王曉麗謝淑敏王月輝劉偉殷團芳彭安全任基浩

1湖南省婦幼保健院兒童五官科（長沙410008）

2中南大學湘雅醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（長沙410008）

3河南科技大學第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（洛陽471000）

4中南大學湘雅二醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，中南大學耳科研究所（長沙410011）

·基礎研究·

P-EGFR、P-ERK和NF-κB在中耳膽脂瘤上皮中的表達和意義

王曉麗1謝淑敏2王月輝3劉偉4殷團芳4彭安全4任基浩4

1湖南省婦幼保健院兒童五官科（長沙410008）

2中南大學湘雅醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（長沙410008）

3河南科技大學第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（洛陽471000）

4中南大學湘雅二醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，中南大學耳科研究所（長沙410011）

目的研究磷酸化表皮生長因子受體（P-EGFR）、磷酸化細胞外信號調節(jié)激酶（P-ERK）和細胞核轉錄因子κB（NF-κB）在中耳膽脂瘤上皮組織中的表達情況，探討EGFR/ERK/NF-κB信號通路在中耳膽脂瘤發(fā)病機制中的作用。方法應用免疫組織化學SP法及Western blot(WB)免疫印跡法檢測30例中耳膽脂瘤標本及15例正常外耳道皮膚組織中P-EGFR、P-ERK和NF-κB蛋白的表達。結果（1）P-EGFR蛋白陽性表達主要定位于細胞質和（或）細胞膜，在膽脂瘤組的陽性表達率為63%，明顯高于正常外耳道皮膚組的20%（P<0.05）；P-ERK蛋白陽性表達主要定位于細胞質和（或）細胞核，在膽脂瘤組的陽性表達率為70%，明顯高于正常外耳道皮膚組的20%（P<0.05）；NF-κB蛋白陽性表達主要定位于細胞核，在膽脂瘤組的陽性表達率為60%，明顯高于正常耳道皮膚組的13.3%（P< 0.05）。在30例中耳膽脂瘤組織中，P-EGFR、P-ERK和NF-κB兩兩之間呈正相關關系（P＜0.05）。（2）Western blot免疫印跡法檢測結果顯示：中耳膽脂瘤組中P-EGFR、P-ERK和NF-κB的表達量明顯高于正常外耳道皮膚組的表達量。結論P-EGFR、P-ERK和NF-κB在中耳膽脂瘤上皮中表達增強，EGFR/ERK/NF-κB信號通路可能在中耳膽脂瘤組織的形成和發(fā)展過程中起重要作用。

中耳，膽脂瘤，P-EGFR，P-ERK，NF-κB，EGFR/ERK/NF-κB信號通路

Foundation:Nationalnaturalscience foundation of China(NO:81400457)

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中耳膽脂瘤是耳科常見病，雖為良性病變，卻具有侵襲性、破壞性、復發(fā)性等特征，發(fā)病機制尚不清楚，可能與膽脂瘤上皮細胞的過度增殖、凋亡紊亂等有關[1-3]。隨著分子生物技術的發(fā)展及應用，細胞因子在膽脂瘤發(fā)病機制中的作用逐漸被重視，本文主要探索磷酸化表皮生長因子受體（phospho-epidermal growth factor receptor,P-EG?FR）、磷酸化細胞外信號調節(jié)激酶（phospho-extra?cellular signal-regulated kinase，P-ERK）和細胞核轉錄因子κB（nuclear transcription factor kappa B, NF-κB）在中耳膽脂瘤上皮組織中的表達情況，探討EGFR/ERK/NF-κB信號通路在中耳膽脂瘤發(fā)病機制中的作用。

表皮生長因子受體（epidermalgrowth factor re?ceptor,EGFR）是一種酪氨酸蛋白激酶受體，其細胞外部分與配體結合后可形成二聚體自動磷酸化為P-EGFR，從而激活下游MEK/ERK信號通路，調控NF-κB表達，影響細胞增殖、凋亡、遷移等[4-5]。我們的前期研究顯示：EGFR在膽脂瘤上皮組織中處于活化狀態(tài)[6-7]，我們推測：在中耳膽脂瘤組織中可能存在EGFR/ERK/NF-κB信號通路的激活，從而促進膽脂瘤的發(fā)生及發(fā)展。因此，我們選取該通路的關鍵因子P-EGFR、P-ERK和NF-κB，運用免疫組織化學SP法及Western blot(WB)檢測其表達，探討EGFR/ERK/NF-κB信號傳導通路在中耳膽脂瘤發(fā)病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織標本

