張 雷 王 林 耿智敏 萬 永 孟凡迪 孟憲魁

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·基礎研究·

轉錄共激活子TAZ對肝癌細胞株MHCC97H增殖能力的影響

張 雷 王 林 耿智敏 萬 永 孟凡迪 孟憲魁

目的 觀察轉錄共激活子TAZ對肝癌細胞株MHCC97H的增殖能力的影響，以期對闡明原發(fā)性肝細胞癌(HCC)的發(fā)生發(fā)展機制提供1個新的研究思路。方法 應用細胞轉染、RNA干擾(RNAi)以及過表達技術，在肝癌細胞株MHCC97H中干預TAZ的表達。在轉染后提取細胞RNA和總蛋白，應用qRT-PCR和Western blot等方法檢測TAZ、Nek7的表達。選用細胞計數(shù)kit-8(CCK-8)法檢測細胞活性和增殖能力。結果 與NC組相比，轉染了TAZ特異性靶向干擾片段之后，TAZ的mRNA與蛋白表達水平均出現(xiàn)下調，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.0001)；Nek7表達也出現(xiàn)下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.0001)；功能實驗(CKK8)發(fā)現(xiàn)MHCC97H細胞活性和增殖能力也降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。另一方面，過表達了TAZ之后，Nek7表達水平也相應上調了，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.0001)；MHCC97H細胞活性和增殖能力也提高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。結論 轉錄共激活子TAZ能通過調控Nek7的表達對肝癌細胞MHCC97H的增殖能力產生影響，該發(fā)現(xiàn)對于闡明TAZ在肝癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用提供一定的實驗基礎。

TAZ;Nek7;肝癌；MHCC97H細胞；增殖

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:1219～1223)

原發(fā)性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是全球五大高發(fā)腫瘤之一[1]。在我國，與腫瘤相關的死亡人數(shù)中肝癌導致的死亡人數(shù)高居第二位[2]，目前治療肝癌還是以手術切除為主，輔以放、化療或者生物治療等[3]，但由于肝癌發(fā)病隱秘，早期癥狀不典型，很多患者發(fā)現(xiàn)時既已經到中晚期，所以治療效果不理想，五年生存率很低[4]。研究肝癌的發(fā)生發(fā)展對更好地預防和治療肝癌有重大意義，對臨床治療也能提供新的思路和策略。轉錄共激活子TAZ首次報道是于2000年Kanai等[5]發(fā)現(xiàn)其能夠與14-3-3蛋白結合。近期的研究證明TAZ是Hippo信號通路中的重要效應分子[6]，通過轉錄共激活作用調控下游靶基因的表達[7]。國內外的研究表明TAZ是1個癌基因，在乳腺癌、結腸癌、甲狀腺癌、骨肉瘤等[8-11]腫瘤中都呈現(xiàn)高表達并與臨床預后相關。分子機制方面，Wang等[12]發(fā)現(xiàn)在成神經細胞瘤中TAZ呈表達，并通過上調CTGF 和 PDGF-β的表達促進細胞增殖和腫瘤形成。Nek7(NIMA-related kinase-7)是1個能參與細胞周期調控的絲氨酸/蘇氨酸激酶，Zhou等[13]研究發(fā)現(xiàn)Nek7在肝癌組織中高表達且能促進肝癌細胞的增殖,可作為肝癌的1個生物標記。依據以上證據，我們推測TAZ通過調控Nek7的表達在肝癌細胞的增殖中發(fā)揮著重要的調節(jié)作用。本研究以肝癌細胞株MHCC97H為研究對象，探討TAZ對肝癌細胞增殖能力的影響，為闡明肝癌的發(fā)生發(fā)展提供分子機制理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和材料

