態(tài)正常，未見炎性細胞浸潤及神經(jīng)細胞變性。ASCI組中1 h和3 h可見灰質(zhì)小灶性斑片狀出血，大部分細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)清晰，僅數(shù)個細胞萎縮，偶有神經(jīng)元水腫；6 h可見細胞形態(tài)變化顯著，胞體變小，胞核固縮碎裂，胞膜皺縮、濃染，神經(jīng)細胞出現(xiàn)凋亡；8 h較6 h細胞損傷加重，僅見殘存的神經(jīng)細胞。以上結(jié)果表明，脊髓損傷后6 h神經(jīng)元出現(xiàn)凋亡形態(tài)改變。

2.2 各組TUNEL法檢測脊髓組織神經(jīng)細胞凋亡 見表1，圖2。TUNEL檢測中，標記的陽性細胞的細胞核染色呈棕褐色，正常細胞核被蘇木素復染成藍色。檢測結(jié)果顯示，Sham組神經(jīng)細胞形態(tài)正常，結(jié)構(gòu)清晰，胞質(zhì)淡染，胞核藍色，未見明顯凋亡細胞；ASCI組1 h時未見神經(jīng)細胞形態(tài)明顯變化，胞核藍染；3 h神經(jīng)細胞形態(tài)略有變化，失去正常多角形，略變圓，偶見染色質(zhì)邊集，呈斑片狀聚集核膜周圍，胞漿濃染，但細胞膜相對較完整；6 h神經(jīng)細胞形態(tài)明顯改變，多極形消失，部分細胞核裂解，染色質(zhì)分割成塊狀，可見凋亡小體出現(xiàn)，見散在凋亡細胞，與假手術組相比，差異具有顯著意義（P＜0.05）；8 h細胞進一步固縮，細胞間隙變大，殘存的神經(jīng)細胞減少，神經(jīng)細胞凋亡明顯增多，與Sham組比較差異顯著（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，大鼠ASCI后6 h脊髓組織出現(xiàn)神經(jīng)細胞凋亡，結(jié)果與HE染色所見組織病理改變相符。

表1 各組大鼠TUNEL法檢測凋亡神經(jīng)細胞數(shù)比較（±s）

表1 各組大鼠TUNEL法檢測凋亡神經(jīng)細胞數(shù)比較（±s）

與Sham組比較，*P＜0.05；與本組6 h時比較，△P＜0.05。下同。

組別 n 1 h 3 h 6 h 8 h Sham組 61.50±0.84 0.83±0.75 0.67±0.52 1.00±0.63 ASCI組 61.33±0.52 1.17±0.41 8.17±1.72*16.17±2.04*△

圖2 各組大鼠凋亡神經(jīng)細胞（TUNEL法，400倍）

3 討 論

急性脊髓損傷后引發(fā)脊髓微環(huán)境系列變化的機制十分復雜，目前研究主要目標為組織神經(jīng)細胞的凋亡，研究內(nèi)容包括一系列的炎癥反應和神經(jīng)細胞凋亡［5］、興奮性氨基酸的毒性作用、線粒體途徑產(chǎn)生的促凋亡蛋白等。萬勇［6］在研究中，將損傷后不同時間點腹腔注射重組人紅細胞生成素（rHuEPO），觀察大鼠后肢運動功能及脊髓神經(jīng)細胞凋亡情況，發(fā)現(xiàn)對急性脊髓損傷后脊髓神經(jīng)元保護作用的用藥時間窗為6 h。急性脊髓損傷后，會因遲發(fā)性神經(jīng)細胞壞死及凋亡造成繼發(fā)性損傷。研究表明［7］，當急性脊髓損傷早期，會出現(xiàn)組織出血、水腫、壞死及神經(jīng)細胞凋亡，隨后炎性細胞和膠質(zhì)細胞發(fā)生聚集，最后實質(zhì)細胞萎縮、形成慢性壞死囊腔及膠質(zhì)癱痕［8］。因此在準確時間窗對大鼠ASCI后進行干預是減少神經(jīng)細胞凋亡，降低急性脊髓損傷并發(fā)癥的發(fā)生率，促進脊髓功能恢復的關鍵。