收集2009.08~2011.08期間中南大學湘雅二醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科后天性中耳膽脂瘤標本30例為實驗組，外耳道正常皮膚組織標本（取自外耳道口正常皮膚組織）15例為對照組。標本取出后一半行常規(guī)石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅（HE）染色，另一半立即置入液氮，作為WB的實驗組織標本。

1.1.2 主要試劑

兔抗人P-EGFR多克隆抗體、鼠抗人P-ERK單克隆抗體、鼠抗人NF-κB單克隆抗體購于Santa Cruz公司，RIPA裂解液購自北京普利萊，ECL發(fā)光液購自美國Thermo pierce。

1.2 實驗方法

1.2.1 免疫組織化學實驗

步驟如下：烤片、脫蠟、水化、滅活內源性過氧化物酶后，0.01M枸櫞酸鉀緩沖液高壓下抗原修復。山羊血清進行抗原封閉后，孵育一抗（P-EG?FR濃度1：200，P-ERK濃度1：50，NF-κB濃度1：200），4℃冰箱內過夜。第二天復溫至室溫30min，PBS浸泡后孵育二抗10~15min，PBS沖洗后，室溫孵育辣根酶標記鏈霉卵白素10～15min，PBS沖洗。用新鮮配制的二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzi?dine，DAB）顯色，顯微鏡下控制反應時間。沖洗，復染，脫水，透明，封片。已知的陽性切片作為陽性對照，PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。

陽性標準：P-EGFR細胞質著色為棕黃色者為陽性細胞，P-ERK細胞質和（或）胞核著色為棕黃色者為陽性細胞，NF-κB細胞核著色為棕黃色者為陽性細胞。先按照染色的強度（無著色、微弱、中度、深度棕黃色）依次計為0、1、2、3分，然后在400倍顯微鏡下進行閱片，根據(jù)陽性細胞百分比計分：0%、＜10%、10%~50%、＞50%依次記0、1、2、3分。二者之積：0～2分為陰性（-），≥3分為陽性（+）。

1.2.2 Western blot免疫印跡法

剪取適量組織，用冰預冷的PBS清洗組織，加入RIPA裂解液（已加入蛋白酶抑制劑及蛋白磷酸酶抑制劑）于勻漿器中反復研磨組織直至看不見組織塊。置于冰上，蛋白裂解30分鐘。移至離心管，12000rpm,4℃，15min,離心；將離心后的上清液轉移、保存?zhèn)溆?。檢測蛋白濃度后，配膠、上樣、電泳，濃縮膠電泳電壓為80V，分離膠電泳電壓為120V，待溴酚藍電泳至離膠底約1cm時終止電泳。根據(jù)marker的指示，分別切出所需分子量蛋白的膠：P-EGFR約170KD，P-ERK1/2約42~44KD,NF-κB約65KD，β-actin約42KD。PVDF膜進行轉膜。轉膜完畢后，1*TBST洗膜5min，用麗春紅染膜，檢測蛋白轉膜的效率。5%脫脂奶粉封閉1~2小時后，PBS洗膜3次，每次15min。然后用1*TBST將一抗按照一定比例稀釋（P-EGFR 1：200，P-ERK 1: 1000，NF-κB 1:1000，β-actin 1:4000），孵育一抗，4℃過夜。第二天搖床30min復溫至室溫。1*TBST洗3次，每次15min。用1*TBST稀釋HRP標記的二抗（稀釋比例1：3000），孵育二抗45~60min。孵育結束后，1*TBST洗3次，每次15min。使用ECL化學發(fā)光液（Thermo）進行顯影，定影液終止顯色。底片曝光后掃描，并用quantity one專業(yè)灰度分析軟件進行分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 16.0軟件包進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料采用卡方檢驗，計量資料采用獨立樣本t檢驗，Spearman檢驗分析三蛋白之間的相關性，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 免疫組織化學檢測各蛋白的表達

中耳膽脂瘤組織及外耳道皮膚組織HE染色如圖示（圖1，圖2）。P-EGFR的陽性表達定位于細胞質和（或）細胞膜，著色為棕黃色。實驗組30例膽脂瘤標本中共有19例出現(xiàn)陽性染色（圖3），陽性率為63%；對照組15例外耳道上皮組織中有3例染色為微弱棕黃色（圖4），陽性率為20%。兩組間比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=7.515，P=0.006，P<0.05）（見表1）。