MHCC97H(人肝癌細胞株)購自中國科學院上海生命科學研究院。細胞計數(shù)kit-8(CCK-8)試劑盒購自上海碧云天生物技術公司。RIPA裂解液購自北京普利萊基因技術有限公司。LipofectaminTM2000購自Invitrogen公司(USA)。逆轉錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser)、實時熒光定量(SYBR?Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus))試劑盒、限制性內切酶BamHⅠ、RcoRⅠ、T4DNA連接酶、pyrobest DNA聚合酶、DpnI酶、質粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒等均購自寶大連生物工程有限公司(TaKaRa)。兔抗人TAZ、Nek7、GAPDH多克隆抗體購自美國Proteintech。山羊抗兔IgG(二抗)購自北京中杉金橋生物技術有限公司。TRIzol 試劑、化學發(fā)光檢測試劑盒、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞等購自北京天根生物科技有限公司。設計的TAZ靶向siRNA由上海吉瑪制藥技術有限公司合成。TAZ過表達質粒構建引物和TAZ、Nek7、GAPDH的qRT-PCR引物等均由生工生物工程(上海)有限公司合成。pCMV5-HA載體購自promega(USA)。BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術研究所。

1.2 細胞培養(yǎng)及轉染

人肝癌細胞株MHCC97H置于37 ℃、CO2含100 U/ml雙抗、10%胎牛血清的DMEM(Gibco,USA) 全培養(yǎng)液換液傳代培養(yǎng)。轉染前24 h接種細胞于6 cm培養(yǎng)皿中，當細胞融合度約70%時饑餓培養(yǎng)4 h，然后用LipofectaminTM2000按照說明書的操作步驟將TAZ靶向siRNA(序列：CCGUUUCCCUGAUUUCCUUTT)以及陰性對照(序列：ACUCUGGACUGAAUCGACGAU)轉染入細胞中。于轉染4～6 h 后更換含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 qRT-PCR檢測MHCC97H細胞中TAZ、Nek7、GAPDH的mRNA水平

收集經處理的MHCC97H細胞，應用TRIzol試劑法提取各組細胞的總RNA，用逆轉錄試劑盒將其反轉錄成cDNA，反應條件如下：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，隨后以此cDNA為模板進行qRT-PCR。PCR反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，共40 個循環(huán)。以2-ΔΔCt值表示各基因 mRNA 的相對表達水平。TAZ、Nek7、GAPDH的qRT-PCR引物見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4 Western blot檢測TAZ、Nek7、GAPDH蛋白表達水平

收集經處理的MHCC97H細胞，提取細胞總蛋白。采用Western blot檢測TAZ、Nek7、GAPDH蛋白表達水平，Image Lab軟件分析蛋白條帶灰度值。蛋白的表達情況以TAZ或Nek7條帶的灰度值與GAPDH條帶灰度值的比值表示。

1.5 設計引物及構建pCMV5-HA-TAZ過表達質粒

根據Genbank的基因序列設計引物,其中限制性內切酶BamH I序列：GTTGGATCCATGAATCCGGCCTCGGCGCC，RcoRⅠ序列：GACGAATTCTTACAGCCAGGTTAGAAAGG。提取總RNA，將其反轉錄為cDNA進行PCR擴增反應，利用T4 DNA連接酶連接TAZ全長片段與pCMV5-HA空載體，然后將連接產物轉化到DH5α感受態(tài)大腸桿菌，擴增后抽提質粒DNA，酶切及測序驗證。

1.6 細胞計數(shù)kit-8(CCK-8)實驗檢測細胞活力

肝癌細胞MHCC97H經轉染siRNA或者過表達質粒之后，接種到96孔板中分別培養(yǎng)24、48、72及96 h，實驗終止前2 h按照CCK-8試劑盒說明要求加入20 μl試劑，37°孵育2 h，應用酶標儀檢測在450 nm處的吸光值，根據各組所得數(shù)據制作OD值曲線。

1.7 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，數(shù)據以均數(shù)±標準差表示；t檢驗被用于兩組間數(shù)據的比較；方差分析用于多組間數(shù)據的比較，而Tukey 法或Dunnett’s T3 法用于組間兩兩比較分析，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。本研究中的所有實驗均重復3次。

