戴銘卉 孔 薇

（江蘇省南京市中醫(yī)院，江蘇 南京 210001）

·研究報告·

泄?jié)崤哦痉綄β阅I臟病大鼠模型蛋白結(jié)合型尿毒癥毒素清除的影響*

戴銘卉 孔 薇

（江蘇省南京市中醫(yī)院，江蘇 南京 210001）

目的觀察泄?jié)崤哦痉綄β阅I臟病模型大鼠代謝毒素尤其是蛋白結(jié)合型毒素的影響及優(yōu)勢。方法將32只SD大鼠隨機分為4組：空白組、模型組、腹膜透析組、泄?jié)崤哦痉浇M，各組按相應(yīng)藥物劑量灌胃，腹透；造模第8周末檢測各組血清尿素、肌酐、尿酸、胱抑素C含量，運用高效液相色譜-熒光檢測法檢測血清硫酸吲哚酚含量。結(jié)果與空白對照組相比，模型組血清尿素、肌酐含量明顯升高（P<0.05）；與模型組相比，泄?jié)崤哦痉浇M尿素、肌酐、尿酸、胱抑素C含量明顯降低（P<0.05）；與腹透組相比，泄?jié)崤哦痉浇M尿素、胱抑素C、尿酸含量明顯降低（P<0.05）；與模型組相比，泄?jié)崤哦痉浇M硫酸吲哚酚含量明顯降低 （P<0.05）；與腹透組相比，泄?jié)崤哦痉搅蛩徇胚岱雍棵黠@降低（P<0.05）。結(jié)論泄?jié)崤哦痉娇汕宄蚨景Y毒素，延緩腎損害進展，其原因可能與蛋白結(jié)合型代謝毒素的清除有關(guān)。

泄?jié)岱?慢性腎臟病 尿毒癥毒素

慢性腎臟病是多種因素引起的腎臟功能障礙和（或）結(jié)構(gòu)改變所導(dǎo)致的一系列臨床綜合征。近年來成為嚴重損害人類健康的慢性殺手［1］。慢性腎臟病患者的腎功能不斷減退，具有毒性的代謝產(chǎn)物因無法排出而潴留在機體內(nèi)，導(dǎo)致各種病理改變。這些代謝廢物通稱為尿毒癥毒素，主要分為4類：小分子毒素、中分子毒素、與蛋白結(jié)合的小分子化合物、蛋白質(zhì)等。腎替代是慢性腎臟病的常用治療手段，如血液透析，腹透透析等，成本均較高，且對于蛋白結(jié)合型毒素清除率較低，易影響患者生活質(zhì)量。傳統(tǒng)中醫(yī)典籍中并無慢性腎臟病病名的記載，臨床癥狀散見于“水腫”“癃閉”“關(guān)格”等病證中。慢性腎臟病最重要病機是濁毒內(nèi)蘊，也是影響預(yù)后的主要因素。因此筆者根據(jù)《黃帝內(nèi)經(jīng)》中“開鬼門，潔凈府，去菀陳莝”的理論為治則，予泄?jié)崤哦痉街委熉阅I臟病，清除硫酸吲哚酚等蛋白結(jié)合型尿毒癥毒素取得良好療效。本研究通過觀測泄?jié)崤哦痉綄Ω黝愋湍蚨景Y毒素的影響差異，探索中醫(yī)藥治療慢性腎臟病的作用靶點，為臨床治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級雄性SD大鼠32只，體質(zhì)量（180±30）g，由南京中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，動物許可證號：SCXK（浙）2014-0001。

1.2 藥物與試劑

泄?jié)崤哦痉剑ńM成：生大黃、生牡蠣、蒲公英、生槐米、六月雪、附子，為江陰天江藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的中藥顆粒劑）；2.5%腹膜透析液（廣州百特醫(yī)療用品有限公司）；硫酸吲哚酚標(biāo)準(zhǔn)品（美國Sigma公司）；腺嘌呤（美國AMRESCO公司）；甲醇 （山東瑞星化工有限公司）；乙腈（德國Merck公司）；三氟乙酸（濟南瑞福化工有限公司）；

