李 佳，陳 偉，樊澤璐，武艷虹，郭晉宏，郭雅坤，王祎玲

（山西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 臨汾 041000）

七里峪三裂繡線菊種群的遺傳分化研究

李 佳*，陳 偉*，樊澤璐，武艷虹，郭晉宏，郭雅坤，王祎玲

（山西師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西 臨汾 041000）

采用Simple Sequence Repeats（SSR）分子標(biāo)記對三裂繡線菊（Spiraea trilobata L.）8個(gè)海拔的種群進(jìn)行遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)分析. 結(jié)果表明，17對具有穩(wěn)定多態(tài)性的SSR引物，共被檢測出380個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，多態(tài)位點(diǎn)百分率（PPB）為59.61%；觀察等位基因平均數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Shannon多樣性指數(shù)（I）、Nei's基因多樣性指數(shù)（H）分別為1.596 1，1.309 3，0.287 4，0.187 7. 三裂繡線菊種群間的遺傳多樣性較高；種群內(nèi)的遺傳變異高于種群間（GST=0.309 7），說明種群內(nèi)變異是其主要變異來源. 8個(gè)種群明顯聚為兩支，海拔最高的兩個(gè)種群（種群7、8）聚為一支，與PCoA和Structure分析結(jié)果相吻合. 本文結(jié)果可為三裂繡線菊種質(zhì)資源保護(hù)和可持續(xù)開發(fā)利用提供科學(xué)的理論依據(jù).

三裂繡線菊；SSR；遺傳多樣性；遺傳差異

1 引言

三裂繡線菊（Spiraea trilobata L.）為薔薇科（Rosaceae）繡線菊屬（Spiraea L.）落葉灌木，主要分布于華北、華東、西北、西南、華中及東北等地，常生長于海拔450~2 400 m的多巖石向陽坡、林緣、路邊和溝旁等地的灌木叢中，具有很高的觀賞價(jià)值和藥用價(jià)值［1-2］. 目前對三裂繡線菊的研究主要集中在內(nèi)部成分、生物學(xué)特性等方面［3-8］，如三裂繡線菊的引種實(shí)驗(yàn)和抗旱性研究、土壤成分對葉結(jié)構(gòu)的影響、身份證的構(gòu)建和區(qū)分.

Simple Sequence Repeats（SSR）又叫微衛(wèi)星DNA（Microsatellite DNA），在真核生物基因組中大量存在，分布在結(jié)構(gòu)基因之間［7］. SSR是由2~6個(gè)堿基構(gòu)成的基本重復(fù)單元串聯(lián)重復(fù)而產(chǎn)生的長度達(dá)幾十個(gè)堿基的序列，不同材料在同一重復(fù)區(qū)段的重復(fù)次數(shù)不完全相同，當(dāng)選用與重復(fù)區(qū)域兩側(cè)高度保守的序列（一般是單拷貝）互補(bǔ)的特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，就可用電泳檢測出該重復(fù)區(qū)域的多型性［8］. 目前，SSR己廣泛地應(yīng)用于遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、基因定位、品種鑒定、種質(zhì)分類及遺傳多樣性研究［9-13］.

本文采用SSR分子標(biāo)記對三裂繡線菊不同海拔種群進(jìn)行遺傳差異分析，旨在揭示三裂繡線菊不同種群的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)，分析遺傳變異與環(huán)境變化之間的關(guān)系，為進(jìn)一步分析其進(jìn)化歷史、進(jìn)化潛力和未來命運(yùn)提供重要的資料.

2 材料與方法

2.1 材料采集

根據(jù)三裂繡線菊在山西七里峪的分布，從1 000 m海拔開始采集，海拔之間相隔100 m，每個(gè)海拔各采集20個(gè)個(gè)體，共采集8個(gè)海拔種群，分別記為1（1 000 m），2（1 100 m），3（1 200 m），4（1 300 m），5（1 400 m），6（1 600 m），7（1 700 m），8（1 900 m）. 每個(gè)海拔收集新鮮健康的幼嫩葉片，用變色硅膠迅速干燥，變色后立即更換直至葉片變脆，帶回實(shí)驗(yàn)室，置于冰箱低溫保存并進(jìn)行實(shí)驗(yàn)分析.

