孟盼 杜青 張秀麗 柳卓 向韻 劉林 王宇紅

摘要：目的 觀察百事樂膠囊對慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激（CUMS）大鼠海馬磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）信號通路關(guān)鍵因子表達(dá)的影響，探討其抗抑郁的作用機制。方法 將SD大鼠隨機分為空白組、模型組、氟西汀組和百事樂膠囊高、中、低劑量組，每組10只。采用CUMS加孤養(yǎng)的方式建立抑郁模型，造模同時灌胃給藥，連續(xù)21 d。采用新奇攝食實驗和Open-field實驗評價行為學(xué)變化，ELISA檢測血清單胺神經(jīng)遞質(zhì)，免疫熒光和Western blot檢測大鼠海馬PI3K、蛋白激酶B（AKT）、血清糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)蛋白激酶1（SGK1）表達(dá)。結(jié)果 與空白組比較，模型組大鼠攝食潛伏期顯著延長，水平和垂直活動次數(shù)明顯減少（P<0.01），血清單胺神經(jīng)遞質(zhì)含量下降（P<0.01），海馬PI3K、AKT表達(dá)顯著降低且SGK1表達(dá)顯著升高（P<0.05，P<0.01）；與模型組比較，百事樂膠囊高、中劑量組大鼠攝食潛伏期顯著縮短（P<0.05），水平和垂直活動次數(shù)顯著增加（P<0.01），血清單胺神經(jīng)遞質(zhì)含量顯著升高（P<0.05，P<0.01），海馬PI3K、AKT顯著增加且SGK1表達(dá)顯著降低（P<0.05，P<0.01）。結(jié)論 百事樂膠囊可通過緩解模型大鼠抑郁樣行為，調(diào)控海馬PI3K信號通路關(guān)鍵因子，發(fā)揮其抗抑郁的功效。

關(guān)鍵詞：百事樂膠囊；抑郁癥；海馬；磷脂酰肌醇-3激酶；蛋白激酶B；血清糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)蛋白激酶1；單胺神經(jīng)遞質(zhì)；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.08.010

中圖分類號：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1005-5304（2017）08-0041-05

Effects of Baishile Capsules on Hippocampal PI3K Signaling Pathway in Chronic Mild Unpredictable Stress Rats MENG Pan1， DU Qing1， ZHANG Xiu-li1， LIU Zhuo1， XIANG Yun1， LIU Lin2， WANG Yu-hong1，2 （1. Training Bases of Hunan Key Laboratory of Chinese Materia Medica Powder and Innovative Drugs Established by Provincial and Ministry， Changsha 410208， China； 2. First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine， Changsha 410007， China）

Abstract： Objective To observe the effects of Baishile Capsules on the hippocampal PI3K signaling pathway in chronic mild unpredictable stress （CUMS） rats； To discuss its mechanism of action for anti-depression. Methods SD rats were randomly divided into 6 groups， control group， model group， fluoxetine group， Baishile Capsules high-， medium- and low-dose groups， with 10 rats in each group. The cums depression model was established， and gavage for medication was conducted at the same time for 21 days in a row. The behavioral changes of rats in each group were detected by the novel feeding experiment and Open-field experiment； monoamine neurotransmitter in serum were detected by ELISA； the expressions of PI3K， AKT and SGK1 in rat hippocampus were detected by immunofluorescence and Western blot test. Results Compared with the control group， feeding latency of rats in model

基金項目：國家自然科學(xué)基金青年基金（81403387）；湖南省教育廳一般項目（14C0862）；中醫(yī)內(nèi)科學(xué)省部共建教育部重點實驗室開放基金（ZYNK201503）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)校級青年基金（99820001-147）

通訊作者：王宇紅，E-mail：wyh107@126.com

group was significantly prolonged （P<0.01）， horizontal and vertical activities were significantly reduced （P<0.01）； the content of serum monoamine neurotransmitter decreased （P<0.01）； the expressions of PI3K and AKT in hippocampus decreased， while the expression of SGK1 increased （P<0.01， P<0.05）. Compared with the model group， Baishile Capsule high- and medium-dose groups can significantly shorten the incubation period of feeding rats （P<0.05）， and increase the number of horizontal and vertical activities （P<0.01）； the 5-HT and NE levels in serum were significantly elevated （P<0.05， P<0.01）； the expressions of PI3K， AKT in hippocampal increased； the expression of SGK1 decreased （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Baishile Capsules can alleviate the depression like behavior in rat models， and regulate key factors of hippocampal PI3K signaling pathway， so as to exert antidepressant effects.

