夏中友張宗平李云祥張萌伍季**

1.南充市中心醫(yī)院，川北醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院泌尿外科（四川南充 637000）；2. 川北醫(yī)學(xué)院

ING4和CD34蛋白在人前列腺癌組織中的表達(dá)及其相關(guān)性研究*

夏中友1張宗平1李云祥1張萌2伍季1**

1.南充市中心醫(yī)院，川北醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院泌尿外科（四川南充 637000）；2. 川北醫(yī)學(xué)院

目的 探討ING4及CD34蛋白在人前列腺癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性。方法 采用免疫組織化學(xué)ElivsionTM Plus二步法檢測28例人前列腺癌及32例良性前列腺增生組織中ING4及CD34的表達(dá)情況，分析其結(jié)果與前列腺癌病理分級及危險等級關(guān)系。結(jié)果 ING4基因蛋白在人前列腺癌組織中的陽性表達(dá)率明顯低于良性前列腺增生組織，且隨腫瘤病理分級、PSA及臨床分期的增加而降低。而CD34標(biāo)記的微血管密度（microvessle density，MVD）在前列腺癌組織中表達(dá)明顯較良性前列腺增生組織高，其MVD值隨腫瘤病理分級及危險等級增加而升高。前列腺癌組織中ING4表達(dá)與MVD值呈負(fù)相關(guān)，r值為-0.827，相關(guān)性具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 ING4基因蛋白在人前列腺癌組織表達(dá)異常，可能參與了腫瘤的發(fā)生及進展，同時可以作為前列腺癌臨床評價診斷、指導(dǎo)治療的輔助指標(biāo)之一。

ING4; CD34; 前列腺癌; 免疫組織化學(xué)

ING4（inhibitor of growth family memember 4）基因作為ING家族(inhibitor of growth family)的新成員，已被認(rèn)為是一種II型腫瘤抑制因子。ING4的C端與其他ING成員具有高度的同源性，具有一個核定位信號序列（nuclear localization sequence，NLS）及一個植物同源結(jié)構(gòu)域（planthomeodomain，PHD）[1]。ING4參與基因的調(diào)節(jié)、細(xì)胞循環(huán)的調(diào)控及血管生成，從而抑制腫瘤細(xì)胞的生長及侵襲。研究表明MVD為評價實體腫瘤血管生成的金標(biāo)準(zhǔn)， CD34的陽性率高、表達(dá)強，其敏感性和穩(wěn)定性最好，可作為檢測MVD的首選標(biāo)記物。本實驗采用免疫組化檢測前列腺癌組織中ING4蛋白的表達(dá)及CD34標(biāo)記的MVD，并結(jié)合兩者的相關(guān)數(shù)據(jù)探討其在前列腺腫瘤發(fā)生發(fā)展中的相關(guān)性。

材料及方法

一、臨床資料

（一）實驗組

選擇南充市中心醫(yī)院（川北醫(yī)學(xué)院第二臨床學(xué)院）病理科2012年1月至2014年12月經(jīng)尿道前列腺切除術(shù)（TURP）并有完整臨床資料的石蠟標(biāo)本，包括前列腺癌28例，年齡在59～86歲，平均為72歲。按照Gleason評分系統(tǒng)的前列腺癌病理分級，中分化（Gleason 5～6分）3例，低分化（Gleason 7～10分）25例。根據(jù)2014年中國泌尿外科指南中前列腺危險因素等級將前列腺癌分為低危（Gleason評分≤6分、PSA＜10ng/mL、≤T2a期）、中危（Gleason評分7分、PSA 10～20ng/mL、T2b期）及高危（Gleason評分≥8分、PSA＞20ng/mL、≥T2c期），其中低危組3例、中危組6例、高危組19例。

（二）對照組

良性前列腺增生（benign prostatic hyperplasia, BPH）蠟塊標(biāo)本32例，年齡在59～88歲，平均為73歲。

二、主要試劑

鼠抗人ING4蛋白多克隆抗體（美國Abcam公司）稀釋濃度為l:150；鼠抗人CD34單克隆抗體（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司）；鼠兔通用即用型MaxvisionTm二抗及DAB顯色試劑（福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司）。

三、方法

（一）切片制備

4μm切片，用于免疫組織化學(xué)顯色。將切片置于病理組織漂烘儀50℃烘干。

（二）免疫染色

經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復(fù)，余下步驟按EliVisionTMplus兩步法試劑盒操作。用已知正常睪丸組織陽性切片作陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。

