吳建慧,蘭 鳳,張 靜,牛 喆,王 玲

(東北林業(yè)大學園林學院，黑龍江 哈爾濱 150040)

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重金屬鉛對絹毛委陵菜生理特性和葉片超微結(jié)構(gòu)的影響

吳建慧,蘭 鳳,張 靜,牛 喆,王 玲

(東北林業(yè)大學園林學院，黑龍江 哈爾濱 150040)

以絹毛委陵菜(Potentillasericea)為試驗材料，采用盆栽試驗方法，對不同濃度的鉛脅迫下植物的葉片超微結(jié)構(gòu)和生理特性進行了測定分析。結(jié)果表明，絹毛委陵菜在受到鉛脅迫時，葉綠素含量隨著時間的延長，濃度較低的處理組(<600 mg·kg-1)呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，濃度較高的處理組(>600 mg·kg-1)呈現(xiàn)下降趨勢；葉片可溶性蛋白的含量隨著處理濃度及時間的增加不斷下降；葉片丙二醛的含量與脯氨酸含量隨處理濃度和時間的增加顯著上升(P<0.05)；超氧化物歧化酶活性隨著濃度的增加以及時間的延長，呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。隨著鉛脅迫的加強，鉛對其幼苗的毒害作用增加。高濃度(2 000 mg·kg-1)下，部分細胞膜消失，葉綠體雙層膜系統(tǒng)遭到破壞，基粒片層溶解，線粒體呈空泡化，嵴消失。由此可見，絹毛委陵菜對鉛的耐受范圍在600 mg·kg-1以下。

重金屬；鉛；絹毛委陵菜；耐受范圍；超微結(jié)構(gòu)；生理指標

近年來隨著工業(yè)化進程的不斷加快，重金屬污染成為全球矚目的環(huán)境問題之一，并逐漸威脅到社會發(fā)展乃至人類的健康?，F(xiàn)階段重金屬污染已成為環(huán)境科學內(nèi)普遍關(guān)注的重大問題[1]。在重金屬污染中由于鉛(Pb)的污染面積最廣，且鉛進入到土壤中難以消除，并對植物的生長發(fā)育產(chǎn)生了一定的影響。對人體的危害主要表現(xiàn)在影響中樞神經(jīng)導致大腦的病變、兒童發(fā)育遲緩大腦遲鈍[2]。為降低鉛污染物質(zhì)的危害，許多學者試圖利用各種植物的特殊功能來凈化和改良受污染的土壤[3]。

絹毛委陵菜(Potentillasericea)是一種具有觀賞價值的野生地被植物，其栽培管理簡單，有較高的園林應用價值。但目前對絹毛委陵菜的研究僅局限于引種馴化、干旱脅迫[4]等方面。系統(tǒng)地研究其抗金屬性或有著富集重金屬的能力對污染區(qū)域地被綠化有重要意義[5]。為此，本研究以絹毛委陵菜為材料，通過測定其葉片超顯微結(jié)構(gòu),測定葉綠素、可溶性蛋白、丙二醛、脯氨酸的含量以及超氧化物歧化酶的活性，研究不同濃度的鉛脅迫對絹毛委陵菜生理特性和葉片超微結(jié)構(gòu)的影響，初步判定其適宜生存的重金屬鉛的耐受范圍，以期為選擇耐金屬污染植株提供理論依據(jù)，擴大地被植物在園林中的應用范圍。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

絹毛委陵菜多年生幼苗來源于2015年6月于東北林業(yè)大學苗圃。

1.2 試驗土壤

試驗所用土壤為黑龍江省哈爾濱市花卉市場所購買的草炭土，該土壤pH 6.565，有機質(zhì)含量為4.967%，有效磷含量為23.030 mg·kg-1，速效鉀含量為31.334 mg·kg-1，銨態(tài)氮含量為47.256 mg·kg-1，硝態(tài)氮含量為26.425 mg·kg-1，全鉛 (Pb)含量為22.170 mg·kg-1，全鎘(Cd)含量為0.218 mg·kg-1，重金屬汞(Hg)含量為0.044 mg·kg-1，砷(As)含量為8.295 mg·kg-1，鉻(Cr)含量為39.940 mg·kg-1，由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院測定。

