張小芳，張海燕，王永吉，魏蘭芳，姬廣海*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)科基礎(chǔ)實驗教學(xué)中心，云南 昆明 650201)

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魔芋軟腐病菌血清學(xué)檢測方法的建立

張小芳1，張海燕1，王永吉1，魏蘭芳2，姬廣海1*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)科基礎(chǔ)實驗教學(xué)中心，云南 昆明 650201)

【目的】魔芋軟腐病是魔芋生產(chǎn)中的一個重要細(xì)菌性病害，嚴(yán)重威脅著魔芋產(chǎn)量?！痉椒ā勘緦嶒灁M利用血清學(xué)技術(shù)建立快速檢測魔芋細(xì)菌性軟腐病菌的方法?！窘Y(jié)果】采用棋盤滴定法確定抗原和抗血清的最適工作濃度分別為106CFU/mL和1∶10000；病原菌檢測靈敏度為103CFU/mL；抗血清與其它細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的交叉反應(yīng)結(jié)果均呈陰性，結(jié)果表明該方法具有較高的特異性。將該方法檢測了24份魔芋種球、病土和帶病植株，檢出率高達(dá)91.67 %?！窘Y(jié)論】該技術(shù)可以有效的檢測魔芋軟腐病原菌胡蘿卜軟腐果膠桿菌(Pectobacteriumcarotovorasubsp.carotovora，p.c.c.)，為生產(chǎn)上魔芋種球快速檢測軟腐病菌提供了方法。

魔芋軟腐??；細(xì)菌性病害；血清學(xué)檢測

魔芋為天南星科(Araceae)魔芋屬(AmorphophallusBlume) 多年生草本植物的塊莖。目前已知魔芋有163個種，可食用魔芋有20種，分為葡甘聚糖型、中間型、淀粉型[1]。魔芋中的葡甘聚糖(Konjac Glucoms mannan，KGM)是一種優(yōu)良的低熱量、低脂肪、纖維素的水溶性膳食纖維，對營養(yǎng)平衡有重要調(diào)節(jié)作用，還具有減肥、潤腸通便、調(diào)節(jié)膽固醇代謝的功能調(diào)節(jié)作用[2-3]。中國魔芋栽培已有兩千年的歷史[4]。2010年中國魔芋種植面積近10萬 hm2，中國取代日本成為世界魔芋原料生產(chǎn)與供給中心(占全球的60 %)[5]。【研究意義】魔芋軟腐病是一種分布廣、危害重和防治困難的世界性病害。中國魔芋主要分布于南方各省山地丘陵地區(qū)[6]，云南是魔芋起源中心之一[7]。魔芋以球莖作為繁殖器官，種球帶菌是初侵染源[8]。魔芋軟腐病僅云南省的發(fā)病率即達(dá)30 %～50 %[9]。魔芋軟腐病是主要由胡蘿卜軟腐膠桿菌(Pectobacteriumcarotovorasubsp.carotovora，p.c.c.)引起的細(xì)菌性病害[10]。軟腐病菌可從幼嫩組織(根、芽鞘等)、傷口侵入，傷口是最為主要的侵入途徑[11]。整個生育期內(nèi)均會感病，對魔芋產(chǎn)量影響最嚴(yán)重，是目前魔芋種植老區(qū)發(fā)生和危害較為嚴(yán)重的病害之一。魔芋連作田軟腐病病害發(fā)生率比非連作田平均高出35 %～50 %，造成減產(chǎn)達(dá)50 % ～ 80 %，有的甚至絕收[12]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)(ELISA) 是目前植物細(xì)菌性病害和病毒病害診斷上應(yīng)用比較廣的一種免疫學(xué)方法[13]。以抗原抗體相互識別為基礎(chǔ)的免疫快速檢測方法是檢測研究領(lǐng)域的熱點。例如食物中的黃曲霉毒素和無花果中的赭曲霉毒素等的免疫檢測研究也多見報道[14-15]?！颈狙芯康那腥朦c】在實際病害診斷及病原物檢測方法中，免疫學(xué)方法無論在實用性和應(yīng)用范圍等方面均優(yōu)于分子檢測技術(shù)，并且許多免疫學(xué)技術(shù)已商業(yè)化，分子檢測技術(shù)目前還局限在實驗室研究的范圍；此外，目前未有報道建立魔芋軟腐病的血清學(xué)方法。【擬解決的關(guān)鍵問題】為此，本實驗擬利用血清學(xué)技術(shù)建立魔芋軟腐病菌的快速檢測方法，為生產(chǎn)上檢測該病害提供一種快速簡易的操作方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 菌株及來源 指示病原菌：胡蘿卜軟腐果膠桿菌(Pectobacterium.carotovora.subsp.carotovora)強(qiáng)致病力菌株MY9，弱致病力菌株MY4、MY6。其它參試菌株：煙草野火病菌(Pseudomonassyringaepv.tabaci)CX10；水稻白葉枯病菌(Xanthomonasoryzaepv.oryzae)53，YN11；大白菜軟腐病菌(Erwiniacarotovorasubsp.carotovora)EW；馬蹄蓮軟腐菌(E.carotovora.subsp.carotovora)WM11；三七腐霉病菌(Fusariumsolani)SQGF-1，(CyIindrocarpondestructans)SQGF-4；辣椒疫霉菌(PhytophthoracapsiciLeonian)LJYM-1；煙草黑脛病菌(Phytophtoraparasiticavar．nicotianaeTucker)Phy-1均由本實驗室提供(表1)。