P-ERK的陽性表達主要定位于細胞質，有時亦伴有細胞核著色，主要表達在膽脂瘤上皮和皮膚組織的基底層和基底上細胞層。實驗組30例膽脂瘤標本中有21例出現(xiàn)陽性染色（圖5），陽性率為70%。對照組15例外耳道上皮組織中有3例染色為微弱棕黃色（圖6），陽性率為20%。兩組間比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=10.045，P=0.002，P<0.05）（見表1）。

NF-κB活化后主要位于細胞核，以細胞核著棕黃色顆粒為陽性細胞。實驗組30例膽脂瘤組織標本中有18例出現(xiàn)胞核著色，主要分布于膽脂瘤上皮基底層和基底上層(圖7)，陽性率為60%。對照組15例外耳道上皮組織中僅有2例染色顆粒位于細胞核，其余均為胞質著色（圖8），為陰性表達，陽性率為13.3%。兩組間比較差異有統(tǒng)計學意義（χ2=8.820，P=0.003，P<0.05）（見表1）。

表1 中耳膽脂瘤組和正常外耳道皮膚組P-EGFR、P-ERK與NF-κB蛋白表達情況的比較Table1 Comparison of theexpression of P-EGFR,P-ERK and NF-κB between cholesteatoma inm iddleearand normalcanalskin

表2所示為使用Spearman方法檢驗膽脂瘤組中P-EGFR、P-ERK和NF-κB之間的相互關系的結果，膽脂瘤組中P-EGFR與P-ERK的表達存在正相關（r=0.709,P=0.000,P＜0.05），P-EGFR與NF-κB的表達存在正相關（r=0.508，P=0.004，P＜0.05），P-ERK與NF-κB的表達存在正相關（r= 0.505，P=0.004，P＜0.05）。

2.2 Western blot免疫印跡法檢測P-EGFR、P-ERK和NF-κB蛋白的相對表達

將曝光后的底片掃描，并用quantity one專業(yè)灰度分析軟件進行分析。結果顯示：中耳膽脂瘤中P-EGFR、P-ERK和NF-κB蛋白的表達明顯高于正常皮膚（圖9）。對兩組樣本的相對灰度值進行獨立樣本t檢驗，結果示：膽脂瘤組中P-EGFR的相對表達量為0.8380±0.0431，顯著高于正常皮膚組的0.3900±0.1175（t=-3.580，P=0.016,P＜0.05）；膽脂瘤組中P-ERK的相對表達量為0.1660±0.0248，顯著高于正常皮膚組的0.0700±0.0138（t=-3.381，P= 0.019,P＜0.05）；膽脂瘤組中NF-κB的相對表達量為0.8200±0.1309，顯著高于正常皮膚組的0.3860± 0.0706（t=-2.918，P=0.010,P＜0.05）。

圖1 膽脂瘤上皮HE染色（×100）；Fig.1 Hematoxylin-eosin staining of cholesteatoma(×100);

圖2 正常外耳道皮膚HE染色（×100）；Fig.2 Hematoxylin-eosin staing of normalskin(×100);

圖3 P-EGFR在中耳膽脂瘤上皮中的陽性表達（×200）；Fig.3 The positiveexpression of P-EGFR in cholesteatoma (×200);

圖4 P-EGFR在正常外耳道皮膚中的陰性表達（×200）；Fig.4 The negative expression of P-EGFR in normal skin(× 200)

圖5 P-ERK在中耳膽脂瘤上皮中的陽性表達（×200）；Fig.5 The postive expression of P-ERK in cholesteatoma(× 200);

圖6 P-ERK在正常外耳道皮膚中的陰性表達（×200）；Fig.6 ThenegativeexpressionofP-ERK innormalskin(×200);

圖7 NF-κB在中耳膽脂瘤上皮中的陽性表達（×200）；Fig.7 The positive expression of NF-κB in cholesteatoma(× 200);

圖8 NF-κB在正常外耳道皮膚中的陰性表達（×200）Fig.8 ThenegativeexpressionofNF-κB innormalskin(×200)

表2 中耳膽脂瘤組中P-EGFR、P-ERK和NF-κB蛋白表達之間的關系Table 2 Relationship of the expression of P-EGFR、P-ERK and NF-κB in cholesteatoma

表3 中耳膽脂瘤組和外耳道皮膚組中P-EGFR、P-ERK和NF-κB蛋白的相對表達量Table 3 Comparison of the relative expression of P-EGFR,P-ERK and NF-κB between cholesteatoma inm iddle earand normal canalskin

圖9 兩組標本的WB灰度分析圖（S：皮膚C：膽脂瘤）Fig.9 Western blotting analysis of P-EGFR,P-ERK,NF-κB between skin and cholesteatoma(S=skin;C=cholesteatoma)