1.3 試驗方法

2015年6月于東北林業(yè)大學苗圃試驗基地選取生長一致、發(fā)育正常的絹毛委陵菜多年生幼苗進行盆栽試驗，花盆高(106 mm)×直徑(120 mm), 每盆定植3株苗，裝土0.25 kg(干質(zhì)量)。Pb以Pb(NO3)2的形式加入，根據(jù)國家土壤環(huán)境質(zhì)量標準(GB15618-1995)進行Pb濃度梯度的設計。本研究設置6個Pb脅迫處理，濃度分別為0(對照)、300、600、1 000、1 500和2 000 mg·kg-1(以含Pb2+量計)。每個處理3次重復。采用根外澆灌的方法，每隔10 d測定一次生理指標。試驗周期為50 d。

1.4 透射電鏡觀察葉片超顯微結(jié)構(gòu)樣品的制備程序

處理20 d后取0(對照)、300、600、2 000 mg·kg-1處理組的絹毛委陵菜相同部位的葉片，切取3 cm×2 cm的矩形小塊，用濃度為3%戊二酸溶液固定，在pH 6.8的磷酸緩沖液中漂洗，于1%的鋨酸溶液中固定，然后再次用pH 6.8的磷酸緩沖液漂洗；經(jīng)乙醇脫水后，于丙酮中過渡，在環(huán)氧樹脂812進行滲透與包埋。LKB-5型超薄切片機切片；醋酸雙氧鈾和梓檬酸鉛雙染；釆用H7650型透射電子顯微鏡對材料進行觀察并進行照相。

1.5 生理指標測定方法

于處理后的10、20、30、40、50 d取樣，測定不同脅迫濃度下的生理指標。葉綠素含量的測定按照李合生[6]生理試驗方法；蛋白質(zhì)含量的測定參照考馬斯亮藍G-250的染色方法[6]；脯氨酸含量采用茚三酮顯色法[7]；采用硫代巴比妥酸(TBA)紫外分光光度法[6]測定丙二醛(MDA)含量；超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍四唑(NBT)光化還原法[6]測定。

1.6 數(shù)據(jù)處理

在Excel 2003軟件中對數(shù)據(jù)進行整理。利用SPSS 13.0軟件進行顯著性分析，處理結(jié)果用平均值±標準誤表示，對處理結(jié)果進行單因素方差分析，采用Duncan’s法進行多重比較。顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 鉛脅迫對絹毛委陵菜葉片超微結(jié)構(gòu)的影響

未受到Pb2+脅迫時，絹毛委陵菜細胞結(jié)構(gòu)完整清晰，細胞壁完整，細胞壁與細胞膜緊密結(jié)合、膜質(zhì)平滑(圖1)；細胞核位于細胞中央，橫切面呈圓形或近似圓形，雙層膜完整，核質(zhì)均勻，可見有核透明區(qū)域，核仁完整，清晰可見。葉綠體為橢圓形或近橢圓形，數(shù)量很多，并主要沿植物細胞邊緣均勻排列。類囊體的體腔空間小且扁平，類囊體之間互相連接緊密，排列有序，構(gòu)成了連續(xù)的膜系統(tǒng)。線粒體的形狀多呈規(guī)則圓形或近圓形，具有完整的雙層膜。絹毛委陵菜葉片中線粒體數(shù)量很少，但在葉綠體交接處分布較多，線粒體內(nèi)嵴小而少、基質(zhì)濃，多數(shù)線粒體嵴清晰可見、發(fā)育良好。

當脅迫濃度為300 mg·kg-1時，細胞壁與細胞膜較對照組變化不大，但細胞核出現(xiàn)了微小的變形，體積縮小，葉綠體呈現(xiàn)囊腫化，并且向細胞中間拱起、移動，葉綠體的片層結(jié)構(gòu)排列松散，但層次較清晰。葉綠體中的嗜鋨程度增加，出現(xiàn)體積較大的淀粉粒(圖1)；線粒體數(shù)量增多且線粒體的嵴的直徑變大，排列狀態(tài)松散化。在脅迫濃度為600 mg·kg-1時，細胞出現(xiàn)輕微變形，細胞壁與細胞膜邊界出現(xiàn)大量黑色物質(zhì)，可能是Pb2+在細胞中積累的結(jié)果，研究發(fā)現(xiàn)，細胞中的囊泡狀物質(zhì)中有重金屬鉛的積累，也是細胞阻止重金屬對葉綠體、線粒體等細胞器的傷害所啟動的阻隔效應；此時，葉綠體中出現(xiàn)大量淀粉粒，且體積較大，甚至占據(jù)了葉綠體的大部分空間，葉綠體的嗜鋨程度增加，數(shù)量劇增，體積較大，基粒片層體積膨脹甚至溶解破裂、基粒垛疊程度下降，片層也出現(xiàn)波浪狀不整齊排列方式，葉綠體中出現(xiàn)體積巨大的淀粉粒，且嗜鋨顆粒數(shù)量上顯著增多，體積變大，隨著濃度的增大，葉綠體的顏色就會越深，這是重金屬鉛在細胞內(nèi)沉淀的結(jié)果；線粒體雙層膜出現(xiàn)部分溶解，內(nèi)嵴數(shù)量減少，嵴突變形受到破壞，部分線粒體內(nèi)外膜模糊，線粒體基質(zhì)變淺。當Pb2+濃度為2 000 mg·kg-1時，絹毛委陵菜的葉片細胞受到嚴重損傷，細胞整體處于雜亂狀態(tài)，且細胞空泡化現(xiàn)象嚴重，各細胞器均出現(xiàn)了崩潰甚至是消失的狀態(tài)(圖2、3)。

