聶春艷 汪鶴 潘利華 查學(xué)強 羅建平

摘要[目的]研究霍山石斛水溶性多糖抗小鼠亞急性酒精性肝損傷的作用。 [方法]制備霍山石斛水溶性多糖；以連續(xù)灌胃30%乙醇（V/V，10 mL/kg）15 d的小鼠為亞急性酒精性肝損傷模型，水溶性多糖連續(xù)灌胃30 d后，稱量小鼠體重和肝臟重量，觀察肝組織損傷病理變化，并檢測血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）活性以及高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）的含量，同時測定肝臟中乙醇脫氫酶（ADH）、乙醛脫氫酶（ALDH）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-PX）的活性以及還原性谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）的含量。 [結(jié)果]霍山石斛水溶性多糖各劑量可有效抑制酒精引起的小鼠血清中ALT、AST、ALP、HDL-C、LDL-C、TC、TG水平的變化，增強肝組織中ADH、ALDH、SOD、GSH-PX的活性，抑制肝組織中GSH含量的降低和MDA含量的升高，減輕酒精對肝臟的病理損傷。 [結(jié)論]霍山石斛水溶性多糖對亞急性酒精性肝損傷具有顯著的保護作用。

關(guān)鍵詞霍山石斛；水溶性多糖；亞急性酒精性肝損傷

中圖分類號Q946.3文獻標(biāo)識碼A文章編號0517-6611（2017）17-0100-06

Abstract[Objective] The research aimed to investigate the effects of watersoluble polysaccharide from D. huoshanense against alcoholinduced subacute liver injury in mice. [Method]Watersoluble polysaccharide from D. huoshanense was prepared.The mouse liver injury was induced by oral administration of 30% alcohol for 15 days and watersoluble polysaccharide was employed to intervene this injury for 30 days. Liver injury was evaluated by mouse body weight， liver weight， liver pathological changes， serum biochemical indexes including alanine aminotransferase （ALT）， aspartate aminotransferase （AST）， alkaline phosphatase （ALP）， high density lipoprotein cholesterol （HDLC）， low density lipoprotein cholesterol （LDLC）， total cholesterol （TC）and triglyceride （TG）， and liver biochemical indexes including alcohol dehydrogenase （ADH）， acetaldehyde dehydrogenase （ALDH）， superoxide dismutase （SOD）， glutathione peroxidase （GSHPX）， glutathione （GSH） and malonaldehyde （MDA）.[Result]Watersoluble polysaccharide from D. huoshanense effectively suppressed the change of ALT， AST， ALP， HDLC， LDLC， TC and TG levels in serum， enhanced the activities of ADH， ALDH，SOD and GSHPX in liver， inhibited the decrease in GSH level and the increase in MDA level in liver，and reduced the pathological damage of alcohol to the liver.[Conclusion]Watersoluble polysaccharide from D. huoshanense showed significant hepatoprotective effects against alcoholinduced subacute liver injury.

Key wordsDendrobium huoshanense；Watersoluble polysaccharide；Subacute alcoholic liver injury

基金項目安徽省科技攻關(guān)計劃項目（12010402088）。

作者簡介聶春艷（1992—），女，湖南常德人，碩士研究生，研究方向：中草藥與功能食品。

收稿日期2017-04-06

長期過度飲酒容易導(dǎo)致酒精性肝損傷已成為國內(nèi)外共識[1-2]。大量的試驗研究表明，許多中草藥具有改善酒精性肝損傷的功效[3]。霍山石斛（Dendrobium huoshanense）作為傳統(tǒng)的藥食兼用植物[4]，具有益胃生津、滋陰清熱、保肝明目等功效[5]。有研究顯示，多糖作為石斛的主要活性成分之一，具有一定的酒精性肝損傷保護作用[6]?；羯绞㈣F皮石斛等多種石斛粗多糖具有一定的預(yù)防急性和亞急性慢性酒精性肝損傷的效果[7]，霍山石斛的不同提取方式在保護肝損傷的功能上具有一定的差異[8]。筆者主要以霍山石斛經(jīng)醇提、水提醇沉、DEAE纖維素陰離子色譜柱分離得到的水溶性多糖為研究對象，以亞急性酒精性肝損傷小鼠為試驗動物模型，研究霍山石斛水溶性多糖抗小鼠亞急性酒精性肝臟損傷的作用和可能機制，旨在明確霍山石斛水溶性多糖對酒精性肝損傷的干預(yù)作用，為霍山石斛在抗酒精性肝損傷方面的加工應(yīng)用提供參考價值。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動物。

健康昆明雄性小鼠，體重（20±2）g，SPF級，購于安徽醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心。

