張 濤，陶菊紅，朱建一，沈宗根

（常熟理工學院 生物與食品工程學院，江蘇 常熟 215500）

溫度對南黃海定生綠藻光合生理影響的研究

張 濤，陶菊紅，朱建一，沈宗根

（常熟理工學院 生物與食品工程學院，江蘇 常熟 215500）

本研究以南黃海定生綠藻為材料，在室內(nèi)不同溫度下進行培養(yǎng)，通過對葉綠素熒光等參數(shù)進行測定，研究了溫度對其光合生理特征的影響. 結(jié)果表明：采集定生綠藻形態(tài)特征與腸滸苔相似，該綠藻在低溫條件下（5 ℃）藻體最大量子效率（Fv/Fm）、實際量子效率（ΔF/Fm'）以及相對電子傳遞速率（rETR）等參數(shù)均顯著低于其他處理組樣品，而20 ℃下樣品的上述葉綠素熒光參數(shù)均高于其他處理組. 誘導(dǎo)曲線表明，在給定光照條件下，20 ℃下樣品光化學猝滅（qP）最高，而5 ℃處理組最低，非光化學猝滅（NPQ）結(jié)果則相反，5 ℃處理組樣品要顯著高于其他溫度處理. 本研究結(jié)果說明，溫度對定生綠藻的光合生理活性有較大影響，20 ℃下該綠藻光合生理活性活躍，而低溫條件會明顯抑制其光能的吸收利用，溫度的進一步上升也會降低其光合活性．

定生綠藻；光合作用；葉綠素熒光；溫度

1 引言

自2007年以來，我國近海綠藻研究吸引了國內(nèi)外研究者的高度關(guān)注，尤其是2008年青島近海海域出現(xiàn)大面積漂浮滸苔，綠潮的發(fā)生不僅影響了海區(qū)的生態(tài)環(huán)境，也給當?shù)貛砹司薮蟮慕?jīng)濟損失［1-2］. 有研究認為漂浮綠藻是源自黃海南部海域［3-4］，但是對漂浮滸苔的組成物種研究仍存在爭議［5-6］，目前從形態(tài)、分子水平、生活史等方面對漂浮綠藻物種進行了研究，也取得了一定的進展［7-8］. 科研人員也對漂浮綠藻的環(huán)境適應(yīng)能力及生理特征進行了研究，從光合作用、營養(yǎng)鹽吸收、繁殖等角度探討了漂浮綠藻發(fā)生的過程及機制［2，9-13］，但是對定生綠藻的相關(guān)研究則有明顯不足.

黃海南部海區(qū)是我國條斑紫菜主產(chǎn)區(qū)，從20世紀60年代左右開始發(fā)展紫菜產(chǎn)業(yè)，至今已有五十多年的歷史，目前已形成育苗、栽培、加工和銷售完整的產(chǎn)業(yè)鏈［14-15］. 有報道認為漂浮綠藻發(fā)生自黃海南部紫菜栽培海區(qū)的定生綠藻［11］，但目前對源頭的研究仍存在爭議，而且定生綠藻與漂浮綠藻在物種組成、生理特征等方面表現(xiàn)出差異［16-17］. 事實上，紫菜栽培深受綠藻入侵的困擾，尤其是在每年的10月份、次年的4月份左右，綠藻侵占紫菜生長空間，從而增加了紫菜加工的勞動力投入，更造成紫菜產(chǎn)品品質(zhì)的下降. 因此，研究黃海南部定生綠藻的環(huán)境適應(yīng)能力，尤其是不同溫度下定生綠藻的生理活性，將有助于對紫菜栽培區(qū)定生綠藻的防控.

2 材料與方法

2016年3月13日采自江蘇南通如東紫菜栽培筏架上定生綠藻滸苔，樣品置于冰盒中，4 h內(nèi)運送至實驗室進行處理. 材料先用海水洗凈，除去雜藻，加入滅菌海水培養(yǎng)，溫度為20 ℃，光照維持在50 μmol·m-2·s-1左右，預(yù)培養(yǎng)2 d后進行溫度處理.

在光照培養(yǎng)箱（MLR-352-PC，Sanyo，日本）內(nèi)進行藻體的培養(yǎng)，光照強度設(shè)為50 μmol·m-2·s-1，藻體培養(yǎng)于鹽度24‰、pH值8.2的海水中，海水經(jīng)暗沉淀30 d以上、煮沸后冷卻至室溫備用. 溫度設(shè)定為5，10，15，20，30 ℃ 5組，光周期為12D∶12L. 處理期間每天更換新鮮滅菌海水.

定生綠藻形態(tài)觀察：挑取完整的綠藻樣品，觀察滸苔外觀形態(tài)，同時選取健康藻體，經(jīng)徒手切片并制片，顯微鏡（90i，Nikon）觀察并拍照.

