王夢(mèng)航李水靜韓琳余力生

1北京大學(xué)國(guó)際醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科（北京102206）

2北京大學(xué)人民醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科（北京100044）

·基礎(chǔ)研究·

MUC5AC和TNF-α在大鼠急性分泌性中耳炎模型中的表達(dá)變化

王夢(mèng)航1李水靜1韓琳2余力生2

1北京大學(xué)國(guó)際醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科（北京102206）

2北京大學(xué)人民醫(yī)院耳鼻咽喉-頭頸外科（北京100044）

目的研究MUC5AC（黏蛋白MUC5AC）和TNF-α（腫瘤壞死因子-α）在大鼠中耳炎黏膜的表達(dá)變化。方法40只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組10只、實(shí)驗(yàn)組30只；實(shí)驗(yàn)組建立大鼠急性分泌性中耳炎模型，采用qPCR檢測(cè)MUC5AC及TNF-α在第1天,第3天,第7天兩組中耳黏膜的表達(dá)變化，并用免疫組織化學(xué)染色技術(shù)分別檢測(cè)MUC5AC和TNF-α在第1天,第3天,第7天在中耳黏膜的表達(dá)變化。結(jié)果在對(duì)照組中，MUC5AC不表達(dá)，TNF-α輕度表達(dá)，實(shí)驗(yàn)組從第1天到第3天MUC5AC及TNF-α的表達(dá)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而增強(qiáng)，至第7天則表達(dá)開(kāi)始減弱，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的比較差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論MUC5AC和TNF-α在大鼠急性分泌性中耳炎黏膜中表達(dá)上調(diào)，且與時(shí)間相關(guān)。

MUC5AC;TNF-α；急性分泌性中耳炎；中耳黏膜

Acknow ledgements This study was supported by the Twelfth-five-year"national science and technology support plan (2012BAI12B01),the National Natural Science Foundation of China(11202018),the Post-doctoral Foundation of China (20110490269,2013T60055)and Peking University InternationalHospitalResearch Fund(YN2016QN03).

Conflictof interestTheauthorsdeclareno conflictsof interest.

分泌性中耳炎(Otitismediawith effusion,OME)是耳科的常見(jiàn)病和多發(fā)病，主要特征為中耳積液及聽(tīng)力下降。調(diào)控中耳黏膜對(duì)炎癥損傷反應(yīng)的機(jī)制研究，正在成為我們的重要課題之一。MUC5AC是黏蛋白家族成員之一，是中耳黏液纖毛傳輸系統(tǒng)的重要組成部分，黏蛋白的表達(dá)增強(qiáng)可以影響中耳黏膜纖毛的運(yùn)動(dòng)功能[1]。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是炎癥介質(zhì)之一，它的啟動(dòng)與激活，在中耳炎的發(fā)病過(guò)程中起重要作用[2-3]。因此，本實(shí)驗(yàn)初步研究MUC5AC（黏蛋白MUC5AC）及TNF-α（腫瘤壞死因子-α）在大鼠急性分泌性中耳炎黏膜的表達(dá)變化。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

主要試劑有引物合成序列測(cè)定(Qiagen),熒光定量PCR試劑盒(Invitrogen公司,CA,USA)，鼠抗人MUC5AC單克隆抗體以及配套使用的SP免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中山生物公司，鼠抗人TNF-α單克隆抗體購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，細(xì)菌內(nèi)毒素（Endotoxin,ET）購(gòu)自Sigma公司(St Louis, MO,USA)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

選用雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠40只，體重100-150g，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心供應(yīng)。實(shí)驗(yàn)前所有大鼠耳廓反應(yīng)靈敏，用手術(shù)顯微鏡觀察雙側(cè)鼓膜正常。將篩選后的大鼠隨機(jī)分組：對(duì)照組（正常組）：10只SD大鼠，不做任何處理，直接處死，取聽(tīng)泡標(biāo)本。

實(shí)驗(yàn)組（Secretory otitismedia,SOM組）：內(nèi)毒素（Endotoxin,ET）組30只[4-5]，均以右耳作為實(shí)驗(yàn)耳，中耳腔注射內(nèi)毒素ET 40μl;左耳作為對(duì)比，用以比較觀察內(nèi)毒素注射大鼠右耳鼓膜像的變化情況。將注入后的大鼠隨機(jī)分為3組，分別于1d,3d, 7d各處死10只。

