馮湘沅，成莉鳳，曾潔，劉志遠，楊琦，鄭科，王瑞君，段盛文，彭源德

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，長沙410205）

原料生產(chǎn)·生態(tài)環(huán)保

DCE01菌株大麻韌皮脫膠過程中有機酸的變化規(guī)律

馮湘沅，成莉鳳，曾潔，劉志遠，楊琦，鄭科，王瑞君，段盛文*，彭源德*

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，長沙410205）

為闡明大麻韌皮生物脫膠機理，研究采用DCE01菌株對大麻韌皮進行浸泡振蕩發(fā)酵10.5 h，從0.5 h開始，每隔2 h取樣，采用高效液相色譜法分析發(fā)酵過程中有機酸的變化規(guī)律。結(jié)果表明：在降解大麻韌皮發(fā)酵過程中發(fā)酵液主要含有草酸、甲酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、乙酸、琥珀酸、丙酸和其它未知有機酸組分。草酸、甲酸、琥珀酸的含量在發(fā)酵過程中均呈先升后降的變化趨勢，發(fā)酵最終變化率分別為降低93.69%、升高65.37%、降低26.01%；乙酸呈先升后降再回升再下降的變化過程，發(fā)酵最終變化率為降低84.58%；蘋果酸、乳酸含量呈先升后降再回升變化狀態(tài)，發(fā)酵最終變化率分別為升高52.03%、升高31.97%；檸檬酸含量呈緩慢上升至平穩(wěn)趨勢，發(fā)酵最終變化率為升高44.31%；丙酸含量呈不規(guī)則變化趨勢，發(fā)酵最終變化率為升高0.11%。

DCE01菌株；大麻韌皮；發(fā)酵液；有機酸；變化規(guī)律

Key words：strain DCE01，hemp bast，fermentation broth，organic acids，change rule

由于大麻韌皮的非纖維素物質(zhì)（果膠、半纖維素、木質(zhì)素等膠質(zhì)）含量較高，必需去除在纖維束內(nèi)部和外圍組織的鍵合型非纖維素物質(zhì)，所以，去除膠質(zhì)是生產(chǎn)中的重要環(huán)節(jié)［1－3］。傳統(tǒng)水漚麻法存在著環(huán)境污染大、脫膠時間長、勞動強度大等問題，而化學(xué)脫膠法、各種物理方法等存在著成本高、能耗大、纖維損傷嚴(yán)重等弊端，已成為產(chǎn)業(yè)發(fā)展的制約因子［4－5］。為了尋找最佳脫膠方法，研究發(fā)現(xiàn)生物脫膠法具有克服上述脫膠法缺點的優(yōu)勢。生物脫膠主要是選用高產(chǎn)果膠酶、甘露聚糖酶、木聚糖酶等有降解膠質(zhì)能力的菌株來處理大麻韌皮獲得純凈纖維。菌株在脫膠過程中的酶解膠質(zhì)及酶解產(chǎn)物的生化反應(yīng)所產(chǎn)生的有機酸類、醛類等產(chǎn)物濃度積累的多少會使發(fā)酵條件發(fā)生變化，從而影響菌株脫膠，因此，掌握有機酸與菌株脫膠的協(xié)調(diào)性很有必要［6－8］。

高效菌株DCE01具有易操作、生長繁殖速度快、培養(yǎng)基要求簡單等特點，故本研究采用DCE01菌株對大麻韌皮進行浸泡振蕩發(fā)酵，檢測分析發(fā)酵過程中有機酸的變化規(guī)律，旨在為闡明大麻韌皮生物脫膠機理提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

DCE01菌株：菊果膠桿菌變異菌株（保藏號：CGMCC5522）。大麻韌皮：2014年長沙基地收獲后曬干的大麻韌皮原麻。

1.2 主要儀器與試劑

Dionex Ultimate 3000液相色譜儀，Thermo Hypersil BDS C18柱（250 mm×4.6 mm，5μm），VWD－3400紫外檢測器，圖譜和數(shù)據(jù)采集處理為變色龍軟件。

全溫振蕩器（RH－Q型）為寧波賽茵儀器有限公司產(chǎn)品。

草酸、甲酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、丙酸均為Aladdin公司產(chǎn)品（分析純），磷酸二氫鉀、蛋白胨、葡萄糖、氯化鈉、牛肉浸膏、營養(yǎng)瓊脂均為國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品（分析純），甲醇為國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品（色譜純）。