1.1.2試材。

霍山石斛采自安徽霍山。

二乙氨基乙基纖維素（diethylaminoethyl cellulose，DEAE），美國Sigma公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、谷胱甘肽（glutathione，GSH）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）試劑盒、丙二醛（malonaldehyde，MDA）試劑盒，南京建成生物工程研究所；水飛薊素，德國馬博士；其他試劑均為分析純。

1.1.3儀器與設(shè)備。

CT15R高速冷凍離心機，上海天美科學(xué)儀器有限公司；Hei-VAP Advantage旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國Heidolph公司；SHZ-D循環(huán)水式真空泵，鞏義市英予華儀器廠；LBJ-18S原位真空冷凍干燥機，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；7072自動生化分析儀，日本日立高新技術(shù)公司；RM2126組織切片機，德國萊卡公司；XSZ-3G普通光學(xué)顯微鏡，重慶廣電儀器有限公司；Varioskan Flash酶標(biāo)儀，美國Thermo Fisher公司。

1.2方法

1.2.1霍山石斛水溶性多糖的提取。

取霍山石斛鮮品經(jīng)真空冷凍機凍干、粉碎機粉碎成粉末狀、80%乙醇脫脂后，按1∶60（m∶V）料液比加入蒸餾水，75 ℃攪拌浸提2 h，重復(fù)2次，提取液在60 ℃下適度減壓濃縮，經(jīng)離心（20 ℃，8 000 r/min，10 min）取上清液。上清液經(jīng)終濃度為80%的乙醇醇沉24 h，收集沉淀，依次經(jīng)Sevag試劑（氯仿∶正丁醇=4∶1）脫除蛋白[9]、截留分子質(zhì)量為3500 D透析袋透析過夜除去小分子、真空冷凍干燥獲得霍山石斛粗多糖。采用DEAE-纖維素陰離子交換柱（1.6 cm × 60 cm）對粗多糖進行分離，收集水洗脫組分，經(jīng)濃縮、透析、冷凍干燥后，得霍山石斛水溶性多糖。

1.2.2動物分組及給藥方法。

先將試驗小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)（正常飲食飲水）7 d，再隨機分為6組，分別為正常對照組、酒精性肝損傷模型對照組、陽性對照組（水飛薊素20 mg/kg），霍山石斛水溶性多糖高[0.064 g/（kg·d）]、中[0.021 g/（kg·d）]、低劑量組[0.011 g/（kg·d）]，每組10只。其中結(jié)合霍山石斛水溶性多糖的提取得率，以《藥典》中石斛干品的人體（60 kg）推薦攝入量（6～12 g/d）中間量（10 g/d）的30倍、10倍、5倍為依據(jù)，確定霍山石斛多糖水溶性多糖高、中、低劑量組的給藥濃度?；羯绞M與陽性對照組每日一次按10 mL/kg劑量灌胃小鼠，正常對照組和模型對照組小鼠給予相同體積蒸餾水，連續(xù)灌胃30 d。于第1天記錄小鼠初始重量，從第16天開始，除正常組外，其他各組于每天給藥結(jié)束后4 h灌胃30%酒精（10 mL/kg）[10]。最后一次給藥結(jié)束后，記錄最終重量，小鼠禁食12 h，注射60 mg/kg戊巴比妥鈉溶液將小鼠麻醉，腹主動脈取血，解剖取出肝臟，稱重，迅速用液氮凍存，保存于-80 ℃冰箱待用。

1.2.3小鼠體重和肝臟指數(shù)的測定。

小鼠體重增重=（第30天體重-第1天體重）/第1天體重×100%；

肝臟指數(shù) = 肝臟重量（mg）/體重（g）。

1.2.4小鼠肝組織病理學(xué)檢查。

先用預(yù)冷的PBS沖洗小鼠肝臟表面血漬，取肝臟左葉用10%福爾馬林浸泡，固定過夜，按常規(guī)方法依次脫水、透明、石蠟包埋、切片、HE染色，在普通光學(xué)顯微鏡（20×）下觀察肝臟病理學(xué)變化，包括肝細(xì)胞形態(tài)變化和肝臟變性壞死程度等。

1.2.5小鼠血清生化指標(biāo)檢測。

小鼠腹主動脈取血約0.5 mL于EP管中，于4 ℃冰箱靜置過夜，4 ℃ 、4 000 r/min離心20 min，移液槍吸取上層淡黃色液體，得到血清。采用全自動生化分析儀檢測肝功能活性指標(biāo)即谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）的活性，脂質(zhì)代謝指標(biāo)即高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、總膽固醇（TC）和甘油三酯（TG）的含量。