1.3 主要儀器

Waters515型高效液相色譜儀，配717型自動進樣器、2475型熒光檢測器 （美國Waters公司）、BDSHy-Persil C18色譜柱 （大連依利特）、METTLER TOLEDO AL-204電子分析天平（梅特勒儀器上海有限公司）

1.4 分組與造模

按照隨機數(shù)字表隨機分為空白組、模型組、泄?jié)崤哦痉浇M、腹透組。每組8只，于溫度、濕度恒定的動物房中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。從實驗第1天開始，除了空白對照組，其余各組大鼠每日上午灌服腺嘌呤，劑量200mg/（kg·d），至第4周結(jié)束。第4周末，每組隨機抽取2只大鼠，目內(nèi)眥取血，檢測肌酐、尿素水平，提示造模成功［2］。從第5周開始除了空白組，其余各組大鼠隔日上午灌服腺嘌呤，劑量200mg/（kg·d），至第7周結(jié)束。第8周開始各組均停止腺嘌呤灌服。整個實驗過程所有大鼠進水及飲食均不受限制。

1.5 給藥方法

實驗開始后第1天根據(jù)分組分別給予相應(yīng)藥物干預(yù)，根據(jù)藥理學(xué)實驗動物給藥方法，均以成人劑量（70 kg/d）的6.3倍藥量，即泄?jié)崤哦痉筋w粒劑（生大黃2.31 g/d，附子0.56 g/d，生槐花2.1 g/d，六月雪0.35 g/d，蒲公英1.4 g/d，生牡蠣0.175 g/d）。以上中藥顆粒溶于80mL蒸餾水中制成混懸液，予泄?jié)崤哦痉浇M大鼠灌胃10mL/d，連續(xù)8周。腹透組大鼠右下腹注入2.5%腹膜透析液，20mL/d，連續(xù)8周［3］。模型組大鼠自實驗開始的第1天，予蒸餾水10 mL/d灌胃，每天1次，連續(xù)8周。空白組大鼠自實驗開始的第1天，予蒸餾水10mL灌胃，每天2次，至第4周末。自第5周開始，隔日上午予蒸餾水10mL灌胃，每天下午予蒸餾水10mL灌胃，至第7周末。第8周予每天下午蒸餾水10mL灌胃。

1.6 標(biāo)本采集與檢測

第8周末采集標(biāo)本，提前禁食、禁水12 h。0.3mL/ 100 g 10%水合氯醛腹腔注射麻醉，隨后予腹主動脈采血，保存于無肝素采血管中，靜置20min，3000 r/min離心10min后送檢；采血結(jié)束后摘取腎臟，矢狀面剖開，4%中性甲醛固定24 h，制作病理切片，HE染色備用。

1.6.1 生化檢測 大鼠尿素、肌酐、尿酸、胱抑素C委托南京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗科檢測。

1.6.2 硫酸吲哚酚檢測 采用高效液相色譜-熒光分析法。1）標(biāo)準(zhǔn)品儲存液的制備。甲醇溶解并定容硫酸吲哚酚鉀鹽對照品23.71 mg，配得硫酸吲哚酚濃度為800μg/mL的貯備液，用乙腈稀釋成最終質(zhì)量濃度分別為80，40，20，10，5，0.5，0.1μg/mL的貯備液備用。2）色譜條件。流動相為磷酸二氫鈉緩沖液（0.1%三氟乙酸，pH2.5）-乙腈（92∶8）；流速1.0mL/min；柱溫30℃；樣品溫度6℃；檢測波長：λex=280 nm，λem=390 nm。3）樣品處理方法：3000 r/min離心10 min分離血清，-20℃保存。小心吸取血清100μL于干凈試管中，加入300μL 0.2%三氟乙酸-乙腈（10∶90）沉淀蛋白，漩渦混勻30 s后離心（12000 r/min，8 min，4℃），吸取上層清液200μL，微孔濾膜濾過后進行分析。

1.6.3 腎小管間質(zhì)纖維化指數(shù)（TIFI） TIFI根據(jù)纖維化程度分為4級（0～3級）。具體評分方法如下（20倍目鏡下）。1）0級，表示無明顯小管間質(zhì)病變；2）1級，表示病變程度小于25%；3）2級，即灶狀損傷，病變程度25%～75%；4）3級，即多灶狀損傷，代表病變程度大于75%。分值由低到高，提示腎小管間質(zhì)纖維化由輕到重。以上分析均由未知分組的南京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院病理科完成。TIFI=［（1×X1+2×X2+3×X3）/10］（X表示病變腎小管間質(zhì)視野數(shù)）