表1 檢測樣品及來源

1.1.2 實驗動物 健康家兔2只，雄性，體重2.0～2.5 kg，無免疫史，由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)科基礎(chǔ)實驗教學(xué)中心提供。

1.1.3 魔芋樣品及來源 所用魔芋采自云南省富源縣魔芋研究所竹園實驗站魔芋種植基地。溫室實驗所選魔芋種球由云南省富源縣魔芋研究所提供。

1.1.4 主要培養(yǎng)基和緩沖液 肉汁凍培養(yǎng)基(NA)：蔗糖10 g，瓊脂17～20 g，蛋白胨5 g，牛肉浸膏3 g，酵母浸膏1 g，蒸餾水1000 mL，pH值調(diào)至6.8～7.0；KB培養(yǎng)基：蛋白胨20 g，甘油10 mL，磷酸氫二鉀 1.5 g，七水硫酸鎂 1.5 g，水1000 mL，pH值調(diào)至6.8～7.0；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯200 g, 葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL，自然pH; BUG培養(yǎng)基：57 g BUG瓊脂培養(yǎng)基，1000 mL蒸餾水，pH值7.3 ±0.1; 抗利福平Rif的NA培養(yǎng)基：NA培養(yǎng)基加入相應(yīng)濃度的Rif。

將內(nèi)生拮抗細(xì)菌、病原細(xì)菌接種到NB培養(yǎng)液中，28 ℃恒溫?fù)u床150 r/min培養(yǎng)18～21 h，即得發(fā)酵液。

0.01 mol/L pH 7.4 磷酸緩沖液(PBS) ：NaCl 8.0 g、Na2HPO4·12H2O 2.9 g、KH2PO40.2 g、KCl 0.2 g，加蒸餾水至1000 mL；1×PBST 洗滌液：Tween 20 0.5 mL，加0.01 mol/L pH 7. 4 PBS 至1000 mL; 0.05 mol/L pH 9.6包被緩沖液(coating buffer，CB)：Na2CO31.59 g、NaHCO32.93 g加蒸餾水至1000 mL。

