周燕利，聶瓊芳，吳曉蘭

（武漢理工大學(xué)醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，湖北 武漢 430010）

硝普鈉與尼莫地平治療大鼠腦出血損傷的療效及與凝血酶受體-1表達(dá)的相關(guān)研究

周燕利，聶瓊芳，吳曉蘭

（武漢理工大學(xué)醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科，湖北 武漢 430010）

目的探討硝普鈉與尼莫地平治療大鼠腦出血（ICH），降低大鼠腦血腫及腦出血后神經(jīng)元損傷的療效及與凝血酶受體-1（PAR1）表達(dá)的相關(guān)性。方法用30只雄性Wista大鼠（200～220 g）復(fù)制腦出血ICH模型，并隨機(jī)分為3組（每組10只），分別是假手術(shù)組、腦出血組和聯(lián)合治療組。大鼠于ICH手術(shù)成功后48 h處死，收集大鼠腦組織備用。采用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生；干燥法檢測(cè)大鼠腦組織水含量；采用免疫組織化學(xué)法和蛋白質(zhì)印跡法Western blot檢測(cè)PAR1蛋白的表達(dá)。結(jié)果與假手術(shù)組比較，腦出血組和聯(lián)合治療組中凋亡細(xì)胞數(shù)和腦組織水含量增多（均P=0.000），而聯(lián)合治療組中凋亡細(xì)胞數(shù)和腦組織水含量低于腦出血組（均P=0.000）；與假手術(shù)組PAR1蛋白含量（0.673±0.121）比較，腦出血組PAR1蛋白含量（2.187±0.233）和聯(lián)合治療組PAR1蛋白含量（1.434±0.168）上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000），與腦出血組比較，聯(lián)合治療組PAR1蛋白含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.000）；Western blot結(jié)果與免疫組織化學(xué)結(jié)果一致。結(jié)論硝普鈉與尼莫地平通過(guò)對(duì)PAR1的調(diào)控治療大鼠腦出血損傷，具有神經(jīng)保護(hù)作用。

腦出血；硝普鈉；尼莫地平；凝血酶受體-1

Abstract:ObjectiveTo investgate the effect of sodium nitroprusside and nimodipine on cerebral hemorrhage(ICH)in rats and its correlation with expression of thrombin receptor-1 (PAR1).MethodsThirty male Wistar rats(200-220 g)were randomly divided into 3 groups(n=10 each):sham operation group,cerebral hemorrhage group and combination therapy group.Rats were sacrificed 48 hours after successful ICH operation.The apoptosis of neurons was detected by TUNEL method.The water content of brain tissue was detected.The expression of thrombin receptor-1 (PAR1)protein was detected by Immunohistochemistry and Western blot.ResultsCompared with the sham group,the number of apoptotic cells and water content in cerebral hemorrhage group and combination therapy group were significantly increased (P=0.000),while the number of apoptotic cells and water content of brain tissue in combination group were significantly lower than the cerebral hemorrhage group (P=0.000).Compared with sham group,PAR1 protein expression in cerebral hemorrhage group(2.187±0.233)and PAR1 protein expression in ICH group(1.434±0.168)were significantly increased(0.673±0.121) (P=0.000).Compared with ICH group,the PAR1 protein expression in the combination group significantly decreased (P=0.000),and the difference was statistically significant (P=0.000).The results ofwestern blot were consistent with immunohistochemical results.ConclusionsSodium nitroprusside and nimodipine have neuroprotective effects on cerebral hemorrhage by regulating the expression of thrombin receptor-1(PAR1)in rats.

