周燕利，聶瓊芳，吳曉蘭

（武漢理工大學醫(yī)院 神經內科，湖北 武漢 430010）

硝普鈉與尼莫地平治療大鼠腦出血損傷的療效及與凝血酶受體-1表達的相關研究

周燕利，聶瓊芳，吳曉蘭

（武漢理工大學醫(yī)院 神經內科，湖北 武漢 430010）

目的探討硝普鈉與尼莫地平治療大鼠腦出血（ICH），降低大鼠腦血腫及腦出血后神經元損傷的療效及與凝血酶受體-1（PAR1）表達的相關性。方法用30只雄性Wista大鼠（200～220 g）復制腦出血ICH模型，并隨機分為3組（每組10只），分別是假手術組、腦出血組和聯合治療組。大鼠于ICH手術成功后48 h處死，收集大鼠腦組織備用。采用TUNEL法檢測細胞凋亡的發(fā)生；干燥法檢測大鼠腦組織水含量；采用免疫組織化學法和蛋白質印跡法Western blot檢測PAR1蛋白的表達。結果與假手術組比較，腦出血組和聯合治療組中凋亡細胞數和腦組織水含量增多（均P=0.000），而聯合治療組中凋亡細胞數和腦組織水含量低于腦出血組（均P=0.000）；與假手術組PAR1蛋白含量（0.673±0.121）比較，腦出血組PAR1蛋白含量（2.187±0.233）和聯合治療組PAR1蛋白含量（1.434±0.168）上升，差異有統計學意義（P=0.000），與腦出血組比較，聯合治療組PAR1蛋白含量下降，差異有統計學意義（P=0.000）；Western blot結果與免疫組織化學結果一致。結論硝普鈉與尼莫地平通過對PAR1的調控治療大鼠腦出血損傷，具有神經保護作用。

腦出血；硝普鈉；尼莫地平；凝血酶受體-1

Abstract:ObjectiveTo investgate the effect of sodium nitroprusside and nimodipine on cerebral hemorrhage(ICH)in rats and its correlation with expression of thrombin receptor-1 (PAR1).MethodsThirty male Wistar rats(200-220 g)were randomly divided into 3 groups(n=10 each):sham operation group,cerebral hemorrhage group and combination therapy group.Rats were sacrificed 48 hours after successful ICH operation.The apoptosis of neurons was detected by TUNEL method.The water content of brain tissue was detected.The expression of thrombin receptor-1 (PAR1)protein was detected by Immunohistochemistry and Western blot.ResultsCompared with the sham group,the number of apoptotic cells and water content in cerebral hemorrhage group and combination therapy group were significantly increased (P=0.000),while the number of apoptotic cells and water content of brain tissue in combination group were significantly lower than the cerebral hemorrhage group (P=0.000).Compared with sham group,PAR1 protein expression in cerebral hemorrhage group(2.187±0.233)and PAR1 protein expression in ICH group(1.434±0.168)were significantly increased(0.673±0.121) (P=0.000).Compared with ICH group,the PAR1 protein expression in the combination group significantly decreased (P=0.000),and the difference was statistically significant (P=0.000).The results ofwestern blot were consistent with immunohistochemical results.ConclusionsSodium nitroprusside and nimodipine have neuroprotective effects on cerebral hemorrhage by regulating the expression of thrombin receptor-1(PAR1)in rats.

Keywords:cerebral hemorrhage;sodium nitroprusside;nimodipine;thrombin receptor-1

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是一種常見的神經外科疾病，其死亡率是急性腦血管病中最高的，嚴重危害人類的健康[1]。近年研究表明，腦出血后血腫產生的凝血酶與腦出血后的周圍組織水腫、神經細胞凋亡、血腦屏障破壞及腦組織損傷等過程密切相關[2-3]。正常生理情況下，凝血酶通過作用于腦組織內凝血酶受體-1（protease activated receptor-1，PAR1）介導細胞毒性作用，而凝血酶抑制劑可減輕腦出血后腦組織水腫及神經損傷[4-5]。腦出血后如何調控PAR1的變化，對腦出血損傷機制的研究及臨床治療具有非常重要的意義。硝普鈉作為一種強效的周圍血管擴張劑[6]，可與尼莫地平共同作用，改善腦血流量并促進腦細胞恢復改善腦循環(huán)[7]。本研究旨在探討硝普鈉與尼莫地平聯合作用調控PAR1治療腦出血損傷的機制，復制大鼠腦缺血ICH模型，觀察硝普鈉與尼莫地平降低大腦血腫及改善其預后的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

一抗兔抗多克隆抗體PAR1（美國Santa Cruz生物技術有限公司），二抗堿性磷酸酶標記山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司），細胞凋亡檢測試驗盒、免疫組織化學二氨基聯苯胺（Diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒（上海碧云天生物工程有限公司）。