葉綠素熒光特征測定：樣品PSII活性用葉綠素熒光儀（Water-PAM，德國）進行測定. 包括以下參數(shù)：

實際量子效率（ΔF/Fm'）：使用光纖探頭，將探頭伸入三角瓶內(nèi)垂直對準葉狀體表面進行測定. 照光后每隔4 h對樣品實際量子效率進行測定，首先提供0.3 μmol·m-2·s-1調(diào)制紅光和40 μmol·m-2·s-1活化光，測得該條件下穩(wěn)態(tài)熒光值，即Ft；隨后提供0.8 s約4000 μmol·m-2·s-1飽和脈沖光，即測得該光強下最大熒光值Fm'. 將所得參數(shù)代入以下方程計算PSII實際量子效率：

快速光曲線（RLC）：將樣品暴露在連續(xù)光強梯度43，64，92，138，209，309，479和714 μmol·m-2·s-1下，每個光強照射20 s，當Ft達到穩(wěn)態(tài)時再施加0.8 s，4000 μmol·m-2·s-1的飽和脈沖光，測得樣品的最大熒光值Fm'；Ft為任意時間實際熒光產(chǎn)量，相對電子傳遞速率（rETR）由公式獲得：

其中系數(shù)0.84表示在入射的光量子中被吸收部分占84%，PFD是光子通量密度. 以PFD和rETR為x和y軸作圖獲得快速光曲線（RPL）.

誘導(dǎo)曲線（Induce Curve）：樣品暗適應(yīng)30 min以上，確保PSII處于開放狀態(tài). 打開約0.3 μmol·m-2·s-1的測量光，測定最小熒光值（Fo），然后提供0.8 s約4000 μmol·m-2·s-1飽和脈沖光，測得最大熒光值（Fm），隨后關(guān)閉光源，40 s后打開活化光，之后每隔20 s照射一次飽和脈沖光，直至給定活化光下最大熒光值（Fm'）和最小熒光值（Fo'）達到穩(wěn)定. 所測得熒光值經(jīng)以下公式計算最大量子效率（Fv/Fm）、光化學猝滅（qP）和非光化學猝滅（NPQ）：

Fv/Fm=(Fm-Fo）/Fm；qP=(Fm'-F）/(Fm'-Fo'）；NPQ=(Fm-Fm'）/Fm'.

統(tǒng)計分析：所有實驗中均設(shè)3~5個重復(fù)，試驗數(shù)據(jù)表示為平均值±標準差（n≥3），所得數(shù)據(jù)結(jié)果經(jīng)t-檢驗分析，以P<0.05為差異顯著水平.

3 結(jié)果

由圖1可知，采集定生綠藻藻體綠色，膜質(zhì)，管狀，藻體部分為中空結(jié)構(gòu)，具分枝；細胞排列緊密，葉綠體布滿整個細胞. 依據(jù)上述生物學特征，該綠藻類似腸滸苔（Ulva intestinalis）.

不同溫度處理后，定生綠藻最大量子效率

（Fv/Fm）表現(xiàn)出一定差異（見圖2），20 ℃處理組Fv/Fm最高，10，15和30 ℃處理組樣品間差異不

顯著（P＞0.05），且均略低于20 ℃處理組；而5 ℃處理組樣品Fv/Fm最低，顯著低于20和30 ℃處理組（P＜0.05）.

圖1 定生綠藻形態(tài)及細胞觀察（A）外部形態(tài)；（B）細胞形態(tài)

圖2 不同溫度處理綠藻最大量子效率結(jié)果

定生綠藻在不同溫度下的實際量子效率（ΔF/Fm'）日變化有一定的規(guī)律性（見圖3），除5 ℃下樣品在處理第1天照光7 h、第2天照光4 h時ΔF/Fm'出現(xiàn)下降外，其他3組處理均隨光照時間的延長而表現(xiàn)出不同幅度的上升；不同溫度處理組間ΔF/Fm'存在差異，5 ℃下藻體ΔF/Fm'顯著低于其他3組處理（P＜0.05）；在處理的第1天，20 ℃下樣品ΔF/Fm'最高，顯著高于10 ℃處理組（P＜0.05），略高于15和30 ℃處理組，但差異不顯著（P＞0.05），在處理第2天，仍以20 ℃下樣品ΔF/Fm'最高.

對快速光曲線（Rapid Light Curve， RLC）的測定表明（見圖4），所有樣品相對電子傳遞速率（rETR）在給定的光照梯度下均呈現(xiàn)低光強區(qū)間快速上升、達到一定光照強度后維持穩(wěn)定的變化趨勢；5 ℃下樣品rETR在光照強度達到200 μmol·m-2·s-1以上時，要顯著低于其他處理組（P＜0.05）；20 ℃下樣品rETR略高于其他處理組，15和10 ℃處理組次之，30 ℃下樣品rETR在光照強度超過600 μmol·m-2·s-1以后明顯下降，僅略高于5 ℃處理組樣品；5 ℃處理組樣品rETR在光照高于200 μmol·m-2·s-1以后顯著低于10，15和20 ℃ 3個溫度處理組（P＜0.05）.