1.3 菌懸液制備

取保存菌株DCE01菌苔1環(huán)接于5 mL液體培養(yǎng)基，混勻，35℃靜置培養(yǎng)5 h；取1 mL稀釋涂布于固體培養(yǎng)基平皿，35℃靜置培養(yǎng)20 h；挑取活化菌落1個接于5 mL液體培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)4 h；倒入100 mL液體培養(yǎng)基，35℃，180 r／min培養(yǎng)6 h；取6 mL接于300 mL液體培養(yǎng)基，35℃，180 r／min培養(yǎng)6 h。

1.4 接種與發(fā)酵

準(zhǔn)確稱取15 g大麻韌皮（去除基、梢部各約10 cm，剩余部分剪切為約3 cm長的片段）于500 mL錐形瓶中，倒入浴比1∶10、接種量為2%的菌懸液，混勻，置于35℃，180 r／min全溫振蕩器發(fā)酵，設(shè)置3個重復(fù)。同時設(shè)置空白（不加菌懸液）對照組。

1.5 取樣

大麻韌皮接種振蕩0.5 h開始取樣，直至10.5 h結(jié)束，每隔2 h取樣一次。每瓶取樣10 mL（麻瓶立即補充等量自來水）。

1.6 有機酸測定

混合標(biāo)準(zhǔn)單糖類溶液配制：準(zhǔn)確配制濃度為草酸0.5 g／L、甲酸、蘋果酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、琥珀酸、丙酸均為5 g／L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取上述各標(biāo)準(zhǔn)溶液混合，0.45μm濾膜過濾，適度稀釋倍數(shù)用作HPLC檢測分析［9－10］。

樣品處理：取樣品發(fā)酵液5 mL，10000 r／min離心10 min，去沉淀，取上清用0.22μm微孔膜過濾，待測。

有機酸發(fā)酵過程中指標(biāo)計算方法表示為變化率。發(fā)酵最終變化率（%）＝｜發(fā)酵終止含量－發(fā)酵起始含量｜÷發(fā)酵終止含量×100%。

1.7 色譜條件［11］

紫外檢測波長：210 nm；柱溫：25℃；流速：0.6mL／min；流動相：V（甲醇）∶V（0.01 mol／L磷酸二氫鉀緩沖液，pH 2.7）＝3∶97；進樣量：20μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵過程中有機酸的組成分析

通過對大麻韌皮發(fā)酵過程中采集的樣品進行適當(dāng)稀釋，用高效液相色譜儀分析有機酸組分和含量，結(jié)果見圖1。對照混合標(biāo)準(zhǔn)曲線可以看出：按出峰順序，大麻韌皮的DCE01菌株發(fā)酵液含有草酸、甲酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、乙酸、琥珀酸、丙酸和其它未知有機酸成分，其中草酸含量最高，甲酸含量次之。例如：2.5 h時發(fā)酵產(chǎn)物中的草酸、甲酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、乙酸、琥珀酸、丙酸分別占已知有機酸總量的72.18%、9.54%、5.06%、4.72%、3.21%、0.97%、2.13%、2.19%。

圖1 大麻韌皮發(fā)酵過程中有機酸變化色譜圖Fig.1 Chromatogram on the organic acids during the fermentation for hemp bast

2.2 發(fā)酵過程中有機酸的變化規(guī)律

2.2.1 草酸

從圖2可看出，DCE01菌株發(fā)酵液草酸含量在0.5～2.5 h呈緩慢上升趨勢，2.5 h之后呈下降趨勢。而CK發(fā)酵液草酸含量在0.5～2.5 h呈下降趨勢，2.5 h后呈平穩(wěn)狀態(tài)。DCE01菌株發(fā)酵液、CK發(fā)酵液草酸起始（0.5 h）含量分別為3299.1、902.3 mg／L，10.5 h發(fā)酵終止后兩者草酸含量變化率分別降低為93.69%、3.11%。結(jié)果表明，原料浸泡產(chǎn)生草酸，而隨著時間延長，微生物含量增加，草酸逐漸被消耗。

圖2 草酸的變化規(guī)律Fig.2 The change rule of oxalic acid during the fermentation for hemp bast