1.2 實驗動物與分組處理

30只雄性Wista大鼠（200～220）g（購于北京維通利華實驗動物技術有限公司）。Wista大鼠飼養(yǎng)在溫度為（22±2）℃的無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級動物實驗室，晝夜循環(huán)12 h/12 h光照。成功復制大鼠ICH模型后，隨機分為3組（每組10只），分別是假手術組、腦出血組和聯合治療組。硝普鈉與尼莫地平在模型成功后6 h經腹腔注射1.0 mg/kg（1∶1），每隔12 h注射1次。大鼠于ICH手術成功后48 h被處死，收集大鼠腦組織備用。

1.3 方法

1.3.1 Rosenberg法腦出血模型復制 稱重后給予大鼠（300 mg/kg）腹腔注射10%水合氯醛，麻醉后大鼠俯臥位于立體儀上固定。暴露大鼠顱骨并將骨膜剝離，用微量注射儀取大鼠自體不凝血80 μl，緩慢注入左側大鼠尾狀核部位，留針10 min后撤針，消毒縫合切口，即復制ICH模型。假手術組不注血，其余步驟同上。聯合治療組術后1h給予腹腔注射硝普鈉（1.0 mg/kg）與尼莫地平（1.0 mg/kg）；腦出血組與假手術組術后1 h給予生理鹽水腹腔注射。手術后按Longa 5分制標準進行評分：①0分，無明顯神經病學癥狀；②1分，不能完全伸展左前肢；③2分，向左側旋轉；④3分，行走時向左側傾倒；⑤4分，不能自行行走，有意識障礙。動物蘇醒后，觀察缺血動物的神經功能缺失癥狀。累積>1分即為成功模型。

1.3.2 TUNEL原位凋亡細胞檢測 大鼠腹腔注射麻醉后，依次使用生理鹽水200 ml和4%多聚甲醛200 ml進行心臟灌注固定。腦組織常規(guī)脫水透明，并用石蠟包埋連續(xù)切片3張（8μm/張）。①切片加入標記液恒溫37℃孵育2h，加入生物素恒溫孵育30min；②鏈霉親和素-生物素復合物試劑37℃恒溫孵育30min，加入DAB顯色液進行顯色。切片用物鏡（×10）（×40）顯微鏡進行觀察，細胞核中有棕黃色顆粒者視為凋亡細胞，切片隨機選擇5個高倍鏡視野，進行凋亡細胞計數（×400），平均值視為凋亡細胞數。

1.3.3 干燥法測腦組織水含量 大鼠麻醉后斷頭處死，應用干濕比重法，取大腦前部組織立即測濕重。將組織塊放入電熱烘箱中100℃烘烤24 h至恒重，再稱干重。按下列公式計算出組織水含量：腦組織水含量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.3.4 免疫組織化學法檢測PAR1表達 制備大鼠腦組織石蠟切片，切片用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗，滴入5%血清進行30 min室溫封閉，切片加入1∶1 000的PAR1一抗進行4℃孵育過夜。隔天取出切片PBS清洗，加入1∶1 000的二抗進行37℃孵育30 min。PBS復洗并加入霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶進行37℃恒溫反應30 min，加入DAB 顯色液進行，用物鏡（×10）（×40）顯微鏡進行觀察。陽性表達PAR1主要表現是細胞內出現棕黃色顆粒，用（×40）物鏡顯微鏡觀察，隨機選擇6個高倍視野，計算PAR1蛋白含量的平均光密度值（mean optical density，MOD）。MOD=累積光密度與面積的比值，用于反映組織中PAR1蛋白含量。

1.3.5 Western blot檢測PAR1蛋白表達水平 取大腦組織冰上裂解2h，離心后用BCA蛋白濃度（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒進行蛋白濃度檢測，將各組蛋白濃度總量調整為30μg/μl。將各組蛋白樣品加入到10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠中進行電泳，轉膜至聚偏二氟乙烯膜后按1∶1 000的稀釋比例加入多克隆抗體PAR1和二抗。用增強化學發(fā)光法顯色劑顯色，用Bio-Pro凝膠成像分析儀成像以及用Quantity-one軟件對各泳道條帶進行灰度掃描得出相應蛋白表達量。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 21.0統計軟件，計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較做單因素方差分析，兩兩比較用Bonferroni's Multiple Comparison Test檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 神經組織學評分結果

腦出血組0分1只，5只判定為1分，2只判定為2分，2只判定為3分；聯合治療組，6只判定為1分，1只判定為2分，1只判定為3分。3組間秩和檢驗（H檢驗），差異有統計學意義（H=16.7298，P=0.0002）。

2.2 凋亡細胞數檢測結果

假手術組僅見極少數的凋亡細胞，腦出血組和硝普鈉與尼莫地平聯合治療組的凋亡細胞數量上升。假手術組腦凋亡細胞數量（3.57±0.61）、腦出血組凋亡細胞數量（26.31±1.27）和聯合治療組凋亡細胞數量（13.64±1.31）比較，差異有統計學意義（F=1052，P=0.000）。與假手術組比較，腦出血組的凋亡細胞數量增多，差異有統計學意義（t=45.78，P=0.000）；硝普鈉與尼莫地平聯合治療組的凋亡細胞數量也增多，差異有統計學意義（t=20.27，P=0.000）；與腦出血組比較，聯合治療組中的凋亡細胞數降低，差異有統計學意義（t=25.21，P=0.000）。見圖 1。

