吳翼 李靜 楊耀東

摘要[目的]篩選可用的SSR分子標(biāo)記，加快椰子分子輔助育種進(jìn)程。[方法]采用改良CTAB法提取椰子基因組DNA，以基因組DNA為模板，對(duì)36對(duì)SSR引物進(jìn)行篩選，以條帶清晰、多態(tài)性豐富為引物篩選原則。[結(jié)果]共篩選出7對(duì)具有多態(tài)性的引物，其中2對(duì)多態(tài)性較豐富，可用于后續(xù)SSR分子標(biāo)記分析。[結(jié)論]該研究為開(kāi)展椰子種質(zhì)資源遺傳多樣性系統(tǒng)分析提供了SSR引物。

關(guān)鍵詞椰子；SSR；DNA提??；聚丙烯酰胺凝膠電泳

中圖分類(lèi)號(hào)S667.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼

A文章編號(hào)0517-6611（2017）17-0119-03

Abstract[Objective]To accelerate the molecular assisted breeding process of coconut by screening SSR markers.[Method] The genomic DNA was extracted by modified CTAB method，and 36 SSR primers were screened with genomic DNA as template.[Result]A total of 7 pairs of polymorphic primers were screened，of which more than 2 pairs of polymorphism were found，which could be used for subsequent SSR molecular marker analysis.[Conclusion]The study provides the SSR primers for analysis of coconut germplasm genetic diversity system.

Key wordsCoconut；SSR；DNA extraction；PAGE Gel

基金項(xiàng)目海南省國(guó)際合作專(zhuān)項(xiàng) （KJHZ2014-24）；農(nóng)業(yè)部熱帶作物種質(zhì)資源保護(hù)項(xiàng)目（16RZZY-104）。

作者簡(jiǎn)介吳翼（1980—），男，海南文昌人，助理研究員，碩士，從事熱帶油料作物分子生物學(xué)研究。*通訊作者，博士，研究員，從事熱帶油料作物分子生物學(xué)研究。

收稿日期2017-04-10

椰子（Cocos nucifera L.）是熱帶亞熱帶地區(qū)重要的木本油料作物和食品能源作物，具有投資少、管理簡(jiǎn)單、易生長(zhǎng)、收獲期長(zhǎng)、經(jīng)濟(jì)壽命長(zhǎng)、投資風(fēng)險(xiǎn)小、營(yíng)養(yǎng)豐富、用途廣泛等優(yōu)點(diǎn)，深受人們的喜愛(ài)。椰子全身是寶，被稱(chēng)為熱帶地區(qū)的“生命之樹(shù)”。但是椰子的生長(zhǎng)周期較長(zhǎng)，一般高種需要6～10年的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)，矮種也需要4～6年才能開(kāi)花。而傳統(tǒng)的育種手段太慢，且消耗大量的時(shí)間和人力。

分子標(biāo)記輔助育種是一種可以有效縮短育種周期的重要手段，且分子標(biāo)記技術(shù)從DNA水平上檢測(cè)物種的差異，有效避免了形態(tài)標(biāo)記和生化標(biāo)記的缺點(diǎn)，它不受環(huán)境和生長(zhǎng)階段影響，僅在苗期就可以對(duì)植物進(jìn)行評(píng)價(jià)。將分子標(biāo)記應(yīng)用于椰子育種中，是一種行之有效的育種手段。目前應(yīng)用于椰子中的分子標(biāo)記有很多種，例如RFLP、RAPD[1]、AFLP[2]、ISSR[3]等。SSR（simple sequence repeals）即簡(jiǎn)單重復(fù)序列[4-6]，又稱(chēng)為微衛(wèi)星DNA，是近年來(lái)在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種分子標(biāo)記技術(shù)，是由少數(shù)核苷酸（一般1～6 bp）為重復(fù)單位簇集而成的串聯(lián)重復(fù)序列，其在植物基因組中廣泛分布、數(shù)量豐富、多態(tài)性高、信息含量大、重復(fù)性好、檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可在親緣關(guān)系較近的品種間檢測(cè)遺傳差異，操作起來(lái)較靈活、簡(jiǎn)便、快速，易于分布，對(duì)DNA數(shù)量及質(zhì)量要求不高，即使是部分降解的樣品也可進(jìn)行分析。SSR分子標(biāo)記技術(shù)在植物遺傳圖譜構(gòu)建、種質(zhì)資源研究、基因定位、分子標(biāo)記輔助選擇、品種純度鑒定及雜種優(yōu)勢(shì)利用等方面都得到了大量應(yīng)用。椰子是椰子屬唯一的一個(gè)種，各品種間的親緣關(guān)系較近，目前可用于不同椰子品種間鑒定評(píng)價(jià)的SSR引物有限，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足椰子品種的快速鑒定和種質(zhì)資源遺傳關(guān)系的分析。該研究以5個(gè)海南常見(jiàn)的椰子品種共144份樣品為材料，對(duì)36對(duì)SSR引物進(jìn)行篩選，旨在獲得多態(tài)性SSR引物，為今后開(kāi)展椰子種質(zhì)資源遺傳多樣性系統(tǒng)分析提供更多的SSR引物。

