馬玉翠 王淳 王蔚 吳翠 杜寧 孫文 李慧 巢志茂

摘要：目的 建立救必應(yīng)與其偽品米碎木的HPLC指紋圖譜，進(jìn)行真?zhèn)舞b別。方法 收集各地名為“救必應(yīng)”的藥材，采用HPLC指紋圖譜方法對救必應(yīng)及其偽品米碎木進(jìn)行檢測，采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2004A版》對指紋圖譜進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果 建立了救必應(yīng)和米碎木的HPLC指紋圖譜，方法學(xué)考察符合指紋圖譜技術(shù)要求。救必應(yīng)與其偽品米碎木指紋圖譜輪廓特征明顯不同，救必應(yīng)有31個(gè)共有峰，米碎木有28個(gè)共有峰。主成分分析可將樣品分為2組，聚類分析也可將樣品分為2類。結(jié)論 采用HPLC指紋圖譜及其數(shù)據(jù)分析，可以對救必應(yīng)與其偽品進(jìn)行鑒別，為救必應(yīng)的質(zhì)量評價(jià)提供有效方法。

關(guān)鍵詞：救必應(yīng)；米碎木；高效液相色譜法；指紋圖譜；主成分分析；質(zhì)量控制

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.08.020

中圖分類號：R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）08-0089-04

Identification of Ilicis Rotundae Cortex and Its Adulterant Based on HPLC Fingerprint MA Yu-cui1， WANG Chun1， WANG Wei2， WU Cui1， DU Ning2， SUN Wen1， LI Hui1， CHAO Zhi-mao1 （1. Institute of Chinese Materia Medica， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100700， China； 2. Beijing Center for Physical and Chemical Analysis， Beijing 100094， China）

Abstract： Objective To establish HPLC fingerprints for the identification of Ilicis Rotundae Cortex （Jiubiying）， dried bark of Ilex rotunda Thunb.， and its adulterant， dried bark of Ilex godajam （Colebr.） Wall.. Methods Some samples named “Jiubiying” were collected from some medicine markets and drugstores. The HPLC fingerprints were obtained to detect Jiubiying and Ilex godajam. The software “Similarity Evaluation System of Chromatographic Fingerprints of Traditional Chinese Medicine （2004A edition）” was used to evaluate fingerprints. Results The fingerprints of Jiubiying and Ilex godajam were established. Methodological study met the technical requirements of fingerprints. There were 31 and 28 common peaks in Jiubiying and Ilex godajam， respectively. Jiubiying and Ilex godajam could be classified into two clusters by principal component analysis and hierarchical clustering analysis. Conclusion Jiubiying and Ilex godajam can be identified by HPLC fingerprints. This method can provide an effective method for quality evaluation of Jiubiying.

Key words： Ilicis Rotundae Cortex （Jiubiying）； Ilex godajam （Colebr） Wall.； HPLC； fingerprint； principal component analysis； quality control

冬青科植物鐵冬青Ilex rotunda Thunb.是嶺南地區(qū)多濕熱環(huán)境中生長的喬木，主要分布于廣東、廣西、福建、臺灣、云南等地[1]。其干燥樹皮為中藥救必應(yīng)，功效清熱解毒、利濕止痛，用于暑濕發(fā)熱、咽喉腫痛、濕熱瀉痢、脘腹脹痛、風(fēng)濕痹痛等癥[2]，主要含三萜及其苷類、黃酮類、酚類、鞣質(zhì)類化學(xué)成分，具有降低冠脈流量、抗心律失常、降壓、減慢心率、提高耐缺氧能力、抗腫瘤、抑菌、抗炎、止血等活性，用于

基金項(xiàng)目：國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局行業(yè)科研專項(xiàng)（201210209）