神經(jīng)元丟失主要原因之一為細胞凋亡［9］，凋亡同樣也是具有時間依賴性。王健等［10］在研究中發(fā)現(xiàn)，急性脊髓損傷后6 h出現(xiàn)神經(jīng)細胞大量凋亡，凋亡的高峰時間從損傷后6 h開始。由此得出：早期應用藥物川芎嗪干預治療，可有效抑制脊髓損傷后大鼠神經(jīng)細胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，早期電針干預能更好的減輕大鼠ASCI細胞凋亡，可保護脊髓組織和神經(jīng)元細胞，促進神經(jīng)細胞的修復，保護部分運動功能［11］。因此，明確大鼠ASCI后神經(jīng)細胞凋亡發(fā)生的時間，最大限度挽救神經(jīng)元，有助于促進損傷后的運動功能的恢復［12-15］。本研究證實大鼠ASCI后明顯的神經(jīng)細胞凋亡出現(xiàn)在損傷后6 h，其治療的“最佳時間窗”應在損傷后6 h以內(nèi)。

［1］ 唐祎周，孫忠人，張翀.夾脊電針對脊髓損傷大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關因子IRE1影響的實驗研究［J］.針灸臨床雜志，2013，29（8）：55-58.

［2］ 李曉寧，王寧.電針對大鼠脊髓損傷后細胞凋亡PARP-1全長影響的研究［J］.針灸臨床雜志，2011，27（5）：57-59.

［3］ Alvarez-Mejia L1，Morales J.Functional recovery in spinal cord injured ratsusing polypyrrole/iodine implantsand treadmill training［J］.JMater SciMaterMed，2015，26（7）：209.

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［5］ 張紀浩，張俐.中藥對脊髓缺血再灌注損傷微環(huán)境的作用及機制研究［J］.中華中醫(yī)藥雜志，2014，29（1）：208-211.

［6］ 萬勇，徐磊.重組人紅細胞生成素治療大鼠急性脊髓損傷的用藥時間窗探討［J］.中國脊柱脊髓雜志，2010，20（9）：760-761.

［7］ 孫福榮.脊髓康對大鼠脊髓損傷后軸突再生微環(huán)境的作用機制研究［D］.南京：南京中醫(yī)藥大學，2013.

［8］ 方超，徐祝軍，楊民，等.不同時間點應用甲氨蝶呤對大鼠脊髓損傷后神經(jīng)細胞凋亡的影響［J］.中國修復重建外科雜志，2016，4（9）：466-472.

［9］ 張林，孫忠人.近10年電針治療脊髓損傷機制的實驗研究進展［J］.針灸臨床雜志，2012，1（5）：39-41.

［10］王健，賈玉柱.川芎嗪對急性脊髓損傷大鼠神經(jīng)細胞早期凋亡和Caspase-3mRNA表達的影響［J］.中華中醫(yī)藥學刊，2011，29（12）：2662-2665.

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［12］劉亞東，陳學名.大鼠脊髓損傷后大腦運動皮質(zhì)神經(jīng)元凋亡的觀察［J］.中國脊柱脊髓雜志，2013，6（4）：23-24.

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Experimental Study of the Proper Time W indow of Intervention after Acute Spinal Cord Injury

LIXiaoning，SHAN Xiaochun，WU Lei，et al. The Second Affiliated Hospital of Heilongjiang University of Chinese Medicine，Heilongjiang，Harbin 150001，China.

Objective：To observe the earliest time of neuronal apoptosis in rats after acute spinal cord injury（ASCI），and to determine the time of early intervention.M ethods：48 female Wister rats were random ly divided into the sham operation group（Sham）and acute spinal cord injury group（ASCI），and each group was divided into four subgroups：1 h，3 h，6 h and 8 h.The ratswere sacrificed at the corresponding time point after themodelwas made.HE staining was used to observe the pathological changes of the spinal cord in rats，and TUNEL staining was used to detect the apoptosis of rats to select the earliest time point of apoptosis and to determine the best time of early intervention.Results：1）HE staining showed that1 h and 3 h after operation，there was Graymatter focal patchy hemorrhage in ASCIgroup，and 6 h after operation，the cellmorphology changed obviously，and the nerve cells showed apoptosis，and 8h after operation，cellmorphological damage grew serious，further smaller，only surviving nerve cells.2）TUNEL assay showed 6 h after operation，themorphological changes of the cells were obvious，and the apoptosis was found in the apoptotic neurons.There was a significant difference compared with the Sham group（P<0.05）.8 h after operation，the number of apoptotic cells increased significantly.Compared with group Sham，the difference was significant（P<0.05）.Conclusion：The best intervention time window iswithin six hours after acute spinal cord injury.

Spinal cord injury；Apoptosis；Proper timewindow of intervention

R651.2

A

1004-745X（2017）07-1213-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.07.026

2017-03-25）

國家自然科學基金（面上）項目（81373715）