2.3 腦組織水含量

假手術組腦組織水含量（71.418±2.254）g、腦出血組腦組織水含量（84.131±1.982）g和聯合治療組腦組織水含量（75.656±1.771）g比較，差異有統計學意義（F=103.7，P=0.000）。與假手術組腦組織水含量比較，腦出血組的水含量增多，差異有統計學意義（t=14.14，P=0.000）；硝普鈉與尼莫地平聯合治療組的水含量也增多（t=4.718，P=0.000），差異有統計學意義；與腦出血組比較，聯合治療組中的水含量降低，差異有統計學意義（t=9.424，P=0.000）。

2.4 各組PAR1蛋白含量比較

腦出血組和硝普鈉與尼莫地平聯合治療組中的PAR1蛋白染色強度增強，大鼠腦組織中PAR1呈高表達狀態(tài)（見圖2）。光密度結果顯示，假手術組腦組織PAR1蛋白含量（0.673±0.121）、腦出血組PAR1蛋白含量（2.187±0.233）和聯合治療組PAR1蛋白含量（1.434±0.168）比較，差異有統計學意義（F=180.100，P=0.000）。與假手術組比較，腦出血組PAR1蛋白含量增多，差異有統計學意義（t=18.980，P=0.000）；硝普鈉與尼莫地平聯合治療組PAR1蛋白含量也增多，差異有統計學意義（t=9.490，P=0.000）。與腦出血組比較，聯合治療組PAR1蛋白含量下降，差異有統計學意義（t=9.490，P=0.000）。

2.5 各組的PAR1蛋白表達量比較

Western blot分析顯示，假手術組腦組織PAR1蛋白表達量（0.943±0.448）、腦出血組PAR1蛋白含量（2.311±0.547）和聯合治療組PAR1蛋白含表達量（1.627±0.493）比較，差異有統計學意義（F=18.89，P=0.000）。與假手術組比較，腦出血組PAR1蛋白表達量增多，差異有統計學意義（t=6.147，P=0.000）；硝普鈉與尼莫地平聯合治療組PAR1蛋白表達量也增多，差異有統計學意義（t=3.037，P=0.000）。與腦出血組比較，聯合治療組PAR1蛋白含量降低，差異有統計學意義（t=3.037，P=0.000）。見圖3。

圖1 各組的凋亡細胞數 （×400）

圖2 各組的PAR1蛋白含量 （×400）

圖3 各組的PAR1蛋白表達量變化

3 討論

腦出血具有高發(fā)病率、高致殘率及高死亡率的特點，嚴重危害人類的健康[1，8]。腦出血后血腫產生的凝血酶及PAR1與腦組織周圍的繼發(fā)性損傷密切相關[2-3]。硝普鈉是一種速效、短時的血管擴張藥[9]，對動脈和靜脈的平滑肌有擴張作用，減輕周圍血管阻力，是治療腦出血的首選藥物之一[10-12]；尼莫地平作為鈣離子拮抗劑，可透過血腦屏障、減輕腦細胞鈣超載，使血腫周圍血流量和血管性水腫減輕[13-14]。研究表明硝普鈉與尼莫地平對顱腦損傷腦功能恢復均有明顯的療效[15-16]。

本研究旨在探討硝普鈉與尼莫地平聯合作用調控PAR1治療腦出血損傷的機制。研究結果顯示，與假手術組比較，腦出血組和硝普鈉與尼莫地平聯合治療組的凋亡細胞數及腦組織水含量增加，表明大鼠腦出血腦水腫模型復制成功，發(fā)生細胞凋亡；聯合治療組中的凋亡細胞數及腦組織水含量低于腦出血組，說明腦出血后給予硝普鈉與尼莫地平可有效緩解腦出血損傷，減少細胞凋亡。免疫組織化學檢測PAR1蛋白含量可知，腦出血后PAR1的含量上升，調控腦組織血流量及水腫的變化；同時發(fā)現，硝普鈉與尼莫地平的聯合使用可有效降低PAR1蛋白含量，有效作用于凝血酶受體來緩解腦出血損傷。

綜上所述，硝普鈉與尼莫地平可以通過調節(jié)PAR1產生抗細胞凋亡作用，降低大腦血腫及改善神經損傷，這對于臨床治療腦出血水腫、緩解神經元損傷具有重要的意義。

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Efficacy of nitroprusside and nimodipine in treatment of cerebral hemorrhage in rats and its correlation with thrombin receptor-1 expression

Yan-li Zhou,Qiong-fang Nie,Xiao-lan Wu
(Department of Neurology,Wuhan University of Technology Hospital,Wuhan,Hubei 430010,China)

R743.34

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.15.006

1005-8982（2017）15-0029-05

2017-01-03

吳曉蘭，E-mail：76767508@qq.com