1材料與方法

1.1 材料

取中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所種質(zhì)苗圃內(nèi)收集的黃矮椰子、紅矮椰子、本地高種、香水椰子、馬哇5個(gè)椰子品種共144份樣品的嫩葉為試驗(yàn)材料。

1.2試劑

（1）提取緩沖液：蔗糖119.8 g，1 mol/L Tris-HCl（pH 80）100 mL，0.5 mol/L EDTA（pH8.0）10 mL，PVP40 20 g，β-巰基乙醇（使用前加）30 mL，用DDH2O定容至1 000 mL，4 ℃保存。

（2）裂解液：1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）100 mL，NaCl 818 g，0.5 mol/L EDTA（pH8.0）40 mL，CTAB 20 g，PVP40 20 g，β-巰基乙醇（使用前加）30 mL，用DDH2O定容至1 000 mL，4 ℃保存。

（3）TE緩沖液：1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）1 mL，0.5 mol/L EDTA（pH8.0）0.2 mL，用DDH2O定容至100 mL，4 ℃保存。

（4）1 mol/L Tris-HCl（pH8.0）200 mL：Tris堿24.2 g，加160 mL DDH2O溶解，用濃HCl（約8 mL）調(diào)pH8.0。

（5）0.5 mol/L EDTA（pH8.0）100 mL：EDTA二鈉18.6 g，加80 mL DDH2O溶解，用NaOH（約2 g）調(diào)pH8.0，定容至100 mL，高壓滅菌后4 ℃保存。

（6）3 mol/L乙酸鈉（pH5.2）100 mL：三水合乙酸鈉40.8 g，加80 mL DDH2O溶解，用冰乙酸調(diào)pH 5.0，定容至100 mL，高壓滅菌后4 ℃保存。

（7）50×TAE緩沖液：Tris堿242.0 g，冰乙酸57.1 g，0.5 mol/L EDTA（pH8.0）100 mL，用DDH2O定容至1 000 mL。

（8）6×電泳緩沖液：溴酚藍(lán)0.125 g，蔗糖20 g，用DDH2O定容至50 mL，4 ℃保存。

（9）5×TBE 緩沖液（1 000 mL）：Tris堿54.0 g，硼酸27.5 g，0.5 mol/L EDTA（pH8.0）20 mL，用DDH2O定容至1 000 mL。

（10）1×TBE 緩沖液：5×TBE 緩沖液 200 mL，用DDH2O稀釋5倍至總體積1 000 mL。

（11）10%AP（50 mL）：過(guò)硫酸銨5 g，用DDH2O加至50 mL，攪拌溶解充分后，4 ℃保存。

（12）脫色液：50 mL乙酸，300 mL乙醇，定容至1 000 mL。

（13）保存液：5%～7%的乙酸。

（14）30%（29∶1）Acrylamide貯存液（500 mL）：Acrylamide 145 g，BisAcrylamide 5 g，用DDH2O定容至500 mL，過(guò)濾后于棕色瓶中4 ℃保存。

1.3方法

1.3.1DNA提取。稱(chēng)取1.2 g葉片，液氮磨成粉狀加入6 mL DNA提取緩沖液后轉(zhuǎn)至10 mL離心管中，8 000 r/min，4 ℃離心10 min，棄上清，加入5 mL預(yù)熱至65 ℃ 的DNA裂解緩沖液水浴90 min，每20 min搖勻1次；8 000 r/min，15 ℃離心10 min，取上清，加入等體積的氯仿∶異戊醇（24∶1），上下?lián)u勻后8 000 r/min，4 ℃離心10 min；取上清，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1），搖勻，8 000 r/min，4 ℃離心10 min；取上清，加入1/10體積的3 mol/L乙酸鈉（pH5.2）和6/10體積冰凍異丙醇，緩慢搖勻至有絮狀沉淀析出；8 000 r/min，4 ℃離心10 min，棄去液體，加入1 mL75%乙醇，振蕩，迅速倒入1 mL離心管，置于冰中；將已提取好的DNA用75%乙醇洗2次，室溫放置干燥，加入200 μLTE溶液溶解，置于4 ℃保存。

1.3.2DNA質(zhì)量檢測(cè)。

1.3.2.1瓊脂糖檢測(cè)。采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA：取2 μLDNA工作液于120 V，電泳30 min后在凝膠成像儀上觀察電泳條帶。

1.3.2.2核酸微量檢測(cè)。

取1 μL DNA在Nandrop儀（Thermo 公司）上測(cè)定其在230、260和280 nm下的吸光度值，計(jì)算OD260/OD280及OD260/OD230。

1.3.3SSR引物篩選。

1.3.3.1PCR擴(kuò)增體系及程序。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系的總體積為20 μL，其中10×Ex Taq Buffer 2 μL，25 mmol/L MgCl2 1.6 μL，4×DNTP Mixture 0.5 μL，10 μmol/L Primer各1 μL，基因組DNA 2 μL，5 U/μL Taq DNA polymerse 0.2 μL，加無(wú)菌DDH2O至20 μL，混勻后4 500 r/min，離心10 s。在TP1600梯度PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30次；72 ℃延伸10 min。