1.2 抗血清的制備過程

1.2.1 魔芋軟腐病菌抗原的制備 將魔芋軟腐病菌MY9接種于營養(yǎng)瓊脂平板培養(yǎng)基NA上，28 ℃培養(yǎng)24～36 h，無菌生理鹽水洗脫、4000 r/min離心10 min，去上清并用滅菌生理鹽水洗滌3次后，懸浮液裝入透析袋中，加入戊二醛溶液(終濃度為2 %)固定過夜，在蒸餾水中透析48～72 h(4 ℃)，此間更換3次蒸餾水，用血球計數(shù)板計菌數(shù)，配制出濃度約為1×108CFU/mL的菌懸液，4 ℃冰箱保存、備用。

實驗教學(xué)和理論教學(xué)應(yīng)該是相輔相成的。但實際上，由于教師更注重理論知識的教授，使得實驗教學(xué)成為理論教學(xué)的輔助手段,導(dǎo)致了實驗教學(xué)相對薄弱。

1.2.2 免疫血清的制備 選擇2只健康，體重2 kg左右的雄兔。第一次注射采用皮下多點注射；第二次采用肌肉注射；第三、四次采用靜脈注射，每次均為1 mL。免疫間隔期為1周，最后一次免疫4 d后測效價，當(dāng)效價達(dá)到2560～5120時，從心臟采血分離抗血清。

1.2.3 抗原和抗體工作濃度的確定 采用棋盤滴定的方法，步驟如下：將108CFU/mL濃度的魔芋軟腐病菌株從1∶10至1∶10000作系列稀釋，每個稀釋度包被2孔，100 L/孔，60 ℃烘干；將陽性血清按1∶5000、1∶10000、1∶15000、1∶20000、1∶25000進(jìn)行系列稀釋按與抗原濃度變化垂直的方向加入各板孔，100 μl/孔，37 ℃ 1 h；酶標(biāo)抗體作1∶10000稀釋，進(jìn)行間接ELISA測定。以能產(chǎn)生OD450nm值1.0左右，且P/N值最大的抗原抗體稀釋度為最佳稀釋度；設(shè)立空白對照，加樣順序為：包被抗原-封閉液-底物。

P/N=(CP-C)/(Cn-C)

式中：Cp為陽性對照OD450nm值；Cn為陰性對照OD450nm值；C為空白對照OD450nm值。

1.2.4 特異性實驗 交叉實驗：用濃度均為108CFU/mL的魔芋軟腐病菌(MY9)、芽孢桿菌(M2)、水稻白葉枯病菌(YN7)、水稻細(xì)條病菌(Ym10)、紅掌疫病菌(Xad-7)、煙草野火病菌(YH-1)、煙草青枯病菌(QK-1)、抗生素溶桿菌(13-1)、海棠葉斑病菌(HT-1)包被酶標(biāo)反應(yīng)板，血清采用最適稀釋度，檢測是否有交叉反應(yīng)情況。

1.2.5 免疫血清敏感性實驗 將濃度108CFU/mL的魔芋軟腐病菌菌株從1∶10至1∶106做系列稀釋，每個稀釋度包被2孔(100 μl/孔)，60 ℃烘干，將血清稀釋到最適工作濃度，以確定最小的抗原檢測濃度。以O(shè)D450nm值接近1.0，P/N值≥2.1判為陽性。

1.2.6 樣品處理 稱取不同地方采集的樣品5 g放入研缽中，加入0.01 mol/L PBS 20 mL研磨，靜置3～4 h，備用。

1.2.7 間接Elisa操作步驟 包被菌液或樣品，200 μl/孔，4 ℃過夜；0.01 mol/L PBST 洗板5 次，5 min/次；0.5 %的BSA (CB配制)封阻，200 μl/孔，37 ℃2 h；0.01 mol/L PBST洗板5次，5 min/次；加入一抗 (用0.01 mol/L PBS稀釋10 000倍)，200 μl/孔，37 ℃ 2 h；0.01 mol/L PBST洗板5 次，5 min/次；加入酶標(biāo)二抗(用0.01 mol/L PBS稀釋20 000倍)，200 μl/孔，37 ℃孵育2 h 或4 ℃過夜；0.01 mol/L PBST 洗板5次，5 min/次；加入TMB 底物反應(yīng)液，100 μl/孔，37 ℃孵育10～20 min；2 mol/LH2SO4終止反應(yīng)，50 μl/孔，在酶聯(lián)免疫檢測儀上讀OD450nm值，P/N≥ 2.1判為陽性。

