王國君 陳利軍 熊建偉 智亞楠
摘要:為了篩選出對茶樹炭疽病病菌具有拮抗作用的根際促生細(xì)菌,從河南省信陽市茶園采集85份土樣,分離得到23株具有拮抗作用的細(xì)菌,利用平板對峙法篩選出對膠孢炭疽菌具有較強(qiáng)拮抗作用的7株細(xì)菌菌株,且其代謝產(chǎn)物對茶樹炭疽病病菌的平均抑制率達(dá)到53.20%。依據(jù)生理生化特征經(jīng)初步鑒定,7株拮抗菌株均隸屬于芽孢桿菌屬。試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步構(gòu)建多功能植物根際促生菌廣適菌群提供菌株資源。
關(guān)鍵詞:茶樹;炭疽病病菌;拮抗作用;根際促生細(xì)菌;篩選
中圖分類號: S435.711文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A
文章編號:1002-1302(2017)11-0076-03[HS)][HT9.SS]
茶樹炭疽病是一種由真菌侵染引起的病害,是常見的茶樹葉部病害之一,在我國各產(chǎn)茶區(qū)均有發(fā)生,山區(qū)茶園尤為普遍[1],該病發(fā)病嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致茶樹大量落葉,并造成茶樹樹勢衰落和茶葉產(chǎn)量與品質(zhì)降低,還影響翌年春季茶葉的產(chǎn)量。
目前,茶園主要利用化學(xué)藥劑防治茶樹炭疽病,但長期使用化學(xué)藥劑會導(dǎo)致病原菌抗藥性增強(qiáng),并可造成農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染等一系列問題。在化肥農(nóng)藥零增長的大背景下,如何開發(fā)生物制劑來防治茶樹炭疽病尤為重要。植物根際促生菌(plant growth-promoting rhizobacteria,簡稱PGPR)指生存于植物根際、根表,并能直接或間接地促進(jìn)或調(diào)節(jié)植物生長的微生物[2],它能夠通過多種機(jī)制促進(jìn)植物的生長,目前人們普遍認(rèn)同的生物學(xué)功能主要有拮抗病原菌、誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性、改善根際微生態(tài)環(huán)境等[3]。國外研究人員已從水稻、小麥、玉米、甘蔗和棉花等作物根際分離篩選出許多高效、優(yōu)良的促生菌株,并且部分菌株已實(shí)現(xiàn)商業(yè)化[4-6]。陳波等分離篩選出對櫻桃生長有明顯促進(jìn)作用的假單胞菌屬(Pseudomonas sp.)[7];史國英等分離得到1株對甘蔗具有促生作用的細(xì)菌,經(jīng)鑒定為克雷伯氏菌屬(Klebsiella sp.)細(xì)菌[8];周晨昊等研究發(fā)現(xiàn),將篩選到的1株植物根際促生細(xì)菌JD37與蚯蚓糞混合對小白菜與蕹菜具有顯著的促生作用,其鮮質(zhì)量和產(chǎn)量均有明顯提高,還具有降低2種蔬菜中亞硝酸鹽含量的作用[9]。
本研究從茶樹根際土壤中分離PGPR,初步研究其對茶樹炭疽病病菌的拮抗作用,通過形態(tài)學(xué)和生理生化特性對其鑒定,為構(gòu)建高效廣適促生菌群提供菌株材料。
1材料與方法
1.1供試樣品
從河南省信陽市浉河港鎮(zhèn)、董家河、震雷山、信陽農(nóng)林學(xué)院等地的茶園中,共采集85份根際土壤樣品,放入自封袋,分別標(biāo)記為SHG、DJH、ZLS、XYNL,并加以編號,置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>
1.2供試培養(yǎng)基[10]
PDA培養(yǎng)基:200 g去皮馬鈴薯、20 g葡萄糖、18 g瓊脂;NA培養(yǎng)基:5 g牛肉浸膏、10 g蛋白胨、5 g NaCl、18 g瓊脂、pH值為7.2;NB培養(yǎng)液:3 g牛肉浸出膏、5 g蛋白胨、5 g NaCl、1 000 mL水、pH值為7.0~7.2。
1.3供試病原真菌
盤長孢菌(Gloeosporium theae-sinesis Miyake)由信陽農(nóng)林學(xué)院農(nóng)藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離和保存。
1.4細(xì)菌的分離和純化
稱取10 g土樣,加入裝有90 mL無菌水的250 mL三角瓶中,于120 r/min搖床上振蕩30 min,即為10-1稀釋液,取 1 mL 10-1 稀釋液加入盛有9 mL無菌水的試管中,即為10-2稀釋液,依此類推,用無菌水稀釋成10-3~10-7稀釋液,分別取5 μL涂布于3種固態(tài)培養(yǎng)基平板上,每個(gè)濃度重復(fù)3次,置于26~27 ℃恒溫箱中培養(yǎng)3~5 d后,挑取單菌落作為參試菌株。
1.5對茶樹炭疽病病原菌拮抗作用的測定
1.5.1[JP2]細(xì)菌菌株對茶樹炭疽病病原菌拮抗性測定