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 DNA的提取與檢測

運(yùn)用改良的2×CTAB法［14］提取三裂繡線菊基因組的DNA. 用紫外分光光度計(jì)和0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量，在-20 ℃保存?zhèn)溆?

2.2.2 SSR-PCR擴(kuò)增引物篩選與擴(kuò)增

從28對SSR通用引物中篩選出擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰，重復(fù)性好的17對引物（見表1），對所有的DNA個(gè)體樣本進(jìn)行擴(kuò)增. 實(shí)驗(yàn)根據(jù)不同引物的Tm值設(shè)計(jì)12個(gè)溫度梯度，確定不同引物的退火溫度.

反應(yīng)體系及程序：15 μL反應(yīng)體系（4.5 μL引物，0.8 μg DNA，7.5 μL 2×Mix）中，95 ℃ 4 min；35個(gè)循環(huán)（94 ℃ 50 s，（Tm梯度）1 min，72 ℃1 min）；72 ℃ 10 min；10 ℃保存.

用濃度為12%的聚丙烯酰氨凝膠電泳分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物. 緩沖液為1×TBE，取6 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行點(diǎn)樣，2 μL Marker作為標(biāo)尺，電壓200 V、電流30 mA，電泳時(shí)間約為3 h. 電泳結(jié)束后，小心取下膠并放

置在倒有固定液的搖膠盒中，搖至藍(lán)色條帶消失（搖動(dòng)過程中盡量保持勻速）；再用雙蒸水清洗2 min，倒掉并控水，加入AgNO3染色液染色10~15 min；染色結(jié)束后，用雙蒸水沖洗凝膠2~3次，加入含1.5% NaOH和0.4% HCHO的顯影液，搖至所有條帶顯現(xiàn)為止；取出凝膠，拍照保存并記錄數(shù)據(jù).

表1 三裂繡線菊SSR擴(kuò)增引物

2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

根據(jù)所得到的凝膠電泳圖像，對每個(gè)位點(diǎn)是否存在條帶分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，有條帶的計(jì)數(shù)為“1”，無條帶的計(jì)數(shù)為“0”，最終得到原始的“0，1”數(shù)據(jù)矩陣.

運(yùn)用POPGENE V1.32軟件對每個(gè)矩陣位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，分析得到等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、多態(tài)位點(diǎn)百分率（PPB）、Shannon多樣性指數(shù)（I）、Nei's基因多樣性指數(shù)（H）等相關(guān)參數(shù).

根據(jù)Nei's基因遺傳距離，采用NTSYS軟件聚類分析不同海拔種群的親緣關(guān)系，Treeplot模塊生成樹狀聚類圖. 運(yùn)用GenAlEx V6.1軟件進(jìn)行PCoA分析，揭示不同種群個(gè)體間的相互關(guān)系；運(yùn)用Structure V2.2軟件分析其遺傳結(jié)構(gòu)，估計(jì)其最佳群體組群數(shù)K，設(shè)定取值范圍為2~8，根據(jù)Structure harvester軟件分析得到最佳K值.

表2 三裂繡線菊遺傳多樣性指數(shù)

3 結(jié)果與分析

3.1 三裂繡線菊的遺傳多樣性

不同海拔種群的等位基因數(shù)（Na）的波動(dòng)范圍在1.534 2~1.686 8之 間，平 均值為1.596 1；有效等位基因數(shù)（Ne）處于1.271 0~1.372 0之 間，平 均 值 為1.309 3；Shannon多樣性指數(shù)（I）變動(dòng)范圍為0.261 1~0.332 3，平均值為0.287 4；Nei's基因多樣性指數(shù)（H）在0.169 2~0.220 2之間，平均值為0.187 7；多態(tài)位點(diǎn)百分率（PPB）介于53.42%~68.68%之間，平均值為59.61%（見表2）. H、I和PPB均表明三裂繡線菊種群的遺傳多樣性較高.