2 結(jié)果與分析

2.1 魔芋軟腐病菌ELISA檢測體系的建立

2.1.1 間接ELISA抗原和抗血清最適工作濃度的確定 不同稀釋濃度包被抗原與1∶20 000稀釋的陽性血清作用所得的OD450nm值如表2所示，由于抗原在作1∶1000稀釋時OD450nm值接近1.0，且P/N值最大，為56.125，所以確定抗原的最適包被濃度為106CFU/mL(表2)。

表2 抗原最適包被濃度的確定

注：“+”表示陽性血清，“-”表示陰性血清，下同。

Note: ‘+’:Positive,‘-’:Negative. The same as below.

如表3所示，固定包被抗原濃度1×106CFU/mL，當(dāng)免疫血清作1∶10 000稀釋時，陽性血清OD450nm值接近1.0，且P/N值最大，為44.767。因此檢測用免疫血清的最適稀釋度確定為1∶104。

2.1.2 抗血清特異性測定 檢測魔芋細(xì)菌性軟腐病(MY9)、芽孢桿菌(M2)、水稻白葉枯病菌(YN7)、水稻條斑病菌(Ym10)、紅掌細(xì)菌性疫病菌(Xad-7)、煙草野火病菌(YH-1)、煙草青枯病菌(QK-1)、抗生素溶桿菌(13-1)、海棠細(xì)菌性葉斑病菌(HT-1)與魔芋軟腐病菌陽性血清交叉反應(yīng)情況，結(jié)果顯示只有魔芋軟腐病菌呈陽性，其余細(xì)菌均呈陰性(表4)。

2.1.3 抗血清的靈敏度測定 以最適稀釋度血清(1∶10 000)檢測抗原靈敏度，從表5可見，用間接ELISA測得免疫血清能檢到的軟腐病菌菌株(MY9)最低濃度為103CFU/mL。

2.2 樣品檢測

由表6可以看出，在所有樣品中健康植株(陰性對照)的葉片、莖部、種球和根圍均為陰性反應(yīng)，而帶病煙植株，不論是取自田間還是溫室，其葉片、莖部、種球都呈現(xiàn)陽性反應(yīng)，田間采集的根圍土有2份樣品有陽性反應(yīng)，分別來自富源縣中安鎮(zhèn)回龍村和墨紅鎮(zhèn)江難村，由此可見，該方法可以有效的檢測出魔芋軟腐病原菌，且檢測效率比較高。

3 討 論

魔芋軟腐病在全世界范圍內(nèi)發(fā)病都很嚴(yán)重，在大田生長期和儲藏期周年發(fā)生危害，魔芋植株感染軟腐病后葉片或球莖變軟，發(fā)黑腐爛，并有酒臭味，從病部流出帶菌汁液又侵染新的植株，使之發(fā)病，嚴(yán)重時引起成片倒苗。

表4 免疫血清交叉實驗結(jié)果

表5 免疫血清敏感性試驗結(jié)果

注：陰性對照值為0.072，空白對照值為0.058。

Note: Negative contral value:0.072；Blank contral value:0.0058.