四、結(jié)果判定

（一）觀察者要求

要求觀察者在臨床和病理資料不知曉的情況下進行觀察，兩位觀察者重復(fù)觀察同一張病理切片進行結(jié)果判定。

（二）ING4陽性染色結(jié)果

ING4 陽性表達(dá)以細(xì)胞核和（或）細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為準(zhǔn)；使用半定量的評分系統(tǒng)來評估抗體的染色效果，計數(shù) 5 個高倍視野或 500 個細(xì)胞。按染色強度計分：0 分為無色，1 分為淡黃色，2 分為棕黃色，3 分為棕褐色；按陽性細(xì)胞所占百分比計分：0 分為陰性，1分為陽性細(xì)胞數(shù) ≤10% ，2 分為陽性細(xì)胞數(shù) 11%～50% ，3分為陽性細(xì)胞數(shù) 51%～75%，4分為陽性胞數(shù)＞75% ；染色強度計分與陽性細(xì)胞所占百分比計分乘積：0～2 分為（-），3～5 分為（+），6 ～9分為（+ +），10～12分為（+ + +）。

（三）CD34陽性染色結(jié)果

CD34抗體染色微血管密度（MVD）計數(shù)標(biāo)準(zhǔn)：以與背景有明顯區(qū)別的任何一個棕色染色內(nèi)皮細(xì)胞或細(xì)胞叢計數(shù)為一個血管，只要結(jié)構(gòu)不相連續(xù)，分支結(jié)構(gòu)也可計數(shù)為1個血管。首先在×100光鏡下尋找腫瘤組織中血管密度最高的區(qū)域，然后在×200光鏡下計數(shù)4個視野的微血管數(shù)，求其平均值作為該區(qū)域平均微血管數(shù)。將CD34標(biāo)記的MVD值均數(shù)90界定為區(qū)分MVD高低的標(biāo)準(zhǔn)。

五、統(tǒng)計分析

用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.01具有顯著意義。計數(shù)資料采用x2檢驗；計量資料以±s表示，用t檢驗；各陽性指標(biāo)的相關(guān)性分析采用用Spearman等級相關(guān)分析。

結(jié)果

一、ING4在BPH及PCaa組織中的表達(dá)

ING4主要表達(dá)于細(xì)胞核，在胞質(zhì)及間質(zhì)中同樣有少許表達(dá)。BPH中ING4主要表達(dá)于細(xì)胞核中，而PCa組織中胞漿染色較明顯，在分化較好的PCa中有少許胞核著色（見圖1、圖2和圖3）。ING4在BPH及PCa中陽性表達(dá)率分別為93.75%、50.00%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。在病理分級中中分化PCa中陽性表達(dá)率為100%，低分化PCa中陽性表達(dá)率為41.66%。PCa中PSA值為＜10ng/mL、10～20ng/mL及PSA大＞20ng/mL，其ING4陽性表達(dá)率分別為100%、85.71%、23.53%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表2。隨PCa臨床分期增加，ING4表達(dá)率呈下降趨勢，分別為100%、76.92%、8.33%，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表3。

圖1 ING4 在BPH組織中的表達(dá)（IHC×200）

圖2 ING4 在中分化PCaa組織中的表達(dá)（IHC×200）

圖3 ING4 在低分化PCaa組織中的表達(dá)（IHC×200）

表1 ING4 在BPH及PCaa中的染色結(jié)果

表2 ING4 在不同病理分級及不同PSA的PCaa中的染色結(jié)果

表3 ING4 在不同臨床分期前列腺癌組織中的表達(dá)

二、CD34標(biāo)記的MVD在BPH組織及PCaa組織中的表達(dá)

CD34主要標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，其主要表達(dá)于細(xì)胞漿中，本實驗中CD34標(biāo)記的微血管密度按DIMITRIOS[24]標(biāo)準(zhǔn)，PCa組織中微血管密度明顯高于BPH組織（見圖4、圖5、圖6），在BPH中微血管密度≥90的占32.26%，PCa中微血管密度≥90的占78.57%，且在癌組織區(qū)域其血管密度更為密集，兩者間比較具有明顯差異（P＜0.05），見表4。PSA值為＜10ng/mL、10～20ng/mL及PSA大＞20ng/mL的前列腺癌組織中CD34標(biāo)記的MVD值分別為72.92±16.26、90.42±6.38、121.30±34.71，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表5。病理分級中，中分化與低分化PCa中MVD值分別為72.92±12.26、114.84±33.68，兩者之間差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。隨PCa臨床分期增加，MVD值呈升高趨勢，分別為72.92±16.26、98.73±14.47、132.69±39.73，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表6。

圖4 在BPH組織中CD34的表達(dá)（IHC×200）

圖5 在中分化PCa組織中CD34的表達(dá)（IHC×200）

圖6 在低分化PCaa組織中CD34的表達(dá)（IHC×200）

表4 CD34標(biāo)記的MVD在良性前列腺增生及前列腺癌中的表達(dá)