3 討論

EGFR是一個約170kDa大小、具有酪氨酸蛋白激酶活性的表皮生長因子受體，由胞外區(qū)、跨膜區(qū)、胞內區(qū)3個部分構成。胞外部分與配體結合后可形成二聚體自動磷酸化為P-EGFR，從而激活下游信號通路，發(fā)揮促進細胞增殖、遷移及腫瘤細胞侵襲性等作用[7]。

ERK蛋白屬于絲氨酸-蘇氨酸激酶亞家族，眾多成員中關于ERK1、ERK2的研究目前最多。ERK1/2是Ras/Raf/MEK/ERK信號通路的重要成分，通過結合細胞表面受體轉錄因子，由細胞漿轉移到細胞核中，調控一些重要蛋白的活性，進而調控細胞周期、細胞的增殖、分化及凋亡等過程[8-10]。

NF-κB是一種重要的轉錄因子，是一種從B淋巴細胞的細胞核提取物中發(fā)現(xiàn)的核蛋白。其家族包括五個成員：p50、p52、p65、c-Rel和RelB，它們可以形成多種同二聚體或者異二聚體復合體，激活后由胞漿轉移到胞核，參與多種基因的調控、炎癥反應和免疫反應，調節(jié)細胞的增殖及轉化、抑制凋亡、促進腫瘤發(fā)展等[11-12]。

本研究中我們通過免疫組織化學方法發(fā)現(xiàn)P-EGFR蛋白陽性表達主要定位于細胞質和（或）細胞膜，在膽脂瘤組的陽性表達率為63%，明顯高于正常外耳道皮膚組的20%（P<0.05）；P-ERK蛋白陽性表達主要定位于細胞質和（或）細胞核，在膽脂瘤組的陽性表達率為70%，明顯高于正常外耳道皮膚組的20%（P<0.05）；NF-κB蛋白陽性表達主要定位于細胞核，在膽脂瘤組的陽性表達率為60%，明顯高于正常耳道皮膚組的13.3%（P<0.05）。Spear?man檢驗結果顯示：中耳膽脂瘤中P-EGFR、P-ERK、NF-κB三者的陽性表達兩兩之間均呈顯著正相關關系（P＜0.05）。WB免疫印跡檢測從蛋白半定量角度也印證了：中耳膽脂瘤中P-EGFR、P-ERK和NF-κB的表達明顯高于外耳道正常皮膚，且兩組間有顯著的統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。EG?FR與配體發(fā)生特異性結合之后，自身磷酸化轉變?yōu)镻-EGFR而激活，繼而激活下游EGFR/ERK/ NF-κB信號通路，發(fā)揮促進細胞增殖、分化、遷移、侵襲的作用。我們的前期研究證實EGFR在膽脂瘤上皮組織中處于活化狀態(tài)[6-7]。Huisman等[13-15]發(fā)現(xiàn)P-ERK1/2在膽脂瘤上皮組織中的表達較耳后皮膚明顯增強，表達部位主要位于膽脂瘤組織全層細胞核，作者推測膽脂瘤上皮中終末分化紊亂，晚期終末分化停止，角質形成細胞滯留在早期終末分化階段，導致細胞過度增殖、凋亡抑制，角質堆積。Liu等[16]通過免疫組織化學及WB方法發(fā)現(xiàn)膽脂瘤組織中P-ERK的表達較正常皮膚增強，主要位于膽脂瘤上皮全層細胞核。我們通過本研究也再次證實了中耳膽脂瘤組織中P-ERK1/2顯著增強，此外，陽性細胞不僅表達在細胞核，細胞質中也有P-ERK1/2的陽性表達。

Miyao等[17]發(fā)現(xiàn)在膽脂瘤上皮全層均有NF-κB表達，主要位于細胞核周圍，細胞核內卻無表達，他們推測：膽脂瘤組織中NF-κB失活、其抗凋亡機制失活，聯(lián)合caspase-3、caspase-8的促凋亡作用，導致角蛋白堆積，膽脂瘤形成。廖軍等[18]發(fā)現(xiàn)膽脂瘤上皮組織中上皮全層均有NF-κβ表達，23例均有胞漿染色，且8例胞核亦染色，表達強度顯著高于正常外耳道皮膚組織，推測炎癥反應在中耳膽脂瘤發(fā)病機制中起重要作用，提出抗炎治療、調控NF-κβ的表達可能作為膽脂瘤非手術治療的方案。我們通過本研究也證實了中耳膽脂瘤組織中NF-κβ的表達較正常皮膚顯著增強，且主要表達在細胞核，我們推測：激活的NF-κβ進入細胞核后與相應的靶基因結合，啟動了靶基因的轉錄和表達，從而在膽脂瘤的形成和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。