1.3.3.28%非變性聚丙烯酰胺凝膠的制備。H2O 15.81 mL，5×TBE 6 mL，30%（29∶1）貯存液7.98 mL，10%AP（過(guò)硫酸銨）0.21 mL，TEMED 0.015 mL，將以上溶液混合，勻速灌入聚丙烯酰胺凝膠電泳所用的2塊電泳玻璃板之間的縫隙中，放置3～5 h凝膠后備用。

1.3.3.3銀染方法。漂洗，用蒸餾水漂洗2遍；銀染，配制銀染液（AgNO3 1 g，無(wú)水乙醇50 mL，10%乙酸50 mL，蒸餾水 400 mL），在搖床上搖12 min，洗2遍，約30 s；顯影，配制顯影液（NaNO3 9 g ，甲醛3 mL，蒸餾水600 mL），在搖床上搖至條帶顯出，洗3遍；終止，Na2CO3 4.5 g，蒸餾水 600 mL，暫時(shí)保存，在掃描儀上進(jìn)行掃描，拍照，觀察。

1.3.3.4特異性引物篩選。

分別從5個(gè)不同椰子品種中隨機(jī)選取6個(gè)樣本作為PCR擴(kuò)增的DNA模板，對(duì)36對(duì)SSR引物進(jìn)行初篩，篩選出具有多態(tài)性的引物，再以5個(gè)品種共144份樣品的基因組DNA為模板，對(duì)其進(jìn)行復(fù)篩。

2結(jié)果與分析

2.1DNA提取結(jié)果

由表1可以看出，5個(gè)椰子品種共144個(gè)樣品的DNA質(zhì)量均較高。5個(gè)品種的DNA樣本OD260/OD280在1.98～2.02，OD260/OD230在1.86～2.00，估計(jì)有少量RNA污染，但是不影響后續(xù)的試驗(yàn)。瓊脂糖電泳檢測(cè)見(jiàn)圖1，電泳結(jié)果表明DNA條帶清晰，無(wú)彌散，不拖尾，點(diǎn)樣孔干凈，無(wú)蛋白和RNA污染，說(shuō)明DNA質(zhì)量較好。

2.2SSR引物篩選結(jié)果

選用5個(gè)椰子品種共30個(gè)樣品的DNA 作模板， 對(duì)該試驗(yàn)中合成的36對(duì)SSR引物進(jìn)行篩選，大部分引物能擴(kuò)增出清晰條帶，該研究以條帶清晰、多態(tài)性豐富為引物篩選原則， 36對(duì)引物中共篩選出7對(duì)具有多態(tài)性的引物，多態(tài)率達(dá)19.4%，具體序列見(jiàn)表2。再以5個(gè)椰子品種共144個(gè)樣品的基因組DNA為模板，對(duì)具有多態(tài)性的7對(duì)SSR引物進(jìn)行復(fù)篩，最后發(fā)現(xiàn)有2對(duì)SSR引物（HAYZ-D-QH-5506 和HAYZ-D-ZH-5506）多態(tài)性高且重復(fù)性好，可用于后續(xù)的遺傳多樣性分析，電泳結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3。

3討論

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于各種作物的遺傳和育種研究中；利用SSR 標(biāo)記的高多態(tài)性，結(jié)合相關(guān)分析、聚類(lèi)分析等數(shù)量遺傳分析手段，可以對(duì)不同親緣物種進(jìn)行分類(lèi)，判斷其親緣關(guān)系，評(píng)價(jià)不同品種的異質(zhì)性，并進(jìn)而劃分雜交優(yōu)勢(shì)群；篩選出擴(kuò)增性強(qiáng)、多態(tài)性和穩(wěn)定性好的引物是進(jìn)行全部基因組擴(kuò)增成敗的關(guān)鍵，尤其是種內(nèi)的擴(kuò)增，因?yàn)榉N內(nèi)的個(gè)體除自然變異外，其基因型沒(méi)有太多的差異，所以沒(méi)有多態(tài)性強(qiáng)、穩(wěn)定性好的引物很難區(qū)別個(gè)體內(nèi)的差異。SSR引物篩選是SSR分子標(biāo)記的前提，該研究以5個(gè)不同椰子品種的基因組DNA作模板，對(duì)36對(duì)SSR引物進(jìn)行篩選，由于種內(nèi)品種間遺傳關(guān)系較近，擴(kuò)增到的特異位點(diǎn)較少，36對(duì)SSR引物共篩選到7對(duì)具有多態(tài)性的引物，為確保后續(xù)SSR分析的可靠性，進(jìn)一步復(fù)篩，最后得到條帶清晰、多態(tài)性明顯的引物僅2對(duì)，這顯然不夠，今后還應(yīng)繼續(xù)篩選更多的SSR引物，用于椰子品種間遺傳多樣性的分析。

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