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況

空白組大鼠動作敏捷，無脫毛，體質(zhì)量增長正常，尿量少，色淡黃，大便成形偏硬，飲水飲食正常，實驗過程中死亡1只。模型組大鼠漸出現(xiàn)精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，活動遲緩，皮毛無光澤，毛量偏少，食欲差，飲水量多，尿量多，大便稀，體質(zhì)量增長緩慢。實驗過程中死亡2只。腹透組整體狀況與模型組相比有改善，實驗過程死亡2只。泄?jié)崤哦痉浇M在毛色、精神狀態(tài)、活動性、體質(zhì)量方面較模型組明顯改善。實驗過程死亡2只。

2.2 各組大鼠生化指標(biāo)

見表1。與空白組相比，模型組血清尿素、肌酐含量明顯升高（P＜0.05）；與模型組相比，腹透組尿素、肌酐、胱抑素C含量明顯降低（P＜0.05）；與模型組相比，泄?jié)崤哦痉浇M尿素、肌酐、尿酸、胱抑素C含量明顯降低（P＜0.05）；與腹透組相比，泄?jié)崤哦痉侥蛩?、胱抑素C、尿酸含量明顯降低（P＜0.05）。

表1 泄?jié)崤哦痉綄β阅I臟病大鼠尿素、肌酐、尿酸及胱抑素C的影響（±s）

表1 泄?jié)崤哦痉綄β阅I臟病大鼠尿素、肌酐、尿酸及胱抑素C的影響（±s）

與空白組比較，*P＜0.05；與模型組比較，△P＜0.05：與泄?jié)崤哦痉浇M比較，▲P＜0.05。下同。

組 別 n 尿素（mmol/L） 肌酐（μmol/L） 尿酸（μmol/L）胱抑素C（mg/L）空白組 6模型組 6泄?jié)崤哦痉浇M 6 5.55±0.55 30.00±2.92 - -50.21±7.84*211.00±41.71*173.50±50.59 1.97±0.27 26.36±3.91△108.16±18.10△99.83±7.35△1.26±0.14△腹透組 634.54±10.27△▲137.50±31.04△150.50±4.96△1.64±0.19△▲

2.3 各組大鼠硫酸吲哚酚測定結(jié)果比較 見表2。與模型組相比，泄?jié)崤哦痉浇M硫酸吲哚酚含量明顯降低（P＜0.05）；與腹透組相比，泄?jié)崤哦痉搅蛩徇胚岱雍棵黠@降低（P＜0.05）。

表2 各組大鼠硫酸吲哚酚測定結(jié)果比較（±s）

表2 各組大鼠硫酸吲哚酚測定結(jié)果比較（±s）

組別 n IS模型組 6泄?jié)崤哦痉浇M 6 44.15±16.41 18.14±4.90△腹透組 637.28±10.03▲

2.4 各組大鼠腎臟病理指標(biāo)

2.4.1 肉眼觀察 空白組大鼠腎臟蠶豆大小，暗紅色，質(zhì)韌光滑。其余組大鼠腎臟明顯肥大，色白，粗糙不平。

2.4.2 光鏡觀察 見圖1。光鏡下空白組大鼠未見硬化腎小球；其余各組大鼠腎臟產(chǎn)生腺嘌呤異物肉芽腫，大量炎癥細胞浸潤，腎間質(zhì)。纖維化，腎小管囊性擴張，毛細血管數(shù)量減少，大量管腔閉塞，系膜增生明顯，以上變化符合腺嘌呤模型大鼠腎臟病理變化［4］。模型組大鼠腎臟病理改變最明顯。

