吳翼 李靜 楊耀東
摘要[目的]篩選可用的SSR分子標(biāo)記,加快椰子分子輔助育種進(jìn)程。[方法]采用改良CTAB法提取椰子基因組DNA,以基因組DNA為模板,對36對SSR引物進(jìn)行篩選,以條帶清晰、多態(tài)性豐富為引物篩選原則。[結(jié)果]共篩選出7對具有多態(tài)性的引物,其中2對多態(tài)性較豐富,可用于后續(xù)SSR分子標(biāo)記分析。[結(jié)論]該研究為開展椰子種質(zhì)資源遺傳多樣性系統(tǒng)分析提供了SSR引物。
關(guān)鍵詞椰子;SSR;DNA提??;聚丙烯酰胺凝膠電泳
中圖分類號S667.4文獻(xiàn)標(biāo)識碼
A文章編號0517-6611(2017)17-0119-03
Abstract[Objective]To accelerate the molecular assisted breeding process of coconut by screening SSR markers.[Method] The genomic DNA was extracted by modified CTAB method,and 36 SSR primers were screened with genomic DNA as template.[Result]A total of 7 pairs of polymorphic primers were screened,of which more than 2 pairs of polymorphism were found,which could be used for subsequent SSR molecular marker analysis.[Conclusion]The study provides the SSR primers for analysis of coconut germplasm genetic diversity system.
Key wordsCoconut;SSR;DNA extraction;PAGE Gel
基金項(xiàng)目海南省國際合作專項(xiàng) (KJHZ2014-24);農(nóng)業(yè)部熱帶作物種質(zhì)資源保護(hù)項(xiàng)目(16RZZY-104)。
作者簡介吳翼(1980—),男,海南文昌人,助理研究員,碩士,從事熱帶油料作物分子生物學(xué)研究。*通訊作者,博士,研究員,從事熱帶油料作物分子生物學(xué)研究。
收稿日期2017-04-10
椰子(Cocos nucifera L.)是熱帶亞熱帶地區(qū)重要的木本油料作物和食品能源作物,具有投資少、管理簡單、易生長、收獲期長、經(jīng)濟(jì)壽命長、投資風(fēng)險(xiǎn)小、營養(yǎng)豐富、用途廣泛等優(yōu)點(diǎn),深受人們的喜愛。椰子全身是寶,被稱為熱帶地區(qū)的“生命之樹”。但是椰子的生長周期較長,一般高種需要6~10年的營養(yǎng)生長,矮種也需要4~6年才能開花。而傳統(tǒng)的育種手段太慢,且消耗大量的時(shí)間和人力。
分子標(biāo)記輔助育種是一種可以有效縮短育種周期的重要手段,且分子標(biāo)記技術(shù)從DNA水平上檢測物種的差異,有效避免了形態(tài)標(biāo)記和生化標(biāo)記的缺點(diǎn),它不受環(huán)境和生長階段影響,僅在苗期就可以對植物進(jìn)行評價(jià)。將分子標(biāo)記應(yīng)用于椰子育種中,是一種行之有效的育種手段。目前應(yīng)用于椰子中的分子標(biāo)記有很多種,例如RFLP、RAPD[1]、AFLP[2]、ISSR[3]等。SSR(simple sequence repeals)即簡單重復(fù)序列[4-6],又稱為微衛(wèi)星DNA,是近年來在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種分子標(biāo)記技術(shù),是由少數(shù)核苷酸(一般1~6 bp)為重復(fù)單位簇集而成的串聯(lián)重復(fù)序列,其在植物基因組中廣泛分布、數(shù)量豐富、多態(tài)性高、信息含量大、重復(fù)性好、檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠,可在親緣關(guān)系較近的品種間檢測遺傳差異,操作起來較靈活、簡便、快速,易于分布,對DNA數(shù)量及質(zhì)量要求不高,即使是部分降解的樣品也可進(jìn)行分析。SSR分子標(biāo)記技術(shù)在植物遺傳圖譜構(gòu)建、種質(zhì)資源研究、基因定位、分子標(biāo)記輔助選擇、品種純度鑒定及雜種優(yōu)勢利用等方面都得到了大量應(yīng)用。椰子是椰子屬唯一的一個(gè)種,各品種間的親緣關(guān)系較近,目前可用于不同椰子品種間鑒定評價(jià)的SSR引物有限,遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足椰子品種的快速鑒定和種質(zhì)資源遺傳關(guān)系的分析。該研究以5個(gè)海南常見的椰子品種共144份樣品為材料,對36對SSR引物進(jìn)行篩選,旨在獲得多態(tài)性SSR引物,為今后開展椰子種質(zhì)資源遺傳多樣性系統(tǒng)分析提供更多的SSR引物。