1.2.6小鼠肝組織生化指標(biāo)檢測。

于-80 °C冰箱取出肝臟組織置于勻漿器中，加入0.9%生理鹽水研磨后，稀釋成質(zhì)量濃度為10%的肝臟組織勻漿液，于4 ℃、10 000 r/min離心15 min，分離上清，待測。

①抗氧化應(yīng)激指標(biāo)的測定：抗氧化酶（SOD和GSH-PX）的活性以及還原型谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）的含量嚴(yán)格按照試劑盒說明書測定。

②酒精分解酶活性的測定：乙醇脫氫酶（ADH）和乙醛脫氫酶（ALDH）活性按照Koivisto等[11]的方法檢測。

1.3統(tǒng)計分析

通過SPSS 17.0軟件，采用t檢驗方法，進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果以±S表示。

2結(jié)果與分析

2.1水溶性多糖對小鼠體重增重和肝臟指數(shù)的影響

由圖1a可知，與正常對照組相比，酒精性肝損傷模型對照組的小鼠體重增加量明顯減少（P<0.01）；與模型對照組比較，陽性對照組與霍山石斛水溶性多糖中、高劑量組均能顯著恢復(fù)酒精抑制的小鼠體重增加（P<0.05），霍山石斛水溶性多糖低劑量組雖然具有恢復(fù)小鼠體重的趨勢，但統(tǒng)計數(shù)據(jù)無顯著性效果（P>0.05）。水溶性多糖對小鼠肝臟指數(shù)的變化分析表明（圖1b），與正常對照組比較，模型對照組肝臟指數(shù)極顯著升高（P<0.01），但這種升高可被霍山石斛水溶性多糖各劑量組顯著抑制。

2.2水溶性多糖對小鼠肝組織形態(tài)的影響

從圖2可看出，酒精肝損傷模型組小鼠肝細(xì)胞腫脹，細(xì)胞核固縮、溶解，細(xì)胞索排列呈無序狀態(tài)，肝小葉界限不清晰，肝組織出現(xiàn)炎性和壞死區(qū)，導(dǎo)致肝損傷。而霍山石斛水溶性多糖各劑量組的肝損傷程度明顯減輕，高劑量效果比陽性對照組更好，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰可見，界限分明，肝細(xì)胞排列呈現(xiàn)有序狀態(tài)，脂肪變性程度明顯降低，壞死區(qū)域顯著縮小，核仁清晰。

2.3水溶性多糖對小鼠肝功能的影響

由圖3可知，與正常對照組比較，模型組小鼠在酒精下血清中ALT、AST、ALP活性極顯著增高（P<0.01）；與模型對照組相比，陽性對照組能明顯抑制ALT活性變化（P<0.05）及AST和ALP活性升高（P<0.01）；霍山石斛水溶性多糖各劑量組均能極顯著抑制酒精致肝損傷小鼠血清中ALT、AST、ALP活性的升高（P<0.01），且呈劑量效應(yīng)關(guān)系，其中高劑量組與模型對照組相比分別降低42.2%、30.8%、37.1%。結(jié)果表明，水溶性多糖抑制血清中ALT、AST、ALP活性升高，從而修復(fù)肝細(xì)胞膜通透性、保護小鼠肝功能。

2.4水溶性多糖對小鼠脂質(zhì)代謝的影響

由圖4可知，與正常對照組相比，模型對照組小鼠脂質(zhì)代謝出現(xiàn)紊亂，小鼠血清中HDL-C含量顯著降低，LDL-C、TC、TG明顯升高（P<0.01）。與模型對照組相比，水溶性多糖各劑量組均可顯著地恢復(fù)酒精引起的HDL-C水平降低，以及LDL-C和TG含量的升高（P<0.01），且具有劑量效應(yīng)關(guān)系，水溶性多糖低劑量組和中劑量組可一定程度地恢復(fù)血清中TC含量（P<0.05），水溶性多糖高劑量組可顯著抑制TC水平的升高（P<0.01），其中水溶性多糖各劑量組的LDL-C和TG含量接近于正常組水平，說明霍山石斛水溶性多糖在恢復(fù)脂質(zhì)代謝異常中發(fā)揮重要作用。

2.5水溶性多糖對小鼠肝臟抗氧化能力的影響

由圖5可知，酒精致小鼠肝損傷中肝組織SOD、GSH-PX活性和GSH含量顯著降低，MDA含量明顯增加（P<0.01），而水溶性多糖各劑量組均能明顯改善酒精致小鼠肝組織中抗氧化酶活性和抗氧化物質(zhì)的變化（P<0.01），其中高劑量組表現(xiàn)出更好的抗氧化能力，與模型對照組相比，SOD、GSH-PX和GSH分別提高了80.9%、51.0%、33.8%，MDA含量減少了454%。表明水溶性多糖對酒精致小鼠肝組織SOD、GSH-PX、GSH和MDA水平的改變具有很好的改善作用，可保護肝組織抗氧化系統(tǒng)的平衡。