Key words： Baishile Capsules； depression； hippocampus； PI3K； AKT； SGK1； rats

抑郁癥是一種以思維遲緩、意志活動減退和認(rèn)知功能損傷等為主要特征的精神障礙性疾病，具有高患病率、復(fù)發(fā)率及自殺率，已成為威脅人類身心健康的殺手。抑郁癥的發(fā)病機制復(fù)雜，涉及單胺遞質(zhì)系統(tǒng)功能和下丘腦-垂體-腎上腺軸功能紊亂等多種假說，但目前公認(rèn)的假說都以海馬作為其發(fā)病的靶部位。磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）信號通路與抑郁癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，其下游信號主要分為依賴于蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）的和非依賴于AKT的，可參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、發(fā)育、分化和存活。百事樂膠囊由貫葉連翹、姜黃、人參組成，是臨床經(jīng)驗方。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，其可有效降低海馬神經(jīng)元凋亡[1]，促進(jìn)海馬神經(jīng)再生[2]，增加海馬神經(jīng)突觸可塑性[3]，但具體作用機制還未明了。基于此，本實驗以PI3K信號通路關(guān)鍵因子為切入點，采用百事樂膠囊對慢性輕度不可預(yù)見性應(yīng)激（CUMS）大鼠進(jìn)行干預(yù)，深入探究其發(fā)揮抗抑郁功效的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠60只，鼠齡8周，體質(zhì)量220～250 g，湖南斯萊科景達(dá)動物中心，動物許可證號SCXK（湘）2015-0003。飼養(yǎng)于室溫（24±1）℃、濕度（55±10）%環(huán)境，明暗交替12 h/12 h，自由飲水?dāng)z食。

1.2 藥物

百事樂膠囊，湖南省中醫(yī)藥研究院，批號20150414；氟西汀膠囊，禮來（蘇州）制藥有限公司，批號0722A。

1.3 主要試劑與儀器

去甲腎上腺素（NE）、5-羥色胺（5-HT）ELISA試劑盒，R&D;公司；兔抗大鼠PI3K、AKT、血清糖皮質(zhì)激素調(diào)節(jié)蛋白激酶1（SGK1），英國Abcam公司；FITC熒光二抗，美國Proteintech公司；近紅外熒光二抗Alexa Fluor?700，美國LI-COR Odyssey；即用型SABC液、正常山羊血清封閉液、RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，Protein Marker，美國MBI Fermentas公司。生物組織切片機（THERMO SCIENTIFIC），NC膜（美國Millipore公司），開野視頻跟蹤系統(tǒng)（Panlab），萬分之一電子天平（日本島津），超純水儀（威立雅水務(wù)集團(tuán)），正置熒光顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)（Cail Zeiss），近紅外雙色激光成像系統(tǒng)（美國LI-COR Odyssey）。

2 實驗方法

2.1 分組和給藥

所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，按體質(zhì)量隨機分為空白組、模型組、氟西汀組（5.4 mg/kg）組和百事樂高、中、低劑量組（2.88、1.44、0.72 g/kg），每組10只。造模同時灌胃給藥，給藥體積10 mL/kg，空白組和模型組給予等量純凈水。每日1次，連續(xù)21 d。

2.2 造模

參照文獻(xiàn)[2]方法，采用CUMS加孤籠飼養(yǎng)方法復(fù)制抑郁模型?？瞻捉M每籠飼養(yǎng)5只，不給予任何刺激；其余各組單籠飼養(yǎng)，每日隨機給予不同刺激，共21 d，包括禁食24 h、禁水24 h、傾籠45 ℃、夾尾1 min、4 ℃冰浴15 min、晝夜顛倒24 h、噪音5 min，每日隨機安排1種，平均每種刺激使用3次。

2.3 行為學(xué)檢測

2.3.1 Open-field實驗 第22日，各組大鼠進(jìn)行行為學(xué)檢測。大鼠從80 cm×80 cm×40 cm、底面均分為25個方格的黑色敞箱的角落放入，適應(yīng)1 min后，拍攝并記錄各組大鼠3 min內(nèi)水平活動次數(shù)（四爪皆進(jìn)入方可記1次），垂直活動次數(shù)（兩爪騰空放下記1次），以水平和垂直活動次數(shù)作為評價其抑郁行為的指標(biāo)。