通訊作者：巢志茂，E-mail：chaozhimao@163.com

治療消化系統(tǒng)疾病、心血管疾病及多種感染性疾病[3-5]，是腹可安片、腸胃適膠囊、復(fù)方救必應(yīng)膠囊等中成藥的組成之一[6-7]。救必應(yīng)還是嶺南地區(qū)涼茶的主要組成成分[8]，在牙膏中也有應(yīng)用[9-10]。救必應(yīng)的偽品米碎木為米碎木I. godajam （Colebr.） Wall.的干燥樹皮[11]，外觀與救必應(yīng)極其相似，在商品流通中也常有米碎木混作救必應(yīng)的現(xiàn)象[12]，導(dǎo)致救必應(yīng)的質(zhì)量參差不齊。曾有報(bào)道對救必應(yīng)進(jìn)行高效薄層指紋圖譜[13]、定性定量分析[12]等的研究，并對救必應(yīng)和米碎木進(jìn)行了性狀、顯微、薄層色譜的比較[11-12]。

中藥指紋圖譜是一種綜合、宏觀和可量化的鑒別手段，可用于對中藥材和中成藥進(jìn)行真?zhèn)舞b別，能較全面地反映中藥的品質(zhì)，控制中藥材的質(zhì)量[14]。本研究收集16個(gè)批次稱為“救必應(yīng)”的樣品，進(jìn)行HPLC指紋圖譜的表征和比較，并進(jìn)行相似度分析、主成分分析和聚類分析，為救必應(yīng)的鑒別和質(zhì)量評價(jià)提供依據(jù)，并為臨床用藥的安全性和有效性提供技術(shù)保障。

1 儀器與試藥

Shimadzu LC-20AT型高效液相色譜儀（日本島津公司）：SPD-M20A二極管陣列檢測器（PDA）、SIL-20A自動(dòng)進(jìn)樣器、DGU-20A5在線脫氣機(jī)、CTO-10ASvp柱溫箱和Shimadzu LC-solution工作站；KQ-100E型超聲清洗器（100 W，40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司）；HHS型電熱恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械五廠）；Sartorius CP225D型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）。

乙腈為色譜純（德國Merck公司），水為重蒸水，其他試劑為分析純。收集的16批樣品均經(jīng)廣州市藥品檢驗(yàn)所劉柏英鑒定，樣品信息見表1，保存在中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所1016實(shí)驗(yàn)室。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

樣品粉碎，過3號篩，精密稱取0.1 g，加入50%甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過0.45 ?m微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.2 色譜條件

采用Agilent Zorbax SB-C18色譜柱（4.6 mm× 250 mm，5 ?m），流動(dòng)相A為乙腈、B為水，流速1 mL/min，檢測波長210～370 nm Max Plot，進(jìn)樣量10 ?L，柱溫30 ℃，梯度洗脫程序見表2。

60 min 90 10

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取S6樣品粉末，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，采用軟件對樣品的HPLC圖譜進(jìn)行自動(dòng)匹配。結(jié)果顯示相似度均大于0.98，且RSD值均小于1%，表明該儀器的精密度良好，符合指紋圖譜要求。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取S6樣品粉末0.1 g，6份，按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣6次，采用軟件對樣品的HPLC圖譜進(jìn)行自動(dòng)匹配。結(jié)果顯示相似度均大于0.98，且RSD值均小于1%，表明該方法的重復(fù)性良好，符合指紋圖譜要求。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取S6的供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h進(jìn)樣，采用軟件對樣品的HPLC圖譜進(jìn)行自動(dòng)匹配。結(jié)果顯示24 h內(nèi)色譜圖的相似度均大于0.98，且RSD值均小于1%，表明該供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 指紋圖譜的建立

將16批樣品按“2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行HPLC測定，可以明顯將圖譜分成2類。其中S1～S9的9批樣品為一類（見圖1），與通過性狀鑒別鑒定的救必應(yīng)一致；S10～S16的7批樣品為另一類（見圖2），與通過性狀鑒別鑒定的米碎木一致。

圖1 救必應(yīng)HPLC指紋圖譜疊加圖

2.5 相似度評價(jià)

將9批救必應(yīng)指紋圖譜導(dǎo)入國家藥典委員會《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)2004A版》中，以中位數(shù)生成救必應(yīng)對照指紋圖譜（R1），確定了31個(gè)共有峰。R1的相似度定為1，計(jì)算各指紋圖譜與R1的相似度，見表3。將7批米碎木進(jìn)行相同處理，生成米碎木對照指紋圖譜（R2），確定了28個(gè)共有峰，計(jì)算各指紋圖譜與R2的相似度值，見表4。