Keywords:cerebral hemorrhage;sodium nitroprusside;nimodipine;thrombin receptor-1

腦出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是一種常見(jiàn)的神經(jīng)外科疾病，其死亡率是急性腦血管病中最高的，嚴(yán)重危害人類的健康[1]。近年研究表明，腦出血后血腫產(chǎn)生的凝血酶與腦出血后的周圍組織水腫、神經(jīng)細(xì)胞凋亡、血腦屏障破壞及腦組織損傷等過(guò)程密切相關(guān)[2-3]。正常生理情況下，凝血酶通過(guò)作用于腦組織內(nèi)凝血酶受體-1（protease activated receptor-1，PAR1）介導(dǎo)細(xì)胞毒性作用，而凝血酶抑制劑可減輕腦出血后腦組織水腫及神經(jīng)損傷[4-5]。腦出血后如何調(diào)控PAR1的變化，對(duì)腦出血損傷機(jī)制的研究及臨床治療具有非常重要的意義。硝普鈉作為一種強(qiáng)效的周圍血管擴(kuò)張劑[6]，可與尼莫地平共同作用，改善腦血流量并促進(jìn)腦細(xì)胞恢復(fù)改善腦循環(huán)[7]。本研究旨在探討硝普鈉與尼莫地平聯(lián)合作用調(diào)控PAR1治療腦出血損傷的機(jī)制，復(fù)制大鼠腦缺血ICH模型，觀察硝普鈉與尼莫地平降低大腦血腫及改善其預(yù)后的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

一抗兔抗多克隆抗體PAR1（美國(guó)Santa Cruz生物技術(shù)有限公司），二抗堿性磷酸酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），細(xì)胞凋亡檢測(cè)試驗(yàn)盒、免疫組織化學(xué)二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine，DAB）顯色試劑盒（上海碧云天生物工程有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組處理

30只雄性Wista大鼠（200～220）g（購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司）。Wista大鼠飼養(yǎng)在溫度為（22±2）℃的無(wú)特定病原體（specific pathogen free，SPF）級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，晝夜循環(huán)12 h/12 h光照。成功復(fù)制大鼠ICH模型后，隨機(jī)分為3組（每組10只），分別是假手術(shù)組、腦出血組和聯(lián)合治療組。硝普鈉與尼莫地平在模型成功后6 h經(jīng)腹腔注射1.0 mg/kg（1∶1），每隔12 h注射1次。大鼠于ICH手術(shù)成功后48 h被處死，收集大鼠腦組織備用。

1.3 方法

1.3.1 Rosenberg法腦出血模型復(fù)制 稱重后給予大鼠（300 mg/kg）腹腔注射10%水合氯醛，麻醉后大鼠俯臥位于立體儀上固定。暴露大鼠顱骨并將骨膜剝離，用微量注射儀取大鼠自體不凝血80 μl，緩慢注入左側(cè)大鼠尾狀核部位，留針10 min后撤針，消毒縫合切口，即復(fù)制ICH模型。假手術(shù)組不注血，其余步驟同上。聯(lián)合治療組術(shù)后1h給予腹腔注射硝普鈉（1.0 mg/kg）與尼莫地平（1.0 mg/kg）；腦出血組與假手術(shù)組術(shù)后1 h給予生理鹽水腹腔注射。手術(shù)后按Longa 5分制標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分：①0分，無(wú)明顯神經(jīng)病學(xué)癥狀；②1分，不能完全伸展左前肢；③2分，向左側(cè)旋轉(zhuǎn)；④3分，行走時(shí)向左側(cè)傾倒；⑤4分，不能自行行走，有意識(shí)障礙。動(dòng)物蘇醒后，觀察缺血?jiǎng)游锏纳窠?jīng)功能缺失癥狀。累積>1分即為成功模型。

1.3.2 TUNEL原位凋亡細(xì)胞檢測(cè) 大鼠腹腔注射麻醉后，依次使用生理鹽水200 ml和4%多聚甲醛200 ml進(jìn)行心臟灌注固定。腦組織常規(guī)脫水透明，并用石蠟包埋連續(xù)切片3張（8μm/張）。①切片加入標(biāo)記液恒溫37℃孵育2h，加入生物素恒溫孵育30min；②鏈霉親和素-生物素復(fù)合物試劑37℃恒溫孵育30min，加入DAB顯色液進(jìn)行顯色。切片用物鏡（×10）（×40）顯微鏡進(jìn)行觀察，細(xì)胞核中有棕黃色顆粒者視為凋亡細(xì)胞，切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡視野，進(jìn)行凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)（×400），平均值視為凋亡細(xì)胞數(shù)。