1.3 動(dòng)物模型的建立

2%戊巴比妥鈉（40mg/kg）腹腔注射，麻醉滿意后，固定于小動(dòng)物立體定位儀。剪開(kāi)皮膚、皮下及骨膜，暴露聽(tīng)泡，以尖端接有玻璃微電極的微量注射器吸取準(zhǔn)備好的內(nèi)毒素ET液體或生理鹽水NS 40μl，精確定位后垂直進(jìn)針至定位刻度，刺入中耳腔，骨蠟封閉骨孔。縫合皮膚，麻醉清醒后正常食水飼養(yǎng)。大鼠急性分泌性中耳炎模型（SOM組）鼓膜像標(biāo)準(zhǔn)：處死大鼠前均用顯微鏡觀察是否形成分泌性中耳炎，入選動(dòng)物鼓膜像需為混濁內(nèi)陷、膨出伴有積液者。

1.4 標(biāo)本收集

先觀察雙側(cè)鼓膜情況，然后斷頭取右側(cè)聽(tīng)泡，置于4℃預(yù)冷的生理鹽水中，解剖顯微鏡下除去筋膜、軟組織等，將聽(tīng)泡在濾紙上吸水干燥，在解剖顯微鏡下剝離實(shí)驗(yàn)組大鼠中耳周圍黏膜，置于凍存管，液氮-80℃冷藏保存。聽(tīng)泡4%多聚甲醛固定后行免疫組化染色。

1.5 定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)檢測(cè)

大鼠中耳黏膜樣本分離并均質(zhì)化后，按照qP?CR試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行操作。首先進(jìn)行總RNA的提取及純化，然后調(diào)整RNA模板體系，由RNA合成cDNA。最后配制體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，qPCR檢測(cè)反復(fù)重復(fù)三次，以SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,數(shù)據(jù)結(jié)果分析以±s表示,以*P<0.05認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6 免疫組織化學(xué)染色

免疫組織化學(xué)染色采用SP法。MUC5AC及TNF-α單抗稀釋，稀釋倍數(shù)均為1：100，石蠟切片脫蠟、水化;3%H2O2去離子水孵育5～10min;切片滴加一抗(鼠抗人MUC5AC單克隆抗體及TNF-α單克隆抗體),37℃孵育2h,PBS洗片2min×3次;滴加山羊抗小鼠IgG抗體-HRP多聚體,37℃孵育20min,PBS洗片2min×3次;滴加DAB,光鏡下觀察,自來(lái)水沖洗;蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片。陽(yáng)性細(xì)胞結(jié)果判定：顯微鏡400或200倍鏡下任選5個(gè)不同視野觀察并計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞著色深淺及百分率，按陽(yáng)性細(xì)胞所占百分比計(jì)分，統(tǒng)計(jì)分析時(shí)（++）（+++）合計(jì)為陽(yáng)性表達(dá)[6]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析單向方差分析（ANOVA）以及Turkey’s test，且*P<0.05具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組中MUC5ACmRNA的表達(dá)情況

收集實(shí)驗(yàn)組（SOM組）及對(duì)照組中耳周圍區(qū)域黏膜，提取RNA后行qPCR檢測(cè)，具體方法同上。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MUC5ACmRNA表達(dá)量自內(nèi)毒素刺激第1天后開(kāi)始增加，至第3天達(dá)到最高，第7天減弱，呈現(xiàn)時(shí)間依賴性；所有數(shù)據(jù)與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P<0.05），表明內(nèi)毒素刺激誘導(dǎo)的大鼠急性分泌性中耳炎模型的中耳黏膜中MUC5ACmRNA表達(dá)的上調(diào)，有時(shí)間依賴性（圖1）。

圖1 MUC5ACmRNA在大鼠中耳黏膜的相對(duì)表達(dá)量Fig.1 The expression of MUC5ACmRNA in themiddle ear mucosa of each group

2.2 實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組中TNF-αmRNA的表達(dá)情況

收集實(shí)驗(yàn)組（SOM組）及對(duì)照組中耳周圍區(qū)域黏膜，提取RNA后行qPCR檢測(cè)，具體方法同上。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TNF-αmRNA表達(dá)量自內(nèi)毒素刺激第1天后開(kāi)始增加，至第3天達(dá)到最高，第7天則表達(dá)減弱，呈現(xiàn)時(shí)間依賴性；所有數(shù)據(jù)與對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*P<0.05），表明內(nèi)毒素刺激誘導(dǎo)的大鼠急性分泌性中耳炎模型的中耳黏膜中TNF-αmRNA表達(dá)上調(diào)，與時(shí)間相關(guān)（圖2）。