在各項(xiàng)遺傳多樣性指數(shù)中，種群2的遺傳多樣性最高（Na=1.686 8；Ne=1.3588；H=0.216 4；I=0.330 5；PPB=68.68%）；種群3的遺傳多樣性最低（Na=1.534 2；Ne=1.277 9；H=0.170 3；I=0.261 1；PPB=53.42%），三裂繡線菊的種群遺傳多樣性從大到小依次為種群2>7>8>4>6>5>1>3.

3.2 三裂繡線菊種群的遺傳結(jié)構(gòu)

三裂繡線菊8個(gè)不同海拔種群的遺傳分化系數(shù)GST為0.309 7，Nm值為1.114 4，說 明 不同海拔三裂繡線菊種群的遺傳多樣性主要存在于種群內(nèi). 種群之間的遺傳一致度介于0.835 1~0.968 2之間，遺傳距離介于0.032 3~0.180 6之間，種群7和8之間的遺傳一致度最高，種群1和8之間的遺傳一致度最低，表明種群7和8之間親緣關(guān)系最近，種群1和8之間親緣關(guān)系最遠(yuǎn)（見表3）.

表3 三裂繡線菊種群基于Nei's指數(shù)的遺傳距離（對角線下方）和遺傳一致度（對角線上方）

NTSYS聚類分析中，三裂繡線菊8個(gè)種群明確分為兩支：種群1，2，3，4，5和6聚為一支，種群7和8聚為一支，這個(gè)結(jié)果與PCoA分析結(jié)果（圖1）相吻合. Structure分析中，K=2時(shí)，△K達(dá)到最高值（圖2），與PCoA分析、NTSYS聚類（圖3）基本一致.

圖1 三裂繡線菊8個(gè)種群的PCoA分析圖

4 討論

遺傳多樣性是指生物所攜帶的遺傳信息的總和，是種群生存、進(jìn)化和發(fā)展的基石，反映了物種對于其生存環(huán)境的適應(yīng)能力和對非正常環(huán)境影響下的生存能力，同時(shí)作為生物多樣性的基礎(chǔ)和重要組成部分，是學(xué)者們長期研究的熱點(diǎn)［15-18］.一般來說，遺傳多樣性受很多因素的影響，如繁育體系、生物學(xué)特性、地理分布和種群大小等［19］.三裂繡線菊是多年生灌木植物，繁殖速度快且易成活，在長期的進(jìn)化過程中積累了一定量的遺傳變異. 另外，廣布種的遺傳多樣性水平要比分布狹窄的物種高，三裂繡線菊廣泛分布在中國地區(qū)，也是其遺傳多樣性較高的一個(gè)原因［20］. 而七里峪三裂繡線菊主要分布在海拔1 000~1 900 m左右的路邊向陽巖石上，這是該風(fēng)景區(qū)放牧和游玩的主要區(qū)域，因此我們采集材料的種群大小受到了一定的限制.

8個(gè)不同海拔三裂繡線菊種群的遺傳多樣性差異較為明顯，遺傳變異隨著海拔高度的升高呈低-高-低-高的分布，這種變異情況的產(chǎn)生可能來自于生存環(huán)境的異質(zhì)性. 七里峪采樣地屬于太岳山國家森林公園的重要組成部分，高海拔三裂繡線菊種群所處的生境多為陽坡，分布的灌木樹種比較少，主要以三裂繡線菊為亞優(yōu)勢種的群落居多，群落結(jié)構(gòu)單一，相對于低海拔生境更適合于其生長；而低海拔的群落正處于與紅柄白鵑梅、連翹等物種的交錯(cuò)區(qū)，并受到放牧、砍伐等人為干擾，導(dǎo)致三裂繡線菊種群間群落結(jié)構(gòu)及種類組成趨于單一［21］.