1.3.3 干燥法測(cè)腦組織水含量 大鼠麻醉后斷頭處死，應(yīng)用干濕比重法，取大腦前部組織立即測(cè)濕重。將組織塊放入電熱烘箱中100℃烘烤24 h至恒重，再稱干重。按下列公式計(jì)算出組織水含量：腦組織水含量（%）=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.3.4 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)PAR1表達(dá) 制備大鼠腦組織石蠟切片，切片用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗，滴入5%血清進(jìn)行30 min室溫封閉，切片加入1∶1 000的PAR1一抗進(jìn)行4℃孵育過(guò)夜。隔天取出切片PBS清洗，加入1∶1 000的二抗進(jìn)行37℃孵育30 min。PBS復(fù)洗并加入霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶進(jìn)行37℃恒溫反應(yīng)30 min，加入DAB 顯色液進(jìn)行，用物鏡（×10）（×40）顯微鏡進(jìn)行觀察。陽(yáng)性表達(dá)PAR1主要表現(xiàn)是細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒，用（×40）物鏡顯微鏡觀察，隨機(jī)選擇6個(gè)高倍視野，計(jì)算PAR1蛋白含量的平均光密度值（mean optical density，MOD）。MOD=累積光密度與面積的比值，用于反映組織中PAR1蛋白含量。

1.3.5 Western blot檢測(cè)PAR1蛋白表達(dá)水平 取大腦組織冰上裂解2h，離心后用BCA蛋白濃度（bicinchoninic acid，BCA）試劑盒進(jìn)行蛋白濃度檢測(cè)，將各組蛋白濃度總量調(diào)整為30μg/μl。將各組蛋白樣品加入到10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯膜后按1∶1 000的稀釋比例加入多克隆抗體PAR1和二抗。用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色劑顯色，用Bio-Pro凝膠成像分析儀成像以及用Quantity-one軟件對(duì)各泳道條帶進(jìn)行灰度掃描得出相應(yīng)蛋白表達(dá)量。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較做單因素方差分析，兩兩比較用Bonferroni's Multiple Comparison Test檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)組織學(xué)評(píng)分結(jié)果

腦出血組0分1只，5只判定為1分，2只判定為2分，2只判定為3分；聯(lián)合治療組，6只判定為1分，1只判定為2分，1只判定為3分。3組間秩和檢驗(yàn)（H檢驗(yàn)），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=16.7298，P=0.0002）。

2.2 凋亡細(xì)胞數(shù)檢測(cè)結(jié)果

假手術(shù)組僅見(jiàn)極少數(shù)的凋亡細(xì)胞，腦出血組和硝普鈉與尼莫地平聯(lián)合治療組的凋亡細(xì)胞數(shù)量上升。假手術(shù)組腦凋亡細(xì)胞數(shù)量（3.57±0.61）、腦出血組凋亡細(xì)胞數(shù)量（26.31±1.27）和聯(lián)合治療組凋亡細(xì)胞數(shù)量（13.64±1.31）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1052，P=0.000）。與假手術(shù)組比較，腦出血組的凋亡細(xì)胞數(shù)量增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=45.78，P=0.000）；硝普鈉與尼莫地平聯(lián)合治療組的凋亡細(xì)胞數(shù)量也增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=20.27，P=0.000）；與腦出血組比較，聯(lián)合治療組中的凋亡細(xì)胞數(shù)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=25.21，P=0.000）。見(jiàn)圖 1。

2.3 腦組織水含量

假手術(shù)組腦組織水含量（71.418±2.254）g、腦出血組腦組織水含量（84.131±1.982）g和聯(lián)合治療組腦組織水含量（75.656±1.771）g比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=103.7，P=0.000）。與假手術(shù)組腦組織水含量比較，腦出血組的水含量增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=14.14，P=0.000）；硝普鈉與尼莫地平聯(lián)合治療組的水含量也增多（t=4.718，P=0.000），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與腦出血組比較，聯(lián)合治療組中的水含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.424，P=0.000）。