1材料與方法
1.1 材料
取中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所種質(zhì)苗圃內(nèi)收集的黃矮椰子、紅矮椰子、本地高種、香水椰子、馬哇5個(gè)椰子品種共144份樣品的嫩葉為試驗(yàn)材料。
1.2試劑
(1)提取緩沖液:蔗糖119.8 g,1 mol/L Tris-HCl(pH 80)100 mL,0.5 mol/L EDTA(pH8.0)10 mL,PVP40 20 g,β-巰基乙醇(使用前加)30 mL,用DDH2O定容至1 000 mL,4 ℃保存。
(2)裂解液:1 mol/L Tris-HCl(pH8.0)100 mL,NaCl 818 g,0.5 mol/L EDTA(pH8.0)40 mL,CTAB 20 g,PVP40 20 g,β-巰基乙醇(使用前加)30 mL,用DDH2O定容至1 000 mL,4 ℃保存。
(3)TE緩沖液:1 mol/L Tris-HCl(pH8.0)1 mL,0.5 mol/L EDTA(pH8.0)0.2 mL,用DDH2O定容至100 mL,4 ℃保存。
(4)1 mol/L Tris-HCl(pH8.0)200 mL:Tris堿24.2 g,加160 mL DDH2O溶解,用濃HCl(約8 mL)調(diào)pH8.0。
(5)0.5 mol/L EDTA(pH8.0)100 mL:EDTA二鈉18.6 g,加80 mL DDH2O溶解,用NaOH(約2 g)調(diào)pH8.0,定容至100 mL,高壓滅菌后4 ℃保存。
(6)3 mol/L乙酸鈉(pH5.2)100 mL:三水合乙酸鈉40.8 g,加80 mL DDH2O溶解,用冰乙酸調(diào)pH 5.0,定容至100 mL,高壓滅菌后4 ℃保存。
(7)50×TAE緩沖液:Tris堿242.0 g,冰乙酸57.1 g,0.5 mol/L EDTA(pH8.0)100 mL,用DDH2O定容至1 000 mL。
(8)6×電泳緩沖液:溴酚藍(lán)0.125 g,蔗糖20 g,用DDH2O定容至50 mL,4 ℃保存。
(9)5×TBE 緩沖液(1 000 mL):Tris堿54.0 g,硼酸27.5 g,0.5 mol/L EDTA(pH8.0)20 mL,用DDH2O定容至1 000 mL。
(10)1×TBE 緩沖液:5×TBE 緩沖液 200 mL,用DDH2O稀釋5倍至總體積1 000 mL。
(11)10%AP(50 mL):過硫酸銨5 g,用DDH2O加至50 mL,攪拌溶解充分后,4 ℃保存。
(12)脫色液:50 mL乙酸,300 mL乙醇,定容至1 000 mL。
(13)保存液:5%~7%的乙酸。
(14)30%(29∶1)Acrylamide貯存液(500 mL):Acrylamide 145 g,BisAcrylamide 5 g,用DDH2O定容至500 mL,過濾后于棕色瓶中4 ℃保存。
1.3方法
1.3.1DNA提取。稱取1.2 g葉片,液氮磨成粉狀加入6 mL DNA提取緩沖液后轉(zhuǎn)至10 mL離心管中,8 000 r/min,4 ℃離心10 min,棄上清,加入5 mL預(yù)熱至65 ℃ 的DNA裂解緩沖液水浴90 min,每20 min搖勻1次;8 000 r/min,15 ℃離心10 min,取上清,加入等體積的氯仿∶異戊醇(24∶1),上下?lián)u勻后8 000 r/min,4 ℃離心10 min;取上清,加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1),搖勻,8 000 r/min,4 ℃離心10 min;取上清,加入1/10體積的3 mol/L乙酸鈉(pH5.2)和6/10體積冰凍異丙醇,緩慢搖勻至有絮狀沉淀析出;8 000 r/min,4 ℃離心10 min,棄去液體,加入1 mL75%乙醇,振蕩,迅速倒入1 mL離心管,置于冰中;將已提取好的DNA用75%乙醇洗2次,室溫放置干燥,加入200 μLTE溶液溶解,置于4 ℃保存。
1.3.2DNA質(zhì)量檢測。
1.3.2.1瓊脂糖檢測。采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA:取2 μLDNA工作液于120 V,電泳30 min后在凝膠成像儀上觀察電泳條帶。
1.3.2.2核酸微量檢測。
取1 μL DNA在Nandrop儀(Thermo 公司)上測定其在230、260和280 nm下的吸光度值,計(jì)算OD260/OD280及OD260/OD230。
1.3.3SSR引物篩選。