2 結果

2.1 轉染TAZ靶向siRNA后TAZ、Nek7、GAPDH的mRNA和蛋白表達情況

取生長狀態(tài)良好的MHCC97H細胞，按如下分組：siTAZ組、陰性對照組(siNC組)、空白對照組(Blank組)，轉染相應的siRNA，24 h后提取RNA，進行qRT-PCR；48 h后提取細胞總蛋白，進行Western blot，實驗結果見圖1。結果顯示：與陰性對照組(TAZ mRNA的相對表達水平為3.48±0.43,蛋白的相對表達水平2.28±0.31)相比，siTAZ(TAZ mRNA 的相對表達水平為1.07±0.15,蛋白的相對表達水平0.81±0.21)有明顯靶向干擾效果，能使TAZ的mRNA水平下降70%，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.0001)；蛋白表達水平下降65%，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.0001)。進一步檢測Nek7的表達變化發(fā)現(xiàn)，其mRNA水平從相對表達量1.08下降至0.31，下降70%，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.0001)；蛋白從相對表達量0.98下降至0.25水平下降75%，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.0001)。實驗結果說明TAZ與Nek7之間存在關聯(lián)，TAZ可以調控Nek7的表達。

A為qRT-PCR量化數(shù)據柱狀圖,B為Western blot成像圖。

2.2 TAZ表達水平降低對肝癌細胞MHCC97H增殖能力的影響

CCK-8實驗結果發(fā)現(xiàn)：與siNC組相比，siTAZ組MHCCC97H細胞活性明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)，實驗結果見圖2。

圖2 MHCC97H細胞CKK-8實驗數(shù)據量化圖

2.3 TAZ過表達質粒的構建

提取人肝癌細胞株MHCC97H細胞中的總RNA，以總RNA為模板反轉錄為cDNA，以得到的cDNA為模板進行PCR擴增反應。將得到的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳驗證：成功擴增出TAZ基因編碼區(qū)的外顯子序列，結果見圖3。為排除PCR產物為非特異性擴增所得，我們以GAPDH為對照，確保所得的PCR產物準確可靠。以得到的產物為基礎成功構建了TAZ的過表達質粒，用HA-TAZ表示。

圖3 TAZ PCR產物瓊脂糖凝膠電泳成像圖

2.4 過表達TAZ后TAZ、Nek7、GAPDH mRNA和蛋白表達情況

將得到的HATAZ質粒轉染入MHCC97H細胞中，24 h后提取RNA，進行qRT-PCR；48 h后提取細胞總蛋白，進行Western blot，實驗結果見圖4。結果顯示：與轉染了HA-Vector質粒組相比，轉染了HA-TAZ質粒組細胞的TAZ mRNA表達水平從(3.25±0.37)上升至(6.74±0.56)，蛋白水平從(2.65±0.45)上升至(5.89±0.51)；Nek7的mRNA和蛋白表達水平也分別增高200%和150%，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.0001)，見圖4。

A為qRT-PCR量化數(shù)據柱狀圖,B為Western blot成像圖。

2.5 TAZ表達增強使MHCC97H細胞增殖能力提高

將轉染了HA-Vector或者HA-TAZ質粒的MHCC97H細胞接種到96孔板中，CKK-8檢測細胞活力，結果如圖5所示：與HA-Vector組相比，轉染了HA-TAZ組的細胞活力明顯提高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。

圖5 MHCC97H細胞CKK-8實驗數(shù)據量化圖

3 討論

肝癌是我國高發(fā)的惡性腫瘤，與國外相比，我國肝癌具有年輕化、發(fā)病率高、死亡率高等特點[14]。雖然，近十幾年的部分研究成果已經開始應用于臨床檢測和治療[3,15-16]，但是肝癌術后的恢復情況仍然不樂觀，因此，我們有必要深入了解肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機制，這將有助于臨床制定出更有利的治療策略。腫瘤的發(fā)生是1個多基因參與、多步驟的復雜的慢性過程，現(xiàn)代觀點認為腫瘤發(fā)生最主要是由于細胞內蛋白平衡紊亂，抑癌基因失活，促癌基因表達增加。腫瘤細胞1個最主要的特點就是永生性，它能擺脫細胞死亡的過程，進而發(fā)展成不受限制的增殖，最終導致向其他細胞或組織侵襲[17]。結合以上這兩點，我們選擇肝癌的增殖領域來研究，以經典的肝癌細胞株MHCC97H為研究對象，以期發(fā)現(xiàn)更多的治療肝癌的分子靶點。