圖1 各組大鼠腎臟組織（HE染色，200倍）

2.4.3 各組大鼠TIFI比較 見表3。泄?jié)崤哦痉浇M和腹透組TIFI均較模型組低（均P＜0.05）。

表3 各組大鼠TIFI比較（±s）

表3 各組大鼠TIFI比較（±s）

組別 n TIFI模型組 6泄?jié)崤哦痉浇M 6 25.33±1.21 12.00±0.89△腹透組 618.00±0.63△

3 討 論

臨床近半數(shù)的慢性腎臟病患者首診于消化科，原因是此類患者通常會出現(xiàn)腹痛腹脹，食欲不振，大便稀溏等癥狀。根據(jù)辨證，屬于濕濁、濁毒范疇。因此，及時予以藥物泄?jié)崤哦?，清除腸道毒素蓄積是治療慢性腎臟病的關(guān)鍵。

本方緊扣“濁毒”病機以大黃為君藥，共襄清熱泄?jié)崂麧裰e。大黃是清熱瀉下的要藥，現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，大黃可降低血氨及肝臟荷爾蒙生成；機體氮質(zhì)的再利用率也可因大黃增強谷氨酰胺合成酶的活性而提高；大黃可以抑制炎癥浸潤，抑制促纖維化因子，延緩腎組織纖維化，下調(diào)殘腎代謝率［5-7］。同時，牡蠣有收斂固澀的功效；附子能促進血尿素氮的排泄，改善電解質(zhì)紊亂；槐花清熱涼血；蒲公英、六月雪清熱解毒利濕；諸藥合用，附子燥熱得制，大黃無瀉下過度之虞。實驗顯示，泄?jié)崤哦痉浇M較模型組，硫酸吲哚酚含量有明顯差異，提示泄?jié)崤哦痉娇山档痛笫笱逯辛蛩徇胚岱雍?。表明泄?jié)崤哦痉綄Υ祟惖鞍捉Y(jié)合型尿毒癥毒素的清除具有一定優(yōu)勢。體現(xiàn)了標(biāo)本并治的原則，達到延緩腎損害進展的目的。

當(dāng)前尿毒癥毒素研究的難點與熱點是蛋白結(jié)合型毒素，這類毒素因為可與白蛋白緊密結(jié)合而使得常用的血液透析等治療方法難以將其清除，隨著疾病的發(fā)展不斷于機體內(nèi)累積，造成一系列的臨床癥狀及多系統(tǒng)受累。硫酸吲哚酚屬于吲哚類蛋白結(jié)合型毒素的代表之一。機體攝入的食物中含有色氨酸，這類氨基酸是硫酸吲哚酚的來源。腸道與肝臟是機體合成硫酸吲哚酚最主要的兩個臟器。吲哚酚是色氨酸側(cè)鏈被大腸埃希菌在結(jié)腸中氧化后的產(chǎn)物。結(jié)腸把大量此類氧化產(chǎn)物重新吸收，進入肝臟，硫酸鹽酯化吲哚酚后生成硫酸吲哚酚。健康人群血清硫酸吲哚酚濃度通常不大于1.9μmol/L。腎臟是硫酸吲哚酚最主要的排泄器官。模型組大鼠腎臟病理示嚴重腎臟間質(zhì)纖維化。根據(jù)近期研究結(jié)論，慢性腎臟病的進展速度，腎臟功能的損傷程度，均與腎間質(zhì)纖維化正相關(guān)。腎小管上皮細胞中得細胞因子基因表達上調(diào)，促進轉(zhuǎn)化生長因子，單核細胞趨化和激活因子誘導(dǎo)腎小管上皮細胞產(chǎn)生轉(zhuǎn)化，細胞外基質(zhì)沉積增多。硫酸吲哚酚正是通過活化腎臟局部多種炎癥細胞浸潤，從而達到加速間質(zhì)纖維化的腎毒性作用［8］。此外，硫酸吲哚酚亦能遏制促紅細胞生成素的生成，加重腎性貧血。慢性腎臟病患者致死的首要并發(fā)癥是心血管意外。多數(shù)蛋白結(jié)合型尿毒癥毒素同時具有心血管毒性，其中便包括硫酸吲哚酚［9］。其誘使全身氧化應(yīng)激反應(yīng)是機體動脈硬化的中心環(huán)節(jié)［10］。嚴重影響慢性腎臟病患者的遠期預(yù)后。泄?jié)犷愔兴幰蚓哂袑?dǎo)瀉、吸附［11］、活血、排毒等功效而被經(jīng)常用于慢性腎臟病的中醫(yī)臨床治療中。大黃作為其中應(yīng)用最為廣泛的一味中藥，除具上述作用外，更因其富含多糖等數(shù)種益腎成分［12］，成為治療慢性腎臟病的要藥及研究熱點。