2.2.2 甲酸

由圖3可見，DCE01菌株發(fā)酵液的甲酸含量由初始的290.3 mg／L上升到8.5 h的最高峰值1572.1 mg／L，隨后出現(xiàn)下降，終止含量為841.7 mg／L，發(fā)酵最終變化率為升高65.37%。CK發(fā)酵液甲酸含量從0.5～10.5 h呈比較平穩(wěn)狀態(tài)，在77.6 mg／L左右波動。從變化情況可以看出，甲酸來源于脫膠過程中菌株的代謝產(chǎn)物或大麻原料分解產(chǎn)物。

圖3 甲酸的變化規(guī)律Fig.3 The change rule ofmethanoic acid during the fermentation for hemp bast

2.2.3 蘋果酸

圖4表明，DCE01菌株發(fā)酵液蘋果酸含量的變化情況為0.5～4.5 h呈上升趨勢，4.5～6.5 h呈下降趨勢，6.5～10.5 h又回升，從起始含量52.1 mg／L到終止含量108.6 mg／L，整個發(fā)酵過程中，雖然蘋果酸含量最終變化率為升高52.03%，但增加量不高（只有50 mg／L左右）。而CK發(fā)酵液蘋果酸含量從0.5～10.5 h一直在24.1 mg／L左右波動。

圖4 蘋果酸的變化規(guī)律Fig.4 The change rule ofmalic acid in the fermentation broth

2.2.4 乳酸

從圖5可以得出，DCE01菌株發(fā)酵液乳酸含量的變化規(guī)律為0.5～4.5 h緩慢上升，4.5～6.5 h出現(xiàn)下降，6.5～10.5 h又回升，整個發(fā)酵過程的變化趨勢呈“N”型，終止含量（256.8 mg／L）是起始含量（174.7 mg／L）的1.47倍，變化率為升高31.97%。而CK發(fā)酵液的蘋果酸含量從4.5 h開始出現(xiàn)上升，8.5 h后呈緩慢下降趨勢。從整體變化情況來說，菌株在發(fā)酵過程中分泌積累乳酸。

圖5 乳酸的變化規(guī)律Fig.5 The change rule of lactic acid during the fermentation for hemp bast

2.2.5 乙酸

通過圖6可看出，DCE01菌株發(fā)酵液、CK發(fā)酵液的草酸含量大致呈現(xiàn)“M”型的變化趨勢。DCE01菌株發(fā)酵液乙酸起始含量（120.9 mg／L）高于終止含量（65.5 mg／L），乙酸的最終變化率為降低84.58%。發(fā)酵過程中兩者的乙酸含量均在2.5、6.5 h出現(xiàn)峰高。整體變化規(guī)律可以歸結(jié)為，菌株分泌的胞外酶降解溶出物及膠質(zhì)時不斷產(chǎn)生乙酸及轉(zhuǎn)化、分解的循環(huán)過程。

圖6 乙酸的變化規(guī)律Fig.6 The change rule of acetic acid during the fermentation for hemp bast

2.2.6 檸檬酸

由圖7可知，DCE01菌株發(fā)酵液、CK發(fā)酵液的檸檬酸含量變化趨勢近乎相同。DCE01菌株發(fā)酵液的檸檬酸含量從0.5 h（50.9 mg／L）緩慢上升至8.5 h（92.5 mg／L），之后基本平穩(wěn)，整個發(fā)酵過程中，檸檬酸含量的最終變化率為升高44.31%。而CK發(fā)酵液的檸檬酸含量從6.5 h開始呈現(xiàn)上升趨勢，8.5 h后含量基本維持在38 mg／L左右。從變化規(guī)律可得，檸檬酸隨著發(fā)酵時間的延長而逐漸積累并趨于平穩(wěn)，但含量不高。

圖7 檸檬酸的變化規(guī)律Fig.7 The change rule of citric acid during the fermentation for hemp bast

2.2.7 琥珀酸

由圖8顯示，DCE01菌株發(fā)酵液、CK發(fā)酵液的琥珀酸含量均在4.5 h出現(xiàn)最高，含量分別為121.6、51.7 mg／L，之后含量緩慢下降，8.5～10.5 h含量處于平穩(wěn)狀態(tài)，整個過程中，兩者的變化趨勢相近。但DCE01菌株發(fā)酵過程中的琥珀酸含量最終變化率為降低26.01%。這一現(xiàn)象可以認為，琥珀酸在發(fā)酵初期被逐步積累，隨著發(fā)酵的延續(xù)而趨于平穩(wěn)。