轉錄共激活子TAZ/WWTR1是新近發(fā)現(xiàn)的、具有轉錄調節(jié)作用的蛋白，它包含1個保守的WW區(qū)域、1個14-3-3結合位點以及C端的PDZ結合模體[18]。做為Hippo信號通路中的重要效應分子，在哺乳動物中,TAZ能起到控制器官大小的作用[19]；另外還有研究表明，TAZ可以控制細胞的增殖[20]。眾多的研究表明TAZ為1個癌基因，它參與了腫瘤的形成，并能促進腫瘤的侵襲轉移[21]。在肝癌中，TAZ的表達比癌旁高[22]，提示TAZ在肝癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色。在本研究中我們發(fā)現(xiàn)，TAZ基因的表達發(fā)生改變時，肝癌細胞MHCC97H的細胞活性和增殖能力也會發(fā)生改變，兩者的改變是正相關的。這說明TAZ能夠控制肝癌細胞的增殖，可以作為1個新的生物治療的靶點。

盡管很多基因和通路已經被證明可以作為肝癌的早期檢測、診斷和生物治療靶點，但是更多可能的、新的生物標記仍然需要被發(fā)掘。最近的1項研究表明Nek7在肝癌中高表達，且能控制細胞周期進而促進細胞增殖[13]?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)，我們推測TAZ可以通過調控Nek7的表達來影響肝癌細胞的增殖。為了驗證我們的設想，我們應用RNA干擾和質粒過表達技術改變TAZ的表達，結果我們發(fā)現(xiàn)，Nek7同樣隨著TAZ的變化而變化，而且還能影響肝癌細胞的增殖。這些結果驗證了我們之前的推測，為將Nek7定義為肝癌的生物治療靶點提供了更多的證據。

本文實驗結果表明轉錄共激活子TAZ可以調控Nek7的表達進而促進肝癌細胞MHCC97H的增殖，為揭示原發(fā)性肝癌初始發(fā)生啟動機制提供1個嶄新思路。

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(編輯：吳小紅)

Effect of Transcriptional Coactivator TAZ on Proliferation of Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line MHCC97H

ZHANG Lei,WANG Lin,GENG Zhimin,et al.

The First Affiliated Hospital,Xi'an Jiaotong University,Xi’an,710061

Objective To study the effect of transcriptional co-activator TAZ(transcriptional coactivator with PDZ binding motif)on the proliferation of hepatocellular carcinoma cell line MHCC97H,to provide a new research idea for clarifying the occurrence and development mechanism of hepatocellular carcinoma(HCC).Methods Change the expression of TAZ in hepatocellular carcinoma cell line MHCC97H by using cell transfection,RNA interference(RNAi)and over expression.After transfection,the RNA and total proteins were extracted,and then the expression of TAZ and Nek7 were detected by qRT-PCR and western blot.Cell counting kit-8(CCK-8)assay was performed to detect the cell viability and proliferation.Results Compared with the non-control(NC)group,the TAZ’s mRNA and protein expression were down regulated after transfected the TAZ specific targeting interfere fragments,the difference was statistically significant(P<0.0001)correspondingly,the expression of Nek7 were decreased;meanwhile the functional tests(CKK8)showed that the viability and proliferation of MHCC97H cells were also decreased.On the other hand,the expression of Nek7 was increased after up-regulating the TAZ’s expression;as a result,the viability and proliferation ability of MHCC97H cells was also increased.Conclusion The transcriptional co-activator TAZ can affect the proliferation of HCC cell line MHCC97H by regulating the expression of Nek7,which can provide some experimental basis for elucidating the role of TAZ in the progression of hepatocellular carcinoma.

TAZ;Nek7;Hepatocellular carcinoma;MHCC97H cells;Proliferation

710061 西安交通大學第一附屬醫(yī)院

孟憲魁

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.08.001

R735.7

A

1001-5930(2017)08-1219-05

2016-08-24

2017-06-12)