表5 CD34 標(biāo)記的MVD在不同病理分級及不同PSA前列腺癌中的表達(dá)

表6 CD34 在不同臨床分期前列腺癌組織中的表達(dá)

三、PCaa組織中ING4蛋白表達(dá)與CD34標(biāo)記的MVD值之間相關(guān)性

隨著PCa病理分級及危險等級的增加，ING4基因表達(dá)逐漸降低，而CD34標(biāo)記的MVD值逐漸增加，等級相關(guān)分析示：在PCa組織中ING4的表達(dá)與CD34標(biāo)記的MVD值呈負(fù)相關(guān)，r值為-0.827，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表7。

表7 ING4 與CD34在PCa組織中表達(dá)的相關(guān)性

討論

前列腺癌（prostate cancer, PCa）是西方國家最常見的男性惡性疾病，美國癌癥協(xié)會2015年統(tǒng)計結(jié)果顯示前列腺癌居男性癌癥發(fā)病率首位，死亡率居第二位[2]。在我國前列腺癌發(fā)病率相對較低，但近年來也呈增高趨勢，且大部在初診時已進入晚期或發(fā)生轉(zhuǎn)移[3]。手術(shù)、放療及激素輔助治療對于局限性前列腺癌療效較理想，其5年生存率達(dá)到95%；而發(fā)生骨轉(zhuǎn)移或遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移的晚期前列腺癌病人，以及激素非依賴性前列腺癌，上述治療不佳，且5年生存率低于28%[4]，因此需尋求新的治療策略及輔助治療措施改善臨床結(jié)果。對于腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)機制尚不清楚。

隨著對癌癥發(fā)生及進展機制的深入研究，更多具有生長抑制及細(xì)胞凋亡作用的基因相繼被發(fā)現(xiàn)。生長抑制因子ING基因家族成為腫瘤生長抑制基因的研究熱點。20世紀(jì)90年代Garkavtsev[5]等克隆出ING1基因，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染方式檢測其在乳腺癌中表達(dá)是降低的，并推測該基因可能對腫瘤細(xì)胞存在抑制作用。隨后相繼發(fā)現(xiàn)了ING2、ING3、ING4及ING5基因，并被確認(rèn)為腫瘤抑制基因[5,6]。ING4基因在2004年Nature雜志上正式確認(rèn)為一種重要的腫瘤抑制因子[5]。國內(nèi)外文獻報告在宮頸癌[7]、結(jié)腸癌[8]、肺癌[1]等腫瘤中ING4表達(dá)降低或缺失，并與腫瘤臨床分期、病理分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，表明ING4基因可能在腫瘤發(fā)生及發(fā)展中具有重要作用。本實驗研究同樣發(fā)現(xiàn)在PCa組織中ING4表達(dá)明顯低于BPH組織，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且隨腫瘤病理分級、危險等級（結(jié)合Gleason評分、PSA及臨床分期結(jié)果）而增加，ING4表達(dá)隨之降低。我們還發(fā)現(xiàn)在BPH組織中ING4主要表達(dá)于細(xì)胞核，而PCa中主要為胞漿著色，且隨腫瘤惡性程度增加，其細(xì)胞漿著色越淺，甚至在低分化PCa組織中存在ING4表達(dá)的缺失，這與Wang等[1]在肺癌研究中相符。ING4基因在腫瘤細(xì)胞漿表達(dá)存在差異的原因可能與ING4突變體ING4-V2表達(dá)有關(guān)，由于ING4-V2變異體缺乏完整的NLS區(qū)域，NLS區(qū)的突變可以轉(zhuǎn)移ING4的核定位區(qū)，導(dǎo)致其在腫瘤細(xì)胞漿中表達(dá)增加。

ING4基因抑制腫瘤生長的機制可能與以下有關(guān)：（1）ING4基因激活P21/waf1啟動子，調(diào)節(jié)P53功能，促進細(xì)胞凋亡[9]；（2）ING4與NF-κB的p65亞基發(fā)生結(jié)合，從而抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄活性，以及通過PHD區(qū)域在缺氧下抑制HIF-1α活性，間接降低了IL-8 的表達(dá)，導(dǎo)致新生血管形成減少[10,11]；（3）抑制由原癌基因MYCN 或 MYC 過度表達(dá)引起的細(xì)胞間接觸抑制的喪失[12]；（4）ING4在腫瘤中的低表達(dá)及其功能的丟失使FasL在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，從而幫助黑色素瘤細(xì)胞逃脫免疫監(jiān)視，進而誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞的凋亡以及導(dǎo)致Fas表達(dá)的下降，使腫瘤避免T淋巴細(xì)胞的攻擊。另外，其也能夠增強Fas/FasL的表達(dá)，從而促進其下游分子如Caspase-8和Bid促凋亡蛋白的表達(dá)，最終激活凋亡的外源路徑[13]。