圖2 用Structure分析得到的8個(gè)三裂繡線菊種群遺傳結(jié)構(gòu)（K=2）

種群遺傳結(jié)構(gòu)是指遺傳多樣性在種群間和種群內(nèi)的分化［22］，本文中三裂繡線菊8個(gè)不同海拔種群的遺傳變異主要存在于種群內(nèi). 由于基因流在一定程度上能反映種群間遺傳物質(zhì)的交流，Wright以1作為評價(jià)基因流高低的臨界點(diǎn)，認(rèn)為基因流大于1能發(fā)揮其均質(zhì)化的作用；而小于1則說明基因流成為遺傳分化的主要原因［23］. 本文中三裂繡線菊種群間的Nm值為1.114 4，大于1，說明種群間存在基因交流，在一定程度上阻礙了種群間發(fā)生遺傳分化. 通過野外調(diào)查采樣發(fā)現(xiàn)，三裂繡線菊種子很容易萌發(fā)為幼苗，幼苗在向成株轉(zhuǎn)化階段的死亡率較低，增加了種群內(nèi)的遺傳多樣性. 三裂繡線菊為喜光物種，以種子繁殖，種群呈較強(qiáng)的集群分布，林隙和光斑對其種群結(jié)構(gòu)和功能起著重要作用［24-25］.另外，不同海拔高度的環(huán)境因子不同，海拔1 700~1 900 m土壤多為棕色森林土和山地草甸土，三裂繡線菊種群由于成年數(shù)量較多，對光照、水分等空間環(huán)境因子競爭激烈，產(chǎn)生自疏作用，個(gè)體空間分布相對均勻，增加了種內(nèi)遺傳變異度. 低海拔多為褐土帶，受人為干擾和破壞嚴(yán)重，形成的林緣、林隙相對較多，因其喜光以尋求光照，呈現(xiàn)較高程度的集群分布，降低了種內(nèi)的遺傳分化.

圖3 NTSYS三裂繡線菊種群之間遺傳距離聚類分析圖

［1］陸玲娣. 中國薔薇科繡線菊亞科的演化、分布：兼述世界繡線菊亞科植物的分布［J］. 植物分類學(xué)報(bào)，1996（4）：361-375.

［2］桂炳中，陳東青，高惠茹. 華北地區(qū)三裂繡線菊栽培養(yǎng)護(hù)［J］. 中國花卉園藝，2015（14）：44-45.

［3］肖芳. 三種繡線菊引種及抗旱適應(yīng)性研究［D］. 保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

［4］王芳，劉寧. 不同坡位野生三裂繡線菊和黃刺玫成年植株的葉特性［J］. 中國水土保持科學(xué)，2015（3）：117-123.

［5］李春紅. 幾種繡線菊生物學(xué)特性、地上生物量及繁殖技術(shù)研究［D］. 呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

［6］邢燕紅，燕玲，岳秀賢. 五種繡線菊屬植物的化學(xué)成分分析及其資源評價(jià)［J］. 干旱區(qū)資源與環(huán)境，2010（6）：143-148.

［7］李春紅. 幾種繡線菊生物學(xué)特性、地上生物量及繁殖技術(shù)研究［D］. 呼和浩特：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，2008.

［8］王芳，劉寧. 不同坡位野生三裂繡線菊和黃刺玫成年植株的葉特性［J］. 中國水土保持科學(xué)，2015，13（3）：117-123.

［9］謝云. 浙江紅山茶遺傳多樣性分析及觀賞價(jià)值評價(jià)［D］. 北京：中國林業(yè)科學(xué)研究院，2011.

［10］鄭常祥. 玉米二環(huán)系源雜交種親本選擇及其相關(guān)系的SSR分子標(biāo)記分析［D］. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

［11］于海萍. 牡丹SSR分子標(biāo)記的開發(fā)及其在親緣關(guān)系分析中的應(yīng)用［D］. 北京：北京林業(yè)大學(xué)，2013.

［12］李明芳. 荔枝SSR標(biāo)記的研究及其對部分荔枝種質(zhì)的遺傳多樣性分析［D］. ?？冢喝A南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003.