2.6 救必應(yīng)的真?zhèn)舞b別

2.6.1 聚類分析 將16批樣品HPLC指紋圖譜中各色譜峰的峰面積與樣品號建立矩陣，導(dǎo)入SPSS19.0軟件，采用組間聯(lián)接法，以歐氏距離的平方為測度，對數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化轉(zhuǎn)換，得到所有樣品的聚類分析譜圖，見圖3。結(jié)果表明，16批樣品可明顯地分為2類，S1～S9聚為一類，S10～S16聚為另一類，與相似度分析結(jié)果一致。

2.6.2 主成分分析 采用SPSS19.0軟件對全部樣品進(jìn)行主成分分析，見圖4。結(jié)果表明，S1～S9分布在軸右側(cè)區(qū)域，而S10～S16分布在軸左側(cè)區(qū)域。該圖直觀反映了各批樣品之間的差異大小，與聚類分析、相似度分析結(jié)果一致。

3 討論

救必應(yīng)主要含有黃酮類和三萜類化合物，這2類化合物的最大吸收波長差異較大，相關(guān)文獻(xiàn)中的檢測波長也不一致，有210 nm[12]、265 nm[15]、290 nm[16]。島津高效液相色譜儀PDA檢測器有Max Plot繪圖功能，每個(gè)峰都是在其最大吸收波長下采集的，因此本試驗(yàn)結(jié)果可以反映各化合物最優(yōu)的色譜圖。

本試驗(yàn)對色譜條件考察了乙腈-0.5%冰乙酸溶液、乙腈-水、甲醇-水、甲醇-0.5%冰乙酸溶液等不同流動(dòng)相體系[1，11-13]，結(jié)果甲醇-0.5%冰乙酸溶液的色譜峰峰形好且穩(wěn)定，大多數(shù)峰分離良好；同時(shí)考察了25、30、35 ℃柱溫條件下各色譜峰的分離情況，結(jié)果表明，不同柱溫條件下色譜峰略有區(qū)別，當(dāng)溫度升高時(shí)，部分峰發(fā)生位移與合并，使分離度降低，因此選擇柱溫為30 ℃[13，16]。

本試驗(yàn)分別對提取溶劑（30%、50%、70%、100%甲醇）、提取方式（超聲、加熱回流）、提取時(shí)間（30、60 min）及提取體積（10、20、30 mL）進(jìn)行了考察，最終選用50%甲醇超聲提取30 min，提取體積10 mL，可以使提取更為完全，提取效率更高。

《中華人民共和國藥典》對救必應(yīng)性狀的描述是“厚1～15 mm”，但本研究收集的16批樣品厚度均不超過10 mm，米碎木厚度也有低于15 mm的，厚度不應(yīng)成為救必應(yīng)與米碎木的區(qū)別特征。文獻(xiàn)[12，17]認(rèn)為救必應(yīng)與米碎木的特征性區(qū)別在于后者斷面呈沙粒樣，但本研究收集的救必應(yīng)藥材的斷面也具有少量的沙粒樣。兩者表面均比較粗糙，內(nèi)表面均具有淺條紋，救必應(yīng)更多地具有卷筒狀外觀，米碎木并不都是塊狀。依據(jù)這些性狀尚不能確切對兩者進(jìn)行鑒別。

本研究成功建立了救必應(yīng)及其偽品米碎木的HPLC指紋圖譜，指出了救必應(yīng)與米碎木的顯著差異，救必應(yīng)有31個(gè)共有峰，米碎木有28個(gè)共有峰。從16批樣品HPLC指紋圖譜的相似度及聚類分析、主成分分析可以看出，S1～S9為一類，S10～S16為另一類，與性狀鑒別的鑒定結(jié)果一致，能夠客觀、準(zhǔn)確地判別救必應(yīng)藥材的真?zhèn)?，可以有效用于救必?yīng)藥材的質(zhì)量控制。本研究建立的指紋圖譜評價(jià)方法簡便易行、穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好，可為進(jìn)一步提高救必應(yīng)的質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

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（收稿日期：2017-01-03）

（修回日期：2017-02-27；編輯：陳靜）