2.3.2 新奇攝食實驗 Open-field實驗結(jié)束后，各組大鼠禁食不禁水，第23日放入微光環(huán)境通用隔音試驗箱內(nèi)，箱內(nèi)中央放入事先稱好的飼料，安靜環(huán)境下使用動物行為采集監(jiān)控系統(tǒng)觀察并記錄6 min，其中適應(yīng)2 min，記錄后4 min大鼠進(jìn)入箱內(nèi)首次開始接觸并攝入飼料的時間（記為攝食潛伏期），以此作為實驗動物在陌生環(huán)境下情緒變化的行為學(xué)評價指標(biāo)。

2.4 ELISA檢測血清單胺神經(jīng)遞質(zhì)含量

第23日大鼠行為學(xué)測試結(jié)束后，大鼠腹腔注射10%水合氯醛（4 mL/kg）麻醉，腹主動脈取血，促凝管收集，3000 r/min離心10 min，血清放入1.5 mL離心管，-80 ℃保存，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行檢測。

2.5 樣本采集

行為學(xué)測試結(jié)束后，各組大鼠禁食不禁水24 h，腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，仰位固定于手術(shù)臺上，腹腔取血。每組取5只大鼠，快速剖開胸部使心臟暴露，用灌注穿刺針沿著心臟的縱軸方向經(jīng)心尖部插入左心室至主動脈根部，立即快速灌入約4 ℃生理鹽水250 mL，待流出的液體澄清后慢速灌注4%多聚甲醛溶液（4 ℃）至動物四肢僵硬后取出腦組織標(biāo)本，固定于4%多聚甲醛24 h，75%、95%、100%梯度乙醇脫水，浸蠟，包埋，切片，備用。每組再取5只大鼠，采血后直接取全腦后分離雙側(cè)海馬，液氮速凍，-80 ℃冰箱保存。

2.6 免疫熒光檢測

切片常規(guī)脫蠟、沖洗，滴加封閉液，37 ℃孵育30 min，去除多余液體；分別加入PI3K、AKT、SGK1的一抗（1∶1000稀釋），37 ℃溫育30 min，4 ℃過夜。0.01 mol/L PBST漂洗5 min×3次；加FITC熒光標(biāo)記的二抗，37 ℃濕盒避光孵育30 min。0.01 mol/L PBST避光漂洗5 min×3次；甘油緩沖液封片，采用ZEISS圖像分析軟件計算各組大鼠PI3K、AKT、SGK1免疫陽性細(xì)胞數(shù)。

2.7 Western blot檢測

在凍存海馬中加入組織裂解液，電動勻漿，離心，取上清液。BCA試劑盒測定蛋白濃度。配制15%濃縮膠與10%分離膠，上樣，電泳（濃縮膠60 V、40 min，分離膠80 V、90 min）至溴酚蘭到達(dá)凝膠底部即可。采用半干式轉(zhuǎn)膜法將凝膠中的蛋白分子轉(zhuǎn)移到NC膜上，封閉1 h，用TBST洗滌后加入相應(yīng)的一抗，4 ℃孵育過夜。TBST洗滌3次后加入近紅外熒光二抗（1∶1000），孵育0.5 h。采用近紅外雙色激光成像系統(tǒng)掃描，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，實驗數(shù)據(jù)以—x±s表示，組間比較采用方差分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

4 結(jié)果

4.1 Open-field實驗結(jié)果

與空白組比較，模型組大鼠3 min內(nèi)水平和垂直活動次數(shù)均顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，氟西汀組和百事樂高、中劑量組模型大鼠水平和垂直活動次數(shù)顯著增加（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見表1。

（下同）

4.2 新奇攝食實驗結(jié)果

與空白組比較，模型組大鼠攝食潛伏期顯著延長（P<0.01）；與模型組比較，氟西汀組和百事樂高、中劑量組大鼠攝食潛伏期顯著縮短（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見表2。

4.3 百事樂膠囊對模型大鼠單胺神經(jīng)遞質(zhì)的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清5-HT和NE含量顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，氟西汀組和百事樂高、中劑量組大鼠血清5-HT和NE含量顯著升高（P<0.05，P<0.01）。結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠血清神經(jīng)遞質(zhì)含量比較（—x±s，ng/g）