大部分實體腫瘤的生長完全依賴于血管。CD34表達(dá)于早期淋巴造血干細(xì)胞、祖細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、胚胎纖維母細(xì)胞和某些神經(jīng)組織的細(xì)胞，近些年研究已經(jīng)證實CD34在正常及腫瘤的血管內(nèi)皮細(xì)胞中都有表達(dá)，是與腫瘤微小血管形成密切相關(guān)的抗原，已成為目前較為敏感的血管標(biāo)記物[14]。研究發(fā)現(xiàn)，在口腔黑色素瘤[15]、甲狀腺癌等[16]腫瘤中MVD值均高于正常組織，隨臨床分期增加及分化程度的降低腫瘤組織中微血管計數(shù)升高，并且MVD值較高的腫瘤預(yù)后較差，提示MVD值可作為判斷腫瘤患者預(yù)后的一個指標(biāo)。本實驗以CD34標(biāo)記的MVD在PCa中明顯高于BPH，微血管密度隨病理分級的增加及危險等級的增加而增加，表明PCa侵襲性越強其MVD值越高，這與之前的研究是相符合的。已有研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌、乳腺癌中ING4基因表達(dá)與MVD呈負(fù)相關(guān)，隨腫瘤臨床分期及病理分級增加，其MVD值越高，而ING4蛋白表達(dá)呈下降趨勢[7,8]。本實驗同樣得出在前列腺癌組織中ING4基因的表達(dá)與MVD呈負(fù)相關(guān)，隨PCa病理分級及危險等級增加，ING4表達(dá)下降，而MVD值逐漸增加。這表明ING4在調(diào)節(jié)血管形成通路中可能具有潛在的作用，參與了腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移。

腫瘤的的發(fā)生及發(fā)展是多基因、多因素作用的結(jié)果，本實驗發(fā)現(xiàn)ING4在PCa組織中表達(dá)減少或缺失，以及與MVD表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，可得出ING4的缺失對腫瘤血管的生成具有促進作用，其可能參與了前列腺癌的發(fā)展。目前對于ING4在調(diào)節(jié)血管形成的具體分子機制仍不清楚，但我們認(rèn)為對ING4基因研究可為今后前列腺癌的臨床診斷及治療提供理論依據(jù)及方向。

1Wang QS, Li M, Zhang LY, et al. Down-regulation of ING4 is associated with initiation and progression of lung cancer. Histopathology 2010; 57(2):271-281

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3曹希亮, 高江平. 治療晚期前列腺癌藥物治療研究進展.解放軍醫(yī)藥雜志 2013;25(2): 59-63.

4劉俊, 胡衛(wèi)列, 宋波. 雄激素非依賴性前列腺癌發(fā)生機制研究進展. 中國男科學(xué)雜志 2009; 23(8): 66-69

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9Shiseki M, Nagashima M, Pedeux RM, et al. p29ING4 and p28ING4 bind to p53 and p300 and enhance p53 activity. Cancer Res 2003; 63: 2373-2378

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（2017-01-11收稿）

Expressions of ING4 and CD34 protein in human prostate cancer and their clinical signif cance＊

Xia Zhongyou1, Zhang Zhongping1, Li Yunxiang1, Zhang Meng2, Wu Ji1**
1. Department of Urology,Second Clinical College of North Sichuan Medical College,Nanchong Central Hospital of Sichuan Province, Nanchong 637000, China; 2. North Sichuan Medical College

Objective To investigate the expressions of ING4 and CD34 protein in prostate cancer (PCa) and explore their clinical significance. Methodss The expressions of CD34 and ING4 in 28 prostate cancer tissues and 32 benign prostatic hyperplasia tissues were examined by immunohistochemistry, and the correlation between the results and the pathological grade and dangerous grade of prostate cancer was further analyzed. Resultss The positive expression rate of ING4 gene in prostate cancer tissues was signif cantly lower than that of benign prostatic hyperplasia tissues, and ING4 expression decreased as tumor pathological grade, PSA level and clinical stage developed. MVD (microvessle density) in prostate cancer tissues was signif cantly higher than that of benign prostatic hyperplasia tissues, and MVD value increased as tumor pathological grade and risk level increased. ING4 was negatively correlated with the MVD(r = -0.827), which was statistically signif cant (P<0.05). Conclusion Abnormal expression of ING4 may contributed to the occurrence and progression of prostate cancer , and it can be an indicator for prostate cancer diagnosis and treatment.

s ING4; CD34; prostate cancer; immunohistochemistry

:10.3969/j.issn.1008-0848.2017.02.002

R 737.25

資助：南充市科技局資助項目（14A0071）

**通訊作者，E-mail: Wuji2168@sina.com