圖2 TNF-αmRNA在大鼠中耳黏膜的相對(duì)表達(dá)量Fig.2 The expression of TNF-αmRNA in them iddle earmucosaof each group

2.3 實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組MUC5AC免疫組化染色觀察結(jié)果

黏蛋白MUC5AC免疫組化染色顯示：實(shí)驗(yàn)組黏蛋白MUC5AC在鼓室黏膜上皮的杯狀細(xì)胞、腺體細(xì)胞的包漿中陽(yáng)性表達(dá)，表現(xiàn)為較均勻的棕黃色的細(xì)顆粒狀（圖3-Fig3B,3Cand 3D）；對(duì)照組的正常鼓室黏膜無(wú)明顯MUC5AC表達(dá)（圖3）。MUC5AC在實(shí)驗(yàn)組表達(dá)顯著高于對(duì)照組，與對(duì)照組相比有顯著性差異（*P<0.05）；實(shí)驗(yàn)組的中耳黏膜在第1d組開(kāi)始陽(yáng)性表達(dá)，3d組陽(yáng)性表達(dá)最強(qiáng)，7d組開(kāi)始減弱，MUC5AC表達(dá)具有時(shí)間依賴性（圖5）。

2.4 實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組TNF-α免疫組化染色觀察結(jié)果

TNF-α免疫組化染色顯示：實(shí)驗(yàn)組（SOM組）腫瘤壞死因子TNF-α在鼓室黏膜上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等的包漿中陽(yáng)性表達(dá)，表現(xiàn)為著色較深的棕黃色的顆粒狀（圖4）；對(duì)照組個(gè)別大鼠的正常鼓室黏膜有陽(yáng)性的TNF-α表達(dá)（圖3）。TNF-α在實(shí)驗(yàn)組表達(dá)顯著高于對(duì)照組，與對(duì)照組相比有顯著性差異（*P<0.05）；內(nèi)毒素誘導(dǎo)的大鼠急性分泌性中耳炎模型實(shí)驗(yàn)組的中耳黏膜，在第1天，3天，TNF-α表達(dá)隨時(shí)間依賴性增多，第7天表達(dá)明顯減弱（圖5）。

圖3 黏蛋白MUC5AC在大鼠中耳黏膜的表達(dá)(SP×400)Fig.3 The expression of MUC5AC in them iddle earmucosa of each group(SP×400)

圖4 腫瘤壞死因子TNF-α在大鼠中耳黏膜的表達(dá)(SP×200)Fig.4 Theexpression of TNF-αin themiddleearmucosaof each group(SP×200)

圖5 黏蛋白MUC5AC和腫瘤壞死因子TNF-α在大鼠中耳黏膜表達(dá)的陽(yáng)性率Fig.5 The positive rate of MUC5AC and TNF-αin the m iddleearmucosaof each group

3 討論

分泌性中耳炎(otitismediawith effusion,OME)是耳科的常見(jiàn)疾病之一，以中耳積液及聽(tīng)力下降為主要臨床特征，是一種小兒常見(jiàn)的中耳非化膿性疾病，與兒童的語(yǔ)言及智力發(fā)育密切相關(guān)[7]。應(yīng)用內(nèi)毒素造成大鼠急性分泌性中耳炎模型，快速、有效，是分泌性中耳炎的常見(jiàn)模型之一。

近年來(lái)，通過(guò)對(duì)中耳黏液纖毛傳輸系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)，中耳黏膜、中耳積液中的黏蛋白和細(xì)胞因子的表達(dá)，逐漸成為耳科分子生物學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)研究熱點(diǎn)[8]。黏液纖毛傳輸系統(tǒng)是由中耳黏膜及黏液毯組成，這一系統(tǒng)的主要成分是黏蛋白。至今已發(fā)現(xiàn)13種不同類型的黏蛋白(MUC1—4, MUC5AC,MUC5B,MUC6—12)。 其 中 ，MUC1、MUC4為跨膜型黏蛋白，MUC2、MUC5AC、MUC5B、MUC6、MUC7、MUC8為分泌型黏蛋白。黏蛋白存在于黏膜表面，起著保護(hù)上皮和保持纖毛清除并防止病原體黏附的作用[9-10]。其中MUC5AC由杯狀細(xì)胞分泌，是構(gòu)成黏液毯的主要成分。然而MUC5AC在分泌性中耳炎的作用機(jī)理還未完全闡明。