細胞壁變化不大，細胞膜部分消失；葉綠體雙層膜系統(tǒng)遭到破壞，甚至膜消失，內(nèi)含物流出，片層以及基粒排列出現(xiàn)松散、紊亂無序的狀態(tài)，并有黑色沉淀，葉綠體解體(圖2)；線粒體完全解體，呈空泡化狀態(tài)(圖3)，嵴消失不見，內(nèi)含物流出，細胞液變得稀疏。由此可知，重金屬鉛脅迫對絹毛委陵菜葉片中的各細胞器損傷程度中葉綠體的耐受性是最強的，處理后細胞壁邊緣有大量黑色沉淀。這說明細胞膜可以阻止部分Pb2+進入細胞內(nèi)部。

2.2 鉛脅迫對絹毛委陵菜葉片生理特性的影響

2.2.1 鉛脅迫對絹毛委陵菜葉片葉綠素含量的影響 300和600 mg·kg-1Pb2+處理的葉綠素含量在處理20 d時有較小幅度的增加，分別比對照上升了1.86%和0.87%，之后隨處理時間的延長而減少(圖4)；其它處理則隨處理時間的延長均呈下降趨勢。在脅迫處理10-40 d中，5個鉛脅迫處理的葉綠素含量均顯著低于對照(P<0.05)。處理30 d時，各處理組的葉綠素含量開始降低，其中2 000 mg·kg-1處理下降幅度最大，后期再繼續(xù)降低直至干枯、褐化、死亡。

圖1 鉛脅迫對葉片超微結(jié)構(gòu)的影響Fig. 1 Effect of lead stress on ultrastructure in leaves

圖2 鉛脅迫對葉片葉綠體結(jié)構(gòu)的影響Fig. 2 Effect of lead stress on chloroplasts in leaves

圖3 鉛脅迫對葉片線粒體結(jié)構(gòu)的影響Fig. 3 Effect of lead stress on mitochondria in leaves

2.2.2 鉛脅迫對絹毛委陵菜葉片可溶性蛋白含量的影響 在處理10-20 d時，各個處理組可溶性蛋白的含量均處于上升的趨勢(圖4)。在處理20 d時，各處理組之間差異不顯著(P>0.05)。在處理30-40 d時，處理組300 mg·kg-1和600 mg·kg-1的變化趨勢幾乎相同，且差異不顯著(P>0.05)。在處理50 d時，300、600、1 000、1 500和2 000 mg·kg-1處理組分別較對照組下降了12.09%、9.03%、13.68%、29.11%、55.91%。說明低濃度(<600 mg·kg-1)促進植株生長，高濃度則抑制生長。

2.2.3 鉛脅迫對絹毛委陵菜葉片脯氨酸含量的影響 在處理10-40 d時，各處理組脯氨酸的含量均出現(xiàn)了急劇上升(圖5)。其中處理組2 000 mg·kg-1上升幅度最顯著(P<0.05)；在處理20 d時，300 mg·kg-1與對照組差異不顯著(P>0.05)，600與1 000 mg·kg-1差異不顯著(P>0.05)；在處理50 d，除2 000 mg·g-1下降外，其它各處理組均有所增加。由此可見，在一定的濃度范圍內(nèi)，相對較低濃度的鉛脅迫可誘導絹毛委陵菜葉片脯氨酸含量的增加，減小膜脂過氧化程度，提高植物抵抗外界脅迫的能力。