表6 魔芋軟腐病樣品的間接ELISA檢測結(jié)果

在植物病害檢測中，傳統(tǒng)的檢測方法一般是在植物出現(xiàn)癥狀后，通過觀察其發(fā)病癥狀，或?qū)Σ≡镞M(jìn)行分離、鑒定，過程較為繁瑣，而且有一些病原物存在分離鑒定上的困難，特別是專性寄生菌難以人工離體培養(yǎng)，另外病原物毒性類型鑒定費(fèi)時且毒性表達(dá)受環(huán)境條件的影響很大，使得快速而精確地檢測病原物的毒性類型及田間的群體動態(tài)的難度增加，也給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的防治延誤時機(jī)。

現(xiàn)有的軟腐病菌檢測技術(shù)都集中在分子檢測水平，鮮有血清學(xué)檢測魔芋軟腐病菌的報道。李曉紅[16]利用ITS-PCR擴(kuò)增對魔芋軟腐病病原菌進(jìn)行特異性檢測。劉鵬等[17]通過菊歐文氏菌的ITS序列設(shè)計特異性引物，可以快速準(zhǔn)確地檢測并鑒定菊歐文氏菌。雖然分子檢測技術(shù)專一性和靈敏度相對與其他檢測技術(shù)較好，但是目前還局限在實驗室研究的范圍，而且對操作人員有較高要求同時成本也比較高，不適合田間快速檢測使用。本研究利用免疫學(xué)方法，建立了快速、有效檢測魔芋軟腐病原菌的間接ELISA方法，其最低可檢測濃度與普通PCR相同，都達(dá)到了103cfu/mL。操作簡單，成本較低，適合商業(yè)化生產(chǎn)，在實際病害診斷及病原物檢測中，可以大面積推廣應(yīng)用。

4 結(jié) 論

利用致病力強(qiáng)的菌株My9作為抗原，制備了魔芋細(xì)菌性軟腐病菌特異性抗血清，采用棋盤滴定法確定最佳濃度分別為106CFU/mL和1∶10 000；病原菌檢測靈敏度為103CFU/mL；抗血清與其它細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)菌株的交叉反應(yīng)結(jié)果均呈陰性，將該方法檢測了24份人工和自然發(fā)病后的魔芋種球、病土和帶病植株，檢出率高達(dá)91.67 %，表明該技術(shù)可以有效的檢測魔芋軟腐病原菌胡蘿卜軟腐果膠桿菌(Pectobacteriumcarotovorasubsp.carotovora，p.c.c.)，為生產(chǎn)上魔芋種球快速檢測軟腐病菌提供了方法。

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(責(zé)任編輯 王家銀)

Establishment of Serological Detection Methodagainst Soft Rot Pathogen ofAmorphophalluskonjac

ZHANG Xiao-fang1, ZHANG Hai-yan1, WANG Yong-ji1, WEI Lan-fang2, JI Guang-hai1*

(1.College of Plant Protection, Yunnan Agricultural University, Yunnan Kunming 650201, China; 2.Agricultural Foundation Experiment Teaching Center, Yunnan Agricultural University, Yunnan Kunming 650201, China)

【Objective】The soft rot ofAmorphophalluskonjac(A.konjac) is the major disease affecting the yield ofA.konjac. 【Method】In this study, a method for rapid detection of the soft rot pathogen ofAmorphophalluskonjacwas established by serological technique. 【Result】Using checkerboard titration, the best working concentration of antigen and antiserum were 106CFU/mL and 1∶10000 respectively. The sensitivity of the serum was tested, and the lowestp.c.c. suspension was 103CFU/mL. Cross reactions of antisera with other bacteria were detected, all results were negative. The cross assay indicated that this method had high serological specificity. The method has been used to detect 24 samples, with the detective rate 91.67 %. 【Conclusion】The results indicated that this method can be used to detect the pathogens ofp.c.c.. This is very useful for diagnosing latent infection ofp.c.cof seed tubers in the early stage．

Soft rot pathogen ofAmorphophalluskonjac; Bacterial diseases; Serological detection

1001-4829(2017)7-1576-06

10.16213/j.cnki.scjas.2017.7.019

2015-07-15

國家自然科學(xué)地區(qū)基金(31360002，31460458)

張小芳(1990-)，女，陜西寶雞人，碩士研究生，主要從事植物細(xì)菌病害的研究，E-mail:384952241@qq.com，*為通訊作者：姬廣海，E-mail:jghai001@aliyun.com。

S436.32

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