4.4 免疫熒光檢測結(jié)果

與空白組比較，模型組大鼠海馬CA3區(qū)PI3K、AKT免疫陽性細(xì)胞數(shù)減少，SGK1免疫陽性細(xì)胞數(shù)增加（P<0.01）；與模型組比較，氟西汀組和百事樂高劑量組大鼠海馬CA3區(qū)PI3K、AKT免疫陽性細(xì)胞數(shù)增加（P<0.05，P<0.01），SGK1免疫陽性細(xì)胞數(shù)減少（P<0.01），百事樂膠囊中劑量組PI3K免疫陽性細(xì)胞數(shù)增加（P<0.01），SGK1免疫陽性細(xì)胞數(shù)減少（P<0.05）。結(jié)果見表4、圖1～圖3。

4.5 Western blot檢測結(jié)果

模型組較空白組大鼠海馬PI3K、AKT表達(dá)明顯降低，SGK1表達(dá)明顯增加（P<0.01）；與模型組比較，氟西汀組和百事樂高劑量組大鼠海馬PI3K、AKT表達(dá)明顯增加，SGK1表達(dá)顯著降低（P<0.05，P<0.01），百事樂中劑量組大鼠海馬PI3K表達(dá)明顯增加、SGK1表達(dá)明顯降低（P<0.05）。結(jié)果見圖4、表5。

5 討論

目前，根據(jù)抑郁癥發(fā)病機制各種假說開發(fā)的治療抑郁癥藥物大多存在起效延遲、復(fù)發(fā)率高和不良反應(yīng)大等現(xiàn)象。中藥立足于整體，可調(diào)節(jié)機體的多系統(tǒng)、多環(huán)節(jié)、多靶點，對復(fù)雜的神經(jīng)精神疾病有獨特療效。

本實驗采用目前國際公認(rèn)的新奇攝食實驗和曠場實驗對抑郁癥動物模型進(jìn)行行為學(xué)評價，發(fā)現(xiàn)模型組大鼠攝食潛伏期明顯延長，水平和垂直活動次數(shù)減少，且血液學(xué)檢測中發(fā)現(xiàn)血清單胺神經(jīng)遞質(zhì)顯著降低。百事樂各劑量組可顯著縮短模型大鼠攝食潛伏期，增加其自主活動和血清單胺神經(jīng)遞質(zhì)含量，提示百事樂膠囊可有效改善抑郁樣癥狀。

P13K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，是生長因子受體家族信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的重要成員，其下游依賴于AKT的信號通路即指AKT是P13K下游信號的靶蛋白，可參與胞內(nèi)物質(zhì)代謝，調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長和凋亡[4]。非依賴于AKT的信號通路即指SGK1是PI3K的下游靶蛋白，其是不同于AKT的另一種PI3K下游靶點，可被PI3K激活后參與細(xì)胞存活的調(diào)節(jié)[5-6]。

PI3K-AKT信號通路是促進(jìn)細(xì)胞生存和維持細(xì)胞正常功能的關(guān)鍵信息分子鏈[7]。在精神疾患中，PI3K-AKT信號通路受抑制，可使中樞神經(jīng)元和海馬干細(xì)胞功能下降，從而導(dǎo)致精神疾病的產(chǎn)生[8]。SGK1是PI3K下游不同于AKT的一種快速誘導(dǎo)型蛋白激酶，結(jié)構(gòu)與AKT高度相似。SGK1作為皮質(zhì)醇對神經(jīng)發(fā)生和糖皮質(zhì)激素受體功能變化的“調(diào)解者”，可參與胞內(nèi)轉(zhuǎn)運、神經(jīng)興奮等生理過程[9]。SGK1在慢性不可預(yù)測應(yīng)激大鼠和慢性皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的抑郁樣小鼠海馬中的表達(dá)均顯著增加[10-11]。本實驗中，免疫熒光、Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠海馬PI3K、AKT表達(dá)降低，SGK1表達(dá)增加，而給予百事樂膠囊后，這些變化明顯發(fā)生改變或逆轉(zhuǎn)，尤以對PI3K/SGK1信號的調(diào)節(jié)更為顯著。

綜上，百事樂膠囊發(fā)揮抗抑郁功效的機制主要通過調(diào)節(jié)海馬PI3K及其下游SGK1信號而實現(xiàn)。下一步擬采用化學(xué)阻斷技術(shù)，分別從在體動物和離體原代神經(jīng)元細(xì)胞不同層面探討其對SGK1信號的作用機制及起效靶點。

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（收稿日期：2017-01-06）

（修回日期：2017-01-22；編輯：華強）