細(xì)胞因子是指某些刺激因素作用下，由免疫細(xì)胞（單核巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞）和某些非免疫細(xì)胞(如血管內(nèi)皮細(xì)胞、纖維母細(xì)胞等)合成、分泌的一類生物活性物質(zhì)。其中TNF-α對(duì)于炎癥的重要作用，使得它與黏蛋白之間的關(guān)系探討顯得尤為重要。在分泌性中耳炎病程初期，中耳腔局部產(chǎn)生的TNF-α可以直接作用于中耳黏膜，造成黏膜水腫、通透性增強(qiáng)，破壞纖毛黏液傳輸系統(tǒng)的功能。并有體外實(shí)驗(yàn)研究表明：經(jīng)TNF-α處理的鼠中耳黏膜上皮4小時(shí)后出現(xiàn)MGP(黏蛋白)分泌，并持續(xù)到24小時(shí)，而且具有時(shí)間和劑量依賴性[11-12]。然而TNF-α在分泌性中耳炎大鼠實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷淖饔脵C(jī)制及與黏蛋白的關(guān)系，還未完全明確。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用內(nèi)毒素構(gòu)造急性大鼠分泌性中耳炎模型，采用qPCR和免疫組化染色技術(shù)SP法測(cè)定MUC5AC和TNF-αmRNA和免疫組化染色中耳黏膜的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)表明：內(nèi)毒素誘導(dǎo)的大鼠急性分泌性中耳炎模型的中耳黏膜中MUC5AC及TNF-αmRNA表達(dá)上調(diào)，有時(shí)間依賴性。MUC5AC及TNF-α在中耳黏膜免疫組化染色表達(dá)上調(diào)，隨時(shí)間延長(zhǎng)而出現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)改變。TNF-α可以刺激杯狀細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等分泌黏液，使病程慢性化，促進(jìn)了分泌性中耳炎的發(fā)展和遷延不愈。本研究的結(jié)果初步證實(shí)了TNF-α與中耳黏膜的黏蛋白MUC5AC分泌有一定的關(guān)系。提示炎性細(xì)胞因子在黏蛋白基因的表達(dá)機(jī)制中起重要作用，然而何種通路調(diào)節(jié)黏蛋白基因表達(dá)仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，MUC5AC及TNF-α表達(dá)于內(nèi)毒素激發(fā)的急性分泌性大鼠中耳炎模型的中耳黏膜中，在分泌性中耳炎的發(fā)生過(guò)程可能發(fā)揮了重要作用，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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Expression ofMUC5AC and TNF-αin M iddle Ear M ucosa in a RatM odelofAcute OtitisM ediaW ith Effusion

WANGMenghang1,LeeSu Jeong1,Han Lin2,YU Lisheng2
1DepartmentofOtolaryngology Head and Neck Surgery,Peking University InternationalHospital,Peking University, Beijing,102206,China
2DepartmentofOtolaryngology Head and Neck Surgery,People’sHospital，Peking University，Beijing 100044，China

YU Lisheng Email：yulish68@163.com

ObjectiveTo study expression of MUC5AC and TNF-αin them iddle earmucosa in ratmodelof acute otitismediaw ith effusion.M ethodsForty adult female Sprague-Daw lay(SD)ratswere random ly divided into a control group and aexperimentalgroup.Rats in the experimentalgroup

injection of endotoxin.The leveland pattern of MUC5AC and TNF-αexpression w ithin themiddle ear epithelium were tested by qPCR and immunohistochemical assays.ResultsqPCR and immunohistochemical staining results showed increased expression of MUC5AC and TNF-αin the experimentalgroup alongw ith time(*P<0.05)and theMUC5ACweremainly concentrated on the gobletcells.ConclusionsExpression ofMUC5AC and TNF-αis increased in ratmiddle ear epithelium w ith acutemedia otitisw ith effusion.Hence,it isspeculated thatMUC5AC and TNF-αmay participate in the processof acutemediaotitisw ith effusion.

MUC5AC;TNF-α;M iddle Ear Epithelium;AcuteMedia OtitisWith Effusion

R764

A

1672-2922（2017）03-329-5

2016-12-21審核人：郭維維）

10.3969/j.issn.1672-2922.2017.03.011

十二五國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2012BAI12B01），國(guó)家自然科學(xué)基金科學(xué)基金項(xiàng)目（11202018），中國(guó)博士后科學(xué)基金項(xiàng)目（20110490269,2013T60055），北京大學(xué)國(guó)際醫(yī)院院內(nèi)科研基金（YN2016QN03）。

王夢(mèng)航，博士后，主治醫(yī)師，研究方向:耳科臨床及基礎(chǔ)研究

余力生，Email:yulish68@163.com