對不同光照強度下樣品誘導(dǎo)曲線（Induce Curve）測定表明（表1），在給定光照強度下，綠藻樣品光化學淬滅參數(shù)（qP）隨處理溫度的上升而逐漸升高，由5 ℃下的0.58升至20 ℃下的0.79（P＜0.05），30 ℃處理組樣品qP略有降低；與qP結(jié)果相反，非光化學猝滅參數(shù)（NPQ）隨處理溫度的上升而逐步下降，5 ℃和10 ℃處理組樣品NPQ差異不顯著（P＞0.05），均維持在0.46左右，但兩個處理組樣品NPQ均顯著高于其他溫度處理組（P＜0.05）.

圖3 不同溫度下樣品實際量子效率變化

圖4 不同溫度下定生綠藻RLC測定結(jié)果

4 討論

黃海海區(qū)定生綠藻物種多樣，本研究采集的物種為常見定生綠藻，根據(jù)形態(tài)特征及細胞色素體的分布特點及相關(guān)報道［16］，初步判定為腸滸苔. 該綠藻采集時間為3月份，此時海水溫度在10 ℃以上，從海區(qū)分布情況來看，該物種已有了一定的生物量，說明此時的海水溫度已處于其生長的適宜溫度范圍. 我們的研究也表明，該定生綠藻在10 ℃以上時，能夠保持一定的實際量子效率和電子傳遞速率，對光能的吸收和利用能力較3月份以前的較低水溫環(huán)境下有明顯的提高.

表1 不同溫度下樣品誘導(dǎo)曲線參數(shù)測定結(jié)果

供試綠藻在不同的溫度下表現(xiàn)出差異明顯的光合生理活性，在低溫下（5 ℃），其Fv/Fm、ΔF/Fm'、qP等值明顯降低，而NPQ等值升高，這共同說明低溫會引起藻體光能利用效率的下降，進而影響光合活性，導(dǎo)致生物量的降低. 對海區(qū)紫菜生長情況的研究表明，在海水溫度較低時期，紫菜葉狀體能夠維持較好的光合生理狀態(tài)，保持生長競爭力［18］，因此筏架上入侵綠藻生物量很少. 而隨著海水溫度的上升，定生綠藻對光能的吸收和利用能力不斷提升，在水溫達到20 ℃以上時，綠藻光合生理活性達到最適狀態(tài)，進而促進生物量的積累，這與吳洪喜等的研究結(jié)果相似［19］，石莼屬綠藻的最適生長水溫在20~25 ℃，此時綠藻能夠達到最大生長量，我們的結(jié)果從光合生理的角度解釋了海區(qū)定生綠藻在4—5月份生物量逐步上升的現(xiàn)象. 隨著處理溫度的進一步上升，在30 ℃下，定生綠藻材料光能利用效率表現(xiàn)出下降的趨勢，說明光合活性受高溫的影響而有所降低，這也使得海水溫度超過30 ℃時，石莼屬綠藻生物量呈下降趨勢［20］.

通過對定生綠藻在不同溫度下光合生理活性的測定，從生理特征的角度闡明了該綠藻對溫度的適應(yīng)情況，為海區(qū)定生綠藻發(fā)生、發(fā)展和消亡的過程提供了實驗支持，也為今后開發(fā)出適用的綠藻清除技術(shù)手段提供了理論支持.

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Abstract:In this paper, the authors cultured the attached green alga collected from the South Yellow Sea under different temperature, and studied the effect of temperature on the photosynthetic physiology characteristic of this green alga through the measurement of chlorophyll florescence parameters. The results indicated that the morphological characteristic of the attached alga was similar to that of Ulva intestinalis. The Fv/Fm, Δ F/Fm'

and rETR of sample cultured under 5℃ were significantly lower than those of algae cultured under other four temperatures, and those chlorophyll fluorescence parameters of sample cultured under 20 ℃ were higher than other treatments. The measurement of induce curves also indicated that the photochemical quenching (qP) of the sample cultured under 20 ℃ was the highest and the sample under 5 ℃ was lowest in all temperature treatments, and that the non-photochemical quenching (NPQ) results were opposite to that of qP. And algae cultured under 5℃ showed the highest NPQ in all treatments. According to the research, temperature had a close relationship with the photosynthetic characteristics of the attached alga. Low temperatures obviously inhibited the light use efficiency of sample, and 20 ℃ was optimal for photosynthetic physiology of the attached green alga, but when the temperature increased much higher, the photosynthetic activity also decreased.

Key words:attached green alga; photosynthesis; chlorophyll fluorescence; temperature

A Study on the Effect of Temperature on the Photosynthetic Physiology of Attached Green Algae in the South Yellow Sea

ZHANG Tao, TAO Juhong, ZHU Jianyi, SHEN Zonggen
(School of Biology and Food Engineering, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500, China)

P735

A

1008-2794（2017）04-0095-05

2017-05-20

張濤，副研究員，博士，研究方向：植物生理與生物化學，E-mail: zhangtao@cslg.edu.cn.