2.6水溶性多糖對小鼠肝臟酒精分解酶活性的影響

由圖6可知，與正常對照組相比，酒精刺激小鼠肝組織中ADH和ALDH活性升高（P<0.01），而口服霍山石斛水溶性多糖可進一步提高ADH和ALDH活性（P<0.01）。表明霍山石斛水溶性多糖各劑量組均能適應(yīng)肝組織快速代謝酒精和減輕酒精毒性的需求，從而抑制肝臟的損傷。

3討論與小結(jié)

參與酒精性肝損傷的發(fā)病機制比較復(fù)雜，涉及乙醇及其代謝產(chǎn)物、氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化等多因素的共同作用[12]。當(dāng)長期過量攝入酒精后，容易導(dǎo)致亞急性肝損傷，引起機體重量、酒精代謝酶活性、抗氧化能力和脂質(zhì)代謝等一系列異常反應(yīng)，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞的功能損傷[13]。

長期大量飲酒會降低食欲和對營養(yǎng)成分的吸收能力，導(dǎo)致體重增重明顯下降和肝臟指數(shù)顯著增加，肝組織出現(xiàn)細(xì)胞腫脹和排列無序[14]。該試驗通過對小鼠體重及肝臟指數(shù)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計和方差分析發(fā)現(xiàn)，霍山石斛水溶性多糖能明顯改善由酒精引起的小鼠體重減輕及肝臟指數(shù)增加，肝組織病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)水溶性多糖能一定程度地減輕肝細(xì)胞病理損傷程度，表明水溶性多糖對長期過量飲酒所致的肝損傷有保護作用。

ALT、AST和ALP是存在于肝細(xì)胞漿和線粒體中3種重要的轉(zhuǎn)氨酶[15]，乙醇及代謝產(chǎn)物乙醛在體內(nèi)的積累引起肝細(xì)胞發(fā)生病變，使得肝細(xì)胞膜通透性和流動性增加，導(dǎo)致血液中3種轉(zhuǎn)氨酶活性升高[16]。該研究顯示，水溶性多糖干預(yù)組可以改善酒精所致的肝功能損傷，血清中ALT、AST和ALP活性顯著下降，從生化功能上提示霍山石斛水溶性多糖對酒精性肝損傷具有保護作用。

脂質(zhì)代謝異常作為酒精性肝損傷的一種并發(fā)癥狀，即酒精及代謝產(chǎn)物會導(dǎo)致血液中HDL-C含量降低的同時引起LDL-C、TC和TG含量增加，從而出現(xiàn)常見的高血脂和脂肪肝的病癥[17]。該試驗發(fā)現(xiàn)，霍山石斛水溶性多糖具有明顯抑制酒精致小鼠血清中HDL-C、LDL-C、TC和TG含量的變化，表明水溶性多糖具有改善酒精導(dǎo)致的肝組織脂質(zhì)代謝異常的功效。

乙醇代謝過程中會產(chǎn)生大量活性氧，抑制GSH的生物合成，降低肝臟內(nèi)抗氧化系統(tǒng)GSH-PX的活性，減弱SOD的抗氧化功能，增加膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA含量，從而引起氧化-抗氧化狀態(tài)的失衡，出現(xiàn)氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成肝臟損傷[18-19]。該試驗表明，灌胃霍山石斛水溶性多糖能通過提高SOD和GSH-PX的活性、GSH的含量以及降低MDA的水平來維持肝組織的抗氧化體系平衡狀態(tài)，從而減輕酒精引發(fā)的肝組織氧化損傷。

乙醇在機體內(nèi)的主要代謝器官是肝臟，代謝過程中主要有ADH和ALDH 2種酶參與發(fā)揮作用，因此ADH和ALDH活性的變化對于肝臟損傷具有重要的作用[20]。該試驗結(jié)果表明，霍山石斛水溶性多糖可以顯著提高小鼠肝組織ADH和ALDH的活性，加快酒精及其代謝產(chǎn)物的氧化、水解、排出，從而減輕代謝產(chǎn)物乙醛對肝細(xì)胞的毒性作用，達到改善酒精性肝損傷的效果。

綜上所述，霍山石斛水溶性多糖可在血清肝功能、脂質(zhì)代謝以及肝組織酒精代謝酶和抗氧化體系等方面共同干預(yù)和恢復(fù)酒精性肝損傷。

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