采用對峙生長法測定茶樹根際細(xì)菌對膠孢炭疽菌的拮抗性。即在直徑為9 cm的PDA平板正中央接入直徑為5 mm的膠孢炭疽菌菌塊,同時(shí)在距平板中心2.5 cm處的4個(gè)點(diǎn)上分別接入1環(huán)目標(biāo)細(xì)菌菌落,對照不接篩選菌株,只接入培養(yǎng)基,于 27 ℃ 恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)72 h,測量從茶樹根際土壤中篩選的細(xì)菌的菌落邊緣和茶樹炭疽病病原菌菌落邊緣之間的抑菌帶寬度,篩選出對茶樹炭疽病病原菌具有拮抗作用的菌株。同時(shí)觀察篩選菌的菌落大小和生長速度,選出拮抗作用明顯的細(xì)菌。[JP]
1.5.2拮抗細(xì)菌代謝產(chǎn)物對供試病原菌的抑制作用
將初篩的拮抗細(xì)菌于NB培養(yǎng)液中28 ℃振蕩培養(yǎng)3 d,將發(fā)酵液以8 000 r/min離心15 min,取上清液,最后用孔徑為0.22 μm的濾膜過濾,每個(gè)處理重復(fù)3次。將2 mL無菌濾液和20 mL NA培養(yǎng)基混合均勻倒入培養(yǎng)皿,冷卻凝固后,在每個(gè)培養(yǎng)皿中央接入直徑為5 mm的供試病原菌菌塊,27 ℃下培養(yǎng)24 h。以直接培養(yǎng)的炭疽菌作為對照,用垂直十字法分別測量含測試菌發(fā)酵液條件下和不含發(fā)酵液條件下的病原菌菌塊直徑,用如下公式計(jì)算抑制率:
[JZ]抑制率=[SX(]對照菌落直徑-處理菌落直徑對照菌落直徑[SX)]×100%。
1.6拮抗菌株的初步鑒定
對拮抗菌株進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色、硝酸鹽還原反應(yīng)、伏-普(V-P)反應(yīng)、檸檬酸鹽利用反應(yīng)、淀粉水解、厭氧性試驗(yàn)、接觸酶反應(yīng),以及葡萄糖、蔗糖、甘露醇產(chǎn)酸等形態(tài)學(xué)及生理生化分析,對拮抗菌株進(jìn)行初步鑒定。
2結(jié)果與分析
2.1不同樣品中分離的細(xì)菌菌株及拮抗菌株
從85份根際土壤樣品中分離細(xì)菌,對分離出的根際細(xì)菌根據(jù)其菌落形態(tài)、顏色等挑取單菌落,按常規(guī)方法純化后保存,共獲得254株細(xì)菌菌株,根據(jù)菌落的形態(tài)特征,經(jīng)過進(jìn)一步篩選,發(fā)現(xiàn)具有拮抗作用的菌株23株,其中7株菌株對茶樹炭疽病病原菌具有較強(qiáng)的拮抗作用。如表1所示,7株目標(biāo)拮抗菌株主要來自震雷山茶場、浉河港鎮(zhèn)何家寨茶場、董家河尖山茶場。菌株來源相對分散,相比較而言,化學(xué)防治較少的震雷山茶場分離得到的菌株較多,從側(cè)面反映化學(xué)殺菌劑的使用可能導(dǎo)致茶樹根際微生物種群中有益微生物的數(shù)量減少。另外,7株菌株均出自相對肥沃的土壤,這與孫海新等的研究結(jié)論[11]一致。從茶樹品種來看,4株菌株來源于福鼎大白茶、2株來源于龍井43、1株來源于白毫早,而福鼎大白茶在茶區(qū)種植面積較大,因此,不同茶樹品種對拮抗菌株是否存在一定的影響需要進(jìn)一步研究證明。
2.4拮抗細(xì)菌的鑒定
由表4可知,7株拮抗細(xì)菌革蘭氏染色反應(yīng)、芽孢染色反應(yīng)、硝酸鹽還原反應(yīng)、V-P測定、檸檬酸鹽利用反應(yīng)、運(yùn)動性、淀粉水解反應(yīng)、接觸酶反應(yīng)、葡萄糖產(chǎn)酸、蔗糖產(chǎn)酸、甘露醇產(chǎn)酸反應(yīng)等均呈陽性,厭氧性試驗(yàn)均呈陰性。根據(jù)細(xì)菌形態(tài)特征觀察和生理生化反應(yīng)結(jié)果,參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[12]和《芽孢桿菌屬》[13],初步確定這7株菌株均屬于芽孢桿菌屬。
3結(jié)論與討論
目前,植物根際促生細(xì)菌的篩選利用及其促生機(jī)制的研究已成為一個(gè)熱點(diǎn)[14-15]。從本試驗(yàn)篩選的初步結(jié)果看,7株菌株代謝產(chǎn)物平均拮抗抑制率為53.20%,經(jīng)生理生化鑒定,7株菌株均為芽孢桿菌屬。雖然拮抗抑制率與申光輝等所篩選的拮抗菌株的拮抗抑制率[16]有差距,但是并不能簡單認(rèn)為其生防效果不理想。因?yàn)檗卓棺饔弥皇谴偕?xì)菌作用中的一個(gè)方面,需要從多個(gè)方面綜合篩選方可成功開發(fā)出生產(chǎn)中具有意義的微生物農(nóng)藥。另外,拮抗菌株在室內(nèi)和田間表現(xiàn)的穩(wěn)定性往往存在差異,有研究表明物理、化學(xué)、微生物種群等環(huán)境條件會對細(xì)菌生長造成影響,從而制約其促生效果[17]。因此,在室內(nèi)試驗(yàn)中拮抗效果不突出的菌株,并不意味著不具有開發(fā)價(jià)值。要將所篩菌株在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上用于防治植物病害,尤其是防治茶樹炭疽病還需進(jìn)一步通過田間試驗(yàn)來驗(yàn)證,如果田間防治效果較好,那么對于其產(chǎn)生的抗菌活性物質(zhì)有效成分的分離、純化、結(jié)構(gòu)鑒定等都值得進(jìn)一步研究。另外,促生機(jī)制具有多樣性,能否將7株菌株構(gòu)建適應(yīng)不同環(huán)境要求的多功能菌群以共同發(fā)揮作用也需要進(jìn)一步研究。
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