2.2.4 鉛脅迫對絹毛委陵菜葉片丙二醛含量的影響 在處理10 d時，濃度為300、600 mg·kg-1處理的丙二醛含量與對照組的含量幾乎相同(圖6)。但1 000、1 500、2 000 mg·kg-1處理組都較對照組顯著下降(P<0.05)，依次較對照下降了19.65%、27.68%、42.20%；到處理20 d時，各處理組丙二醛含量呈明顯上升趨勢，尤其是處理濃度較高的3個處理組，上升趨勢十分明顯，在處理20-30d時，分別較對照上升了3.21%、12.49%、14.31%；在處理50 d時，各處理組的丙二醛含量均比對照組有顯著上升，處理組中的濃度由低到高依次較對照上升了4.35%、15.84%、22.57%、23.73%、44.52%。這說明低濃度的處理組對植物影響不大，與對照組相比僅僅呈現(xiàn)較小的波動，而濃度高的處理組則對植物傷害較大，呈現(xiàn)較大范圍的上升。

圖4 鉛對絹毛委陵菜葉片葉綠素和可溶性蛋白含量的影響Fig. 4 Effect of lead stress on chlorophyll and soluble protein content in leaves of P. sericea

注：不同小寫字母表示同一時間不同處理濃度間顯著差異(P<0.05)。下同。

Note: Different lowercase letters indicate significant difference among different pb concentrations of the same time at the 0.05 level; similarly for the following figures.

圖5 鉛脅迫對絹毛委陵菜葉片脯氨酸、丙二醛含量和SOD活性的影響Fig. 5 Effect of lead stress on PRO amd MDA content in leaves of P. sericea

2.2.5 鉛脅迫對絹毛委陵菜葉片超氧化物歧化酶(SOD)含量的影響 在處理10 d時，300、600、1 000、1 500和2 000 mg·kg-1處理組的SOD活性較對照分別增加了31.07%、48.38%、55.35%、74.64%和88.14%(圖6)。而隨著處理時間的延長，在處理30 d時，2 000 mg·kg-1的處理組出現(xiàn)下降趨勢，但仍高于對照60.68%。在處理40 d時，處理組1 000、1 500、2 000 mg·kg-1中的SOD活性明顯開始下降，但CK、300 mg·kg-1的SOD活性依舊上升，這說明絹毛委陵菜對重金屬鉛有一定的耐受性，在濃度較低時，可以促進SOD活性的上升，而較高濃度的脅迫，超出了植物體內(nèi)一定的耐受限度，SOD的活性受到了抑制。

圖6 鉛脅迫對絹毛委陵菜葉片SOD活性的影響Fig. 6 Effect of lead stress on SOD activity in leaves of P. sericea

3 討論與結(jié)論

植物葉片作為外界環(huán)境中與空氣接觸最多的營養(yǎng)器官，其對生境變化尤其敏感，當外界環(huán)境發(fā)生變化時，其結(jié)構(gòu)也會發(fā)生相應的改變[8-10]。有研究表明，植物在受到重金屬脅迫時都會對其亞顯微結(jié)構(gòu)造成破壞，同時對葉綠體有一定的損傷，進而影響其光合作用。蔣文智[11]的研究表明，經(jīng)過重金屬處理后的植物細胞，類囊體會隨著濃度的加大質(zhì)壁分離，質(zhì)膜出現(xiàn)破損，核膜破裂，與本研究觀察到的現(xiàn)象一致。當細胞壁在受到較大濃度的脅迫時出現(xiàn)波浪狀的變形，且在細胞膜處的一些囊狀的小泡包裹著黑色的物質(zhì)，這是植物的內(nèi)吞作用。雖然也有研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過重金屬脅迫后植物葉片細胞中的細胞壁會出現(xiàn)空洞，這可能與重金屬的種類以及植物材料有關(guān)[12]。本研究中葉綠體在重金屬脅迫初期，體積膨大，甚至有的由橢圓形腫脹為圓形?？赡苁侵亟饘龠M入細胞后，引起膨壓增大，導致類囊體和葉綠體膨脹成圓球形的原因。