圖8 琥珀酸的變化規(guī)律Fig.8 The change rule of succinic acid during the fermentation for hemp bast

2.2.8 丙酸

如圖9所示，DCE01菌株發(fā)酵液、CK發(fā)酵液的丙酸含量呈不規(guī)則變化趨勢。DCE01菌株發(fā)酵液的丙酸含量從起始到終止變化不大（變化率為升高0.11%），一直在80 mg／L左右波動。CK發(fā)酵液的丙酸含量從起始到終止也是增加的。

圖9 丙酸的變化規(guī)律Fig.9 The change rule of propionic acid during the fermentation for hemp bast

3 結(jié)論

采用DCE01菌株對大麻韌皮進行浸泡振蕩發(fā)酵10.5 h，利用高效液相色譜法分析發(fā)酵過程中有機酸含量的變化規(guī)律，獲得主要結(jié)論如下：

（1）DCE01菌株在降解大麻韌皮發(fā)酵過程中發(fā)酵液含有草酸、甲酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、乙酸、琥珀酸、丙酸和其它未知有機酸組分。

（2）發(fā)酵過程中的草酸、甲酸、琥珀酸含量均呈先升后降的變化趨勢；乙酸呈先升后降再回升再下降的變化過程，類似于“M”型的變化趨勢；蘋果酸、乳酸含量呈先升后降再回升變化狀態(tài)，呈“N”型；檸檬酸含量呈緩慢上升至平穩(wěn)趨勢；丙酸含量呈不規(guī)則變化趨勢。

（3）發(fā)酵過程中含量最終變化率出現(xiàn)降低的有機酸有草酸、乙酸、琥珀酸，變化率分別降低為93.69%、84.58%、26.01%；含量最終變化率出現(xiàn)升高的有機酸有甲酸、蘋果酸、檸檬酸、乳酸、丙酸，變化率分別升高為65.37%、52.03%、44.31%、31.97%、0.11%。而對照組中，草酸、甲酸、蘋果酸、乳酸、檸檬酸、乙酸、琥珀酸、丙酸等含量明顯偏低，說明大麻韌皮生物脫膠過程中，有機酸種類及含量發(fā)生了系列變化，這些變化反映了菌株的代謝產(chǎn)物及原料降解產(chǎn)物的變化規(guī)律，對進一步探討大麻脫膠機理具有積極意義。

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The Change Rule of Organic Acids during the Degumming of Hemp Bast with the Strain of DCE01

FENG Xiangyuan，CHENG Lifeng，ZENG Jie，LIU Zhiyuan，YANG Qi，ZHENG Ke，WANG Ruijun，DUAN Shengwen*，PENG Yuande*
（Institute of Bast Fiber Crops，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Changsha 410205，China）

To elucidate the mechanism of bio－degumming of hemp bast，the hemp bast was degummed with the strain of DCE01 for 10.5 h.After 0.5 h，the samples were analyzed by HPLC every 2 h.Themain resultswere as follow：Themain constituteswere oxalic acid，methanoic acid，malic acid，lactic acid，citric acid，acetic acid，succinic acid，propionic acid and some other unknown organic acids.The content of oxalic acid，methanoic acid，and succinic acid increased and then decreased，the resultswere 93.69%decreasement，65.37%increasement and 26.01%decreasement，respectively. The content of acetic acid increased firstly and then decreased，and subsequently increased firstly and then decreased again，and the resultswas 84.58%decreasement.The content of lactic acid and malic acid increased firstly and then decreased，subsequently increased again，the results were 52.03%increasement and 31.97%increasement，respectively.The content of citric acid increased steadily then reached themaximum，the resultwas 4.31%increasement.The content of propionic acid was not regular，and the resultwas 0.11%increasement.

S563.3

A

1671－3532（2017）04－0183－06

2017－05－23

中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程（ASTIP－IBFC08）；國家麻類產(chǎn)業(yè)技術(shù)建設(shè)專項（No.CARS－19－E24）；湖南省自然科學(xué)基金（No.2016 jj3126）

馮湘沅（1964－），女，高級實驗師，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工微生物研究。E－mail：fxysun＠163.com

*通訊作者：彭源德（1965－），男，研究員，主要從事農(nóng)產(chǎn)品加工微生物研究。E－mail：pengyuande＠caas.cn；段盛文（1975－），男，副研究員，主要從事微生物資源與利用研究。E－mail：hunandsw＠163.com