1.3.3.1PCR擴(kuò)增體系及程序。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系的總體積為20 μL,其中10×Ex Taq Buffer 2 μL,25 mmol/L MgCl2 1.6 μL,4×DNTP Mixture 0.5 μL,10 μmol/L Primer各1 μL,基因組DNA 2 μL,5 U/μL Taq DNA polymerse 0.2 μL,加無菌DDH2O至20 μL,混勻后4 500 r/min,離心10 s。在TP1600梯度PCR儀上進(jìn)行反應(yīng)。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,56 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,循環(huán)30次;72 ℃延伸10 min。
1.3.3.28%非變性聚丙烯酰胺凝膠的制備。H2O 15.81 mL,5×TBE 6 mL,30%(29∶1)貯存液7.98 mL,10%AP(過硫酸銨)0.21 mL,TEMED 0.015 mL,將以上溶液混合,勻速灌入聚丙烯酰胺凝膠電泳所用的2塊電泳玻璃板之間的縫隙中,放置3~5 h凝膠后備用。
1.3.3.3銀染方法。漂洗,用蒸餾水漂洗2遍;銀染,配制銀染液(AgNO3 1 g,無水乙醇50 mL,10%乙酸50 mL,蒸餾水 400 mL),在搖床上搖12 min,洗2遍,約30 s;顯影,配制顯影液(NaNO3 9 g ,甲醛3 mL,蒸餾水600 mL),在搖床上搖至條帶顯出,洗3遍;終止,Na2CO3 4.5 g,蒸餾水 600 mL,暫時(shí)保存,在掃描儀上進(jìn)行掃描,拍照,觀察。
1.3.3.4特異性引物篩選。
分別從5個(gè)不同椰子品種中隨機(jī)選取6個(gè)樣本作為PCR擴(kuò)增的DNA模板,對36對SSR引物進(jìn)行初篩,篩選出具有多態(tài)性的引物,再以5個(gè)品種共144份樣品的基因組DNA為模板,對其進(jìn)行復(fù)篩。
2結(jié)果與分析
2.1DNA提取結(jié)果
由表1可以看出,5個(gè)椰子品種共144個(gè)樣品的DNA質(zhì)量均較高。5個(gè)品種的DNA樣本OD260/OD280在1.98~2.02,OD260/OD230在1.86~2.00,估計(jì)有少量RNA污染,但是不影響后續(xù)的試驗(yàn)。瓊脂糖電泳檢測見圖1,電泳結(jié)果表明DNA條帶清晰,無彌散,不拖尾,點(diǎn)樣孔干凈,無蛋白和RNA污染,說明DNA質(zhì)量較好。
2.2SSR引物篩選結(jié)果
選用5個(gè)椰子品種共30個(gè)樣品的DNA 作模板, 對該試驗(yàn)中合成的36對SSR引物進(jìn)行篩選,大部分引物能擴(kuò)增出清晰條帶,該研究以條帶清晰、多態(tài)性豐富為引物篩選原則, 36對引物中共篩選出7對具有多態(tài)性的引物,多態(tài)率達(dá)19.4%,具體序列見表2。再以5個(gè)椰子品種共144個(gè)樣品的基因組DNA為模板,對具有多態(tài)性的7對SSR引物進(jìn)行復(fù)篩,最后發(fā)現(xiàn)有2對SSR引物(HAYZ-D-QH-5506 和HAYZ-D-ZH-5506)多態(tài)性高且重復(fù)性好,可用于后續(xù)的遺傳多樣性分析,電泳結(jié)果見圖2、圖3。
3討論
近年來,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,分子標(biāo)記越來越廣泛地應(yīng)用于各種作物的遺傳和育種研究中;利用SSR 標(biāo)記的高多態(tài)性,結(jié)合相關(guān)分析、聚類分析等數(shù)量遺傳分析手段,可以對不同親緣物種進(jìn)行分類,判斷其親緣關(guān)系,評價(jià)不同品種的異質(zhì)性,并進(jìn)而劃分雜交優(yōu)勢群;篩選出擴(kuò)增性強(qiáng)、多態(tài)性和穩(wěn)定性好的引物是進(jìn)行全部基因組擴(kuò)增成敗的關(guān)鍵,尤其是種內(nèi)的擴(kuò)增,因?yàn)榉N內(nèi)的個(gè)體除自然變異外,其基因型沒有太多的差異,所以沒有多態(tài)性強(qiáng)、穩(wěn)定性好的引物很難區(qū)別個(gè)體內(nèi)的差異。SSR引物篩選是SSR分子標(biāo)記的前提,該研究以5個(gè)不同椰子品種的基因組DNA作模板,對36對SSR引物進(jìn)行篩選,由于種內(nèi)品種間遺傳關(guān)系較近,擴(kuò)增到的特異位點(diǎn)較少,36對SSR引物共篩選到7對具有多態(tài)性的引物,為確保后續(xù)SSR分析的可靠性,進(jìn)一步復(fù)篩,最后得到條帶清晰、多態(tài)性明顯的引物僅2對,這顯然不夠,今后還應(yīng)繼續(xù)篩選更多的SSR引物,用于椰子品種間遺傳多樣性的分析。
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