葉綠素質(zhì)量濃度是衡量葉片衰老的重要生理指標。研究表明，重金屬脅迫下葉綠素質(zhì)量濃度降低，這可能是由于葉綠素分子中的鎂離子被多種重金屬元素所取代或破壞了葉綠素合成過程所致[13]。葉綠素含量降低的程度表示了植物受傷害的程度，研究者們[14-16]發(fā)現(xiàn)草地早熟禾(Poapratensis)葉片的葉綠素含量隨鉛濃度的增大呈現(xiàn)先增后減的趨勢，本研究中表現(xiàn)為低濃度的鉛會刺激植物的生長，高濃度的鉛濃度會抑制葉綠素酶的活性增加，導致葉綠素的分解，或者是導致葉片細胞內(nèi)的細胞器的破壞，使光合能力下降。蛋白質(zhì)在植物生長中起著重要作用，也是表征植物生理生化特性的指標之一[17-18]。研究者們[19-21]對狼尾草(Pennisetumorientale)的研究表明，重金屬鉛的脅迫下，可溶性蛋白的含量在輕度污染下質(zhì)量濃度下降不顯著；中度、重度污染下質(zhì)量濃度顯著降低。本研究中，可溶性蛋白的含量也基本隨濃度的升高以及時間的延長不斷下降。植物在逆境脅迫或衰老過程中，細胞內(nèi)活性氧積累并造成膜脂過氧化，使膜系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能受到損傷，造成植物細胞傷害。重金屬可加劇植物體內(nèi)膜脂過氧化作用[22],使細胞內(nèi)的自由基代謝的平衡狀態(tài)被打破而產(chǎn)生丙二醛。本研究中的丙二醛的含量隨處理濃度和時間的增加，呈現(xiàn)顯著上升的趨勢，這與對蓬萊蕉(Monsteradeliciosa)[23]的研究結(jié)果一致。說明高濃度和長時間的鉛脅迫對植物的損傷程度較大。葉片脯氨酸含量總體呈現(xiàn)上升的趨勢[24]，膜透性增大，且各個處理組整體的變化情況相同。在重金屬脅迫下，植物緩解活性氧危害的主要方式是通過調(diào)節(jié)抗氧化酶的活性，因此抗氧化酶的活性是決定植物細胞對重金屬脅迫抗性響應的重要因素。輕度脅迫下，SOD活性先升高，呈現(xiàn)出一定的抗性，隨著濃度的增大逐漸降低[25-26]。

綜上所述，隨脅迫濃度的增大絹毛委陵菜葉片細胞中葉綠體膜系統(tǒng)崩潰。葉綠素含量、可溶性蛋白含量呈下降趨勢；脯氨酸的含量呈上升趨勢，超氧化物歧化酶活性先升高后降低。研究表明隨著鉛濃度的提高，鉛對絹毛委陵菜幼苗的毒害作用增加。低濃度鉛脅迫(<600 mg·kg-1)下植株能夠保持很長時間的正常生長，葉綠體超微結(jié)構(gòu)破壞不嚴重；高濃度(>600 mg·kg-1)則會引起植株葉片干枯至死亡。由此推測絹毛委陵菜適宜生存的Pb2+耐受范圍為600 mg·kg-1以下。

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(責任編輯 茍燕妮)

Effect of Pb stress on ultrastructure and physiological characteristics ofPotentillasericea

Wu Jian-hui, Lan Feng, Zhang Jing, Niu Zhe, Wang Ling
(College of landscape Architecture, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China)

Potentillasericeawas employed as an experimental material in a pot experiment to study leaf ultrastructure and physiological characteristics under different gradients of lead stress. The results showed that the chlorophyll content under low concentration (<600 mg·kg-1) of Pb stress first increased, and then decreased, with the increase in duration of treatment time, whereas high concentrations (>600 mg·kg-1) of Pb stress showed a declining trend. The content of soluble protein was decreased. The MDA and free proline content all significantly increased. SOD activities first decreased, and then increased. With the increase of stress, the toxicity of lead toP.sericeaseedlings increased. Under high Pb concentration (2 000 mg·kg-1), part of the cell membrane disappeared, the double membrane system of chloroplasts was destroyed, granum lamella was dissolved, mitochondrial vacuolization was serious, and the crest disappeared. These results showed thatP.sericeais tolerant to lead up to concentrations of 600 mg·kg-1.

heavy metals; lead;Potentillasericea; tolerance range; ultrastructure; physiological indexes

Wang Ling E-mail:wanglinghlj@126.com

2016-09-29 接受日期：2017-01-03

中央高?；究蒲袠I(yè)務費專項資金(2572016EAJ6)；黑龍江省科學基金(C201342)

吳建慧(1966-)，女，黑龍江哈爾濱人，副教授，博士，主要從事植物生理與分子生物學研究。Email:wujianhui660915@126.com

王玲(1972-)，女，黑龍江加格達奇人，教授，博士，主要從事園林植物與觀賞園藝研究。E-mail:wanglinghlj@126.com

10.11829/j.issn.1001-0629.2016-0506

Q945.79

A

1001-0629(2017)07-1383-07

吳建慧,蘭鳳,張靜,牛喆,王玲.重金屬鉛對絹毛委陵菜生理特性和葉片超微結(jié)構(gòu)的影響.草業(yè)科學,2017,34(7)：1383-1389.

Wu J H,Lan F,Zhang J,Niu Z,Wang L.Effect of Pb stress on ultrastructure and physiological characteristics ofPotentillasericea.Pratacultural Science，2017,34(7)：1383-1389.