［13］ 林麗麗，張翠琴，王祎玲. 太白山獨(dú)葉草6個(gè)海拔種群的遺傳多樣性SSR分析［J］. 西北植物學(xué)報(bào)，2014（6）：1112-1118.

［14］淦國英，漆艷香，蒲金基，等. 改良CTAB法提取高質(zhì)量香蕉葉片總RNA［J］. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009（7）：192-195.

［15］陳靈芝. 中國的生物多樣性現(xiàn)狀及其保護(hù)對策［M］. 北京：科學(xué)出版社，1993：93-113.

［16］ KERR JT. Species Richness，Endemism and the Choice of Areas for Conservation［J］. Conservation Biology，1997，11：1094-1100.

［17］ 李丹，彭少麟. 三個(gè)不同海拔梯度馬尾松種群的遺傳多樣性及其與生態(tài)因子的相關(guān)性［J］. 生態(tài)學(xué)報(bào)，2001（3）：415-421.

［18］ 金則新，李鈞敏. 浙江天臺(tái)山不同海拔高度七子花種群遺傳多樣性及其與環(huán)境因子的相關(guān)性分析［J］. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)（理學(xué)版），2005，32（4）：452-458.

［19］ HAMRIEKE JL，GODT MJ W，SHERMAN-BROYES L. Factors in fluencing levels diversity in two plant species［J］. New Forest，1992（6）： 95-124.

［20］ TATE JA，SIMPSON BB. Paraphyly of Tarasa （Malvaceae） and diverse origins of the polyploidy species［J］. Systematic Botany， 2003， 28： 723-737.

［21］姚雪芹. 山西土莊繡線菊和三裂繡線菊群落特征研究［D］. 臨汾：山西師范大學(xué)，2016.

［22］ 黃瑋，孫平，張文生，等. 北京東靈山地區(qū)不同海拔柴胡種群的遺傳多樣性［J］. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2008（4）：453-457.

［23］WRIGHT S. Evolution in Mendelian population［J］. Genetics，1931，16：97-159.

［24］武小鋼，郭晉平. 關(guān)帝山華北落葉松天然更新種群結(jié)構(gòu)與空間格局研究［J］. 武漢植物學(xué)研究，2009，27（2）：165-170.

［25］ 李慶康，馬克平. 植物群落演替過程中植物生理生態(tài)學(xué)特性及其主要環(huán)境因子的變化［J］. 植物生態(tài)學(xué)報(bào)，2002，26（9）：109-116.

Abstract:In this study, simple sequence repeats were used to analyze the genetic diversity and genetic structure of Spiraea trilobata L. in eight populations. The results showed that 17 pairs had SSR primers with stable polymorphism, that a total of 380 polymorphic loci were detected, that the percentage of polymorphic band (PPB) was 59.61%, that the observed number of alleles (Na), the effective number of alleles (Ne), Shannon's information index (I) and Nei’s gene diversity (H) were 1.5961, 1.3093, 0.2874 and 0.1877 respectively, and that a higher level of genetic diversity among the populations of Spiraea trilobata L. The genetic diversity within populations was higher than among populations (GST=0.3097), indicating that variation within population was the main source of variation for its population. The eight populations were clustered into two groups, and the two highest altitude populations (7 and 8) were clustered into one group, which was consistent with the results of PCA analysis and structure. Not only can the result provide scientific theory basis for germplasm resources protection of Spiraea trilobata L., but it can also be used for its sustainable development and utilization.

Key words:SSR maker; Spiraea trilobata L; genetic diversity; genetic difference

Genetic Differentiation of Spiraea trilobata L. in Qiliyu

LI Jia , CHEN Wei , FAN Zelu, WU Yanhong, GUO Jinhong, GUO Yakun, WANG Yiling
(College of Life Sciences, Shanxi Normal University, Linfen 041000, China)

Q941

A

1008-2794（2017）04-0080-06

2017-05-20

王祎玲，教授，博士，研究方向：分子生態(tài)學(xué)，E-mail：ylwangbj@hotmail.com.

*李佳、陳偉為共同第一作者.