2.4 各組PAR1蛋白含量比較

腦出血組和硝普鈉與尼莫地平聯(lián)合治療組中的PAR1蛋白染色強(qiáng)度增強(qiáng)，大鼠腦組織中PAR1呈高表達(dá)狀態(tài)（見(jiàn)圖2）。光密度結(jié)果顯示，假手術(shù)組腦組織PAR1蛋白含量（0.673±0.121）、腦出血組PAR1蛋白含量（2.187±0.233）和聯(lián)合治療組PAR1蛋白含量（1.434±0.168）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=180.100，P=0.000）。與假手術(shù)組比較，腦出血組PAR1蛋白含量增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=18.980，P=0.000）；硝普鈉與尼莫地平聯(lián)合治療組PAR1蛋白含量也增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.490，P=0.000）。與腦出血組比較，聯(lián)合治療組PAR1蛋白含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=9.490，P=0.000）。

2.5 各組的PAR1蛋白表達(dá)量比較

Western blot分析顯示，假手術(shù)組腦組織PAR1蛋白表達(dá)量（0.943±0.448）、腦出血組PAR1蛋白含量（2.311±0.547）和聯(lián)合治療組PAR1蛋白含表達(dá)量（1.627±0.493）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=18.89，P=0.000）。與假手術(shù)組比較，腦出血組PAR1蛋白表達(dá)量增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.147，P=0.000）；硝普鈉與尼莫地平聯(lián)合治療組PAR1蛋白表達(dá)量也增多，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.037，P=0.000）。與腦出血組比較，聯(lián)合治療組PAR1蛋白含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.037，P=0.000）。見(jiàn)圖3。

圖1 各組的凋亡細(xì)胞數(shù) （×400）

圖2 各組的PAR1蛋白含量 （×400）

圖3 各組的PAR1蛋白表達(dá)量變化

3 討論

腦出血具有高發(fā)病率、高致殘率及高死亡率的特點(diǎn)，嚴(yán)重危害人類的健康[1，8]。腦出血后血腫產(chǎn)生的凝血酶及PAR1與腦組織周圍的繼發(fā)性損傷密切相關(guān)[2-3]。硝普鈉是一種速效、短時(shí)的血管擴(kuò)張藥[9]，對(duì)動(dòng)脈和靜脈的平滑肌有擴(kuò)張作用，減輕周圍血管阻力，是治療腦出血的首選藥物之一[10-12]；尼莫地平作為鈣離子拮抗劑，可透過(guò)血腦屏障、減輕腦細(xì)胞鈣超載，使血腫周圍血流量和血管性水腫減輕[13-14]。研究表明硝普鈉與尼莫地平對(duì)顱腦損傷腦功能恢復(fù)均有明顯的療效[15-16]。

本研究旨在探討硝普鈉與尼莫地平聯(lián)合作用調(diào)控PAR1治療腦出血損傷的機(jī)制。研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，腦出血組和硝普鈉與尼莫地平聯(lián)合治療組的凋亡細(xì)胞數(shù)及腦組織水含量增加，表明大鼠腦出血腦水腫模型復(fù)制成功，發(fā)生細(xì)胞凋亡；聯(lián)合治療組中的凋亡細(xì)胞數(shù)及腦組織水含量低于腦出血組，說(shuō)明腦出血后給予硝普鈉與尼莫地平可有效緩解腦出血損傷，減少細(xì)胞凋亡。免疫組織化學(xué)檢測(cè)PAR1蛋白含量可知，腦出血后PAR1的含量上升，調(diào)控腦組織血流量及水腫的變化；同時(shí)發(fā)現(xiàn)，硝普鈉與尼莫地平的聯(lián)合使用可有效降低PAR1蛋白含量，有效作用于凝血酶受體來(lái)緩解腦出血損傷。

綜上所述，硝普鈉與尼莫地平可以通過(guò)調(diào)節(jié)PAR1產(chǎn)生抗細(xì)胞凋亡作用，降低大腦血腫及改善神經(jīng)損傷，這對(duì)于臨床治療腦出血水腫、緩解神經(jīng)元損傷具有重要的意義。

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Efficacy of nitroprusside and nimodipine in treatment of cerebral hemorrhage in rats and its correlation with thrombin receptor-1 expression

Yan-li Zhou,Qiong-fang Nie,Xiao-lan Wu
(Department of Neurology,Wuhan University of Technology Hospital,Wuhan,Hubei 430010,China)

R743.34

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.15.006

1005-8982（2017）15-0029-05

2017-01-03

吳曉蘭，E-mail：76767508@qq.com