然而，中醫(yī)藥改善腎臟功能的機制長久以來缺乏系統(tǒng)深入的研究，多從治療經(jīng)驗以及藥物性味推導(dǎo)而來。實驗結(jié)果顯示泄?jié)崤哦痉皆诮档吐阅I臟病大鼠血清肌酐水平方面與腹膜透析無明顯差異，但對于降低硫酸吲哚酚的作用卻優(yōu)于腹膜透析，提示對于蛋白結(jié)合類毒素的有效清除可能是泄?jié)崤哦痉窖泳從I損害的原因?？赡芘c以下機制相關(guān)：1）大黃可改善消化道微循環(huán)，增加局部血流灌注，提高血漿滲透壓，降低毛細血管通透性，降低腸道缺血性損傷的發(fā)生率。2）抗自由基，防止多臟器功能衰竭。3）大劑量大黃作用于胃腸黏膜引起強烈的人工炎癥，導(dǎo)致腸膜黏上皮細胞大量增生，絨毛融合，大量炎細胞浸潤，腸腔內(nèi)黏液的分泌功能增強，在胃腸黏膜表面形成保護膜促進腸黏膜杯狀細胞的增生［13］。4）大黃能夠抑制大腸桿菌等腸道條件致病菌和腸球菌等有害菌，顯著降低體內(nèi)內(nèi)毒素水平。大黃作為清熱瀉下的代表藥物，可刺激腸蠕動，增強胃腸道運動功能［14］。

實驗以腹膜透析作為對照組。腹膜透析是終末期腎臟病患者腎替代治療常用治療手段，具有易于操作，對血流動力學(xué)影響較小的優(yōu)勢，對蛋白結(jié)合類毒素具有一定的清除效果，毒素代謝的方式是可能原因［15］。

泄?jié)崤哦痉娇梢越档吐阅I臟病大鼠尿毒癥毒素水平，尤其在硫酸吲哚酚的清除方面具有一定優(yōu)勢，也為中藥清除蛋白結(jié)合型毒素提供了新的思路。

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Effects of Xiezhuo Paidu Decoction on Protein Bound Urem ia Toxin in Ratsw ith Chronic K idney Disease

DAIMinghui，KONGWei.Nanjing Hospital of Traditional Chinese Medicine，Jiangsu Province，Jiangsu，Nanjing 210001，China.

Objective：To study the regulatory effects and advantages of Xiezhuo Paidu Decoction on protein bound uremia toxin in ratswith chronic kidney disease.M ethods：32 SD ratswere divided in to the blank group，themodel group，peritoneal dialysis group and Xiezhuo Paidu Decoction group.Each group

gavage and peritoneal dialysis according to the corresponding dose.After 56 days’treatment，serum urea，creatinine，uric acid，Cystatin C were measured，and the content of indoxyl sulfate in serum was determined by HPLC-MS.Results：Compared with the blank control group，the serum urea and creatinine levels in themodel group increased significantly（P<0.05）.Compared with the model group，the contents of urea，creatinine，uric acid and cystatin C decreased significantly in Xiezhuo Paidu Decoction group（P<0.05）.Compared with the peritoneal dialysis group，the contents ofurea，cystatin C and uric acid decreased significantly in Xiezhuo Paidu Decoction group（P<0.05）.Compared with themodel group and the peritoneal dialysis group，the contentof indoxyl-sulfate decreased obviously in Xiezhuo Paidu Decoction group（P<0.05）.Conclusions：Xiezhuo Paidu Decoction can clear uremic toxins and delay the progression of renal damage，whichmay be related to the elimination ofprotein boundmetabolic toxins.

Xiezhuo Method；Chronic kidney disease；Uremia toxin

R285.5

A

1004-745X（2017）07-1160-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.07.009

2017-04-19）

江蘇省南京市科技發(fā)展計劃項目（201503032）

△通信作者（電子郵箱：kw-9009@163.com）