我們知道：P-ERK是EGFR的下游靶因子，NF-κB是P-ERK的下游靶因子，膽脂瘤角質形成細胞所處微環(huán)境中存在大量的表皮生長因子（epi?dermal growth factor,EGF）、轉化生長因子α（trans?forming growth factor alpha,TGF-α）及雙調蛋白（amphiregulin,AR）等炎癥細胞因子，當它們與EG?FR特異性結合之后使后者自身磷酸化為P-EGFR而被激活，然后激活下游靶因子ERK，繼而NF-κB被激活，導致細胞內部一系列信號級聯(lián)反應，促進角質細胞增殖、角質碎屑堆積，從而促進中耳膽脂瘤的發(fā)生及發(fā)展。由此我們推測：EGFR/ERK/ NF-κB信號通路可能在膽脂瘤組織中處于激活狀態(tài)，在膽脂瘤的發(fā)病機制中起重要作用。

綜上所述，P-EGFR、P-ERK、NF-κB在中耳膽脂瘤上皮中的表達顯著高于外耳道正常皮膚組，EG?FR/ERK/NF-κB信號通路可能參與了膽脂瘤組織的形成和發(fā)展，在膽脂瘤的發(fā)病機制中起重要作用。

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Expression and Significanceof P-EGFR,P-ERK and NF-κB in M idd le Ear Cholesteatoma Epithelium

WANGXiali1,XIEShumin2,WANGYuehui3,LIUWei4,YINTuanfang4,PENGAnquan4,REN Jihao4
1Hunan ProvincialMaternaland Child Health CareHospital,Departmentof PediatricOphthalmology and Otorhinolaryngology,Changsha,Hunan Province,China(410008).
2DepartmentofOtolaryngology-Head and Neck Surgery,TheXiangya Hospital,CentralSouth University,Changsha, Hunan Province,China(410008).
3 DepartmentofOtolaryngology-Head and Neck Surgery,FirstAffiliated HospitalofHenan University of Scienceand Technology,Luoyang,Henan Province,China(471000).
4DepartmentofOtolaryngology-Head and Neck Surgery,The Second Xiangya Hospital,Central South University,Otology Research InstituteofCentral South University,Changsha,Hunan Province,China(410011).

LIUWei Email:lw-007@163.com

ObjectiveTo study the expression of P-EGFR,P-ERK and NF-κB inm iddle ear cholesteatoma epithelium,and explore the potential roles of EGFR/ERK/NF-κB signaling transduction pathway in m iddle ear cholesteatomaepithelialhyperplasia.Methods SP immunohistochem icalassay and Western blotwere used to detect the expression and significance of P-EGFR,P-ERK and NF-κB in 30 casesofm iddle ear cholesteatoma tissue samples and 15 casesof normal ear skin specimens.Results(1)Immunohistochem istry showed P-EGFR was expressed in the cytoplasm and/or membrane of epithelialcells.P-EGFRwas positive in 19 of the 30m iddleear cholesteatoma specimens(63%),compared to 3 of the15 specimens(20%)in the controlgroup(P<0.05).P-ERK expression in cholesteatomawasdetected ata higher rate(21/30,70%)than normalexternalear canalskin(3/15,20%）(P<0.05).NF-κB immunoreactivity was detected in thenucleiofepithelialcellsatahigher rate in cholesteatoma(18/30,60%)than the controlgroup(2/15,13.3%)(P<0.05).Inmiddle ear cholesteatoma epithelium,there was a positive correlation between expression of P-EGFR,P-ERK and NF-κB(P<0.05).(2)Western blotdiscovered that the expression of P-EGFR,P-ERK and NF-κB in cholesteatomawas significantlymore than theamountof expression in skin.ConclusionsTheexpression of P-EGFR,P-ERK and NF-κB in m iddleear cholesteatomawassignificantly higher than normalskin.Activation of EGFR/ERK/NF-κB signaling transduction pathwaymay be involved in the information and developmentofmiddleearcholesteatoma.

Cholesteatoma;M iddle Ear;P-EGFR;P-ERK;NF-κB;EGFR/ERK/NF-κB Signaling Transduction Pathway

R764

A

1672-2922（2017）03-339-6

2017-01-09審核人：翟所強）

10.3969/j.issn.1672-2922.2017.03.013

國家自然科學基金（項目批準號：81400457）

王曉麗，碩士研究生，研究方向:耳科學

劉偉，Email:lw-007@163.com