依香叫　李金誠　王松月　燕夢云　崔箭　裴凌鵬

[摘要]該文研究了不同濃度刺老苞根皮含藥血清對原代成骨細(xì)胞Wnt/βcatenin信號通路中βcatenin，Wnt1，F(xiàn)rizzed2，TCF和Axin表達(dá)的影響。經(jīng)SPF級健康雌性SD大鼠（80只）給予蒸餾水、刺老苞根皮水煎劑高、中、低3種劑量，連續(xù)灌胃7 d，制備刺老苞根皮含藥血清。體外培養(yǎng)原代成骨細(xì)胞（OB）并鑒定，取第3代成骨細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后用各組含藥血清干預(yù)培養(yǎng)10 d，采用茜素紅染色鈣化結(jié)節(jié)并計(jì)數(shù)；干預(yù)培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，分別采用Realtime PCR（RTPCR）和Western blot 法測定βcatenin，Wnt1，F(xiàn)rizzed2，TCF和Axin的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，經(jīng)鑒定體外培養(yǎng)細(xì)胞為原代成骨細(xì)胞；在干預(yù)培養(yǎng)后，與模型組相比，各劑量組可促進(jìn)原代成骨細(xì)胞的礦化能力，且上調(diào)βcatenin，Wnt1，F(xiàn)rizzed2，TCF mRNA和蛋白的表達(dá)，下調(diào)Axin mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)刺老苞根皮含藥血清可通過調(diào)節(jié)原代成骨細(xì)胞Wnt/βcatenin信號通路中βcatenin，Wnt1，F(xiàn)rizzed2，TCF和Axin表達(dá)，增強(qiáng)成骨細(xì)胞的分化和增殖。

[關(guān)鍵詞]刺老苞根皮； 原代成骨細(xì)胞； Wnt/βcatenin； 信號通路

[Abstract]This paper was aimed to investigate the effect of Aralia echinocaulis containing serum on expression of βcatenin， Wnt1， Frizzed2， TCF and Axin in Wnt/βcatenin signaling pathway of primary osteoblasts SD healthy female rats （n=80） were used to make A echinocaulis containing serum by gastric perfusion for seven days with distilled water， A echinocaulis decoction high dosage， middle dosage， and low dosage In vitro， primary osteoblasts were cultured and identified The third generation primary osteoblasts were taken and cultured for 48 h， then cells were treated with the different drug serums for 10 days and calcified nodules were counted by alizarin red staining The cells were collected after treatment for 48 h and the expression levels of βcatenin， Wnt1， Frizzled2， TCF and Axin were detected by Realtime PCR and Western blot The results suggested that the in vitro cells were primary osteoblasts； and after treatment， various doses groups could promote the mineralization ability of primary osteoblasts， upregulate the mRNA and protein expression levels of βcatenin， Wnt1， Frizzled2， and TCF， and downregulate the mRNA and protein expression levels of Axin These findings indicated that A echinocaulis containing serum can enhance the differentiation and proliferation of osteoblasts by regulating the expression levels of βcatenin， Wnt1， Frizzled2， TCF and Axin in Wnt/βcatenin signaling pathway of primary osteoblasts

[Key words]Aralia echinocaulis； primary osteoblasts； Wnt/βcatenin； signaling pathway

近年來，民族藥物資源的開發(fā)和利用倍受國內(nèi)外研究學(xué)者的關(guān)注和青睞，傳統(tǒng)土家族醫(yī)藥——刺老苞根皮為五加科植物楤木Aralia chinensis L或棘莖楤木A echinocaulis HandMazz 的根皮或莖皮，分布于我國西南、華南及華東山區(qū)，包括云南東南部及西雙版納地區(qū)、貴州黔南州及黔東南州、廣西壯族自治區(qū)、海南省五指山周圍地區(qū)、廣東省山區(qū)、福建省中南部地區(qū)、江西省南端、臺灣省等地山區(qū)，資源非常豐富[12]。該藥材片狀或槽狀，氣微香，嚼之帶黏液性，味辛，性平。歸肝、腎經(jīng)，功能滋陰健腎，祛風(fēng)濕，壯筋骨，散瘀血，消腫毒?？捎糜陲L(fēng)濕痹痛、跌打損傷、骨折等治療[34]。骨折愈合是一個(gè)復(fù)雜的全身性協(xié)調(diào)活動(dòng)過程。在骨折愈合過程中，主要由負(fù)責(zé)骨吸收的破骨細(xì)胞和負(fù)責(zé)骨形成的成骨細(xì)胞共同完成，骨折后，成骨細(xì)胞對此信號做出應(yīng)答，募集破骨細(xì)胞到骨折部位，促進(jìn)骨質(zhì)吸收，緊接著成骨細(xì)胞進(jìn)行重新成骨，在神經(jīng)調(diào)節(jié)和生物力學(xué)作用下使損傷骨組織恢復(fù)正常。在整個(gè)骨折愈合過程中，成骨細(xì)胞扮演者重要的角色，經(jīng)研究表明，在經(jīng)典Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作用下可引導(dǎo)成骨細(xì)胞分化，促進(jìn)骨折愈合。目前實(shí)驗(yàn)證明刺老苞根皮具有促進(jìn)大鼠骨折愈合的作用，但其分子機(jī)制層面研究甚少，為了進(jìn)一步明確刺老苞根皮含藥血清對成骨細(xì)胞分化、增殖和功能的影響，本實(shí)驗(yàn)通過觀察刺老苞根皮含藥血清對原代成骨細(xì)胞Wnt/βcatenin信號通路中相關(guān)基因和蛋白βcatenin，Wnt1，F(xiàn)rizzled2，TCF，Axin表達(dá)的作用，探討刺老苞根皮修復(fù)大鼠骨折的分子作用機(jī)制。

1材料

11動(dòng)物新生24 h SD大鼠乳鼠10只。SPF級健康雌性SD大鼠80只，3月齡，體重（270±20） g，中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號SCXK（軍）20120004。

12藥物刺老苞根皮，采于湖北恩施地區(qū)，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)生藥系楊瑤珺教授鑒定，批號0P1101，湖北恩施中藥材有限公司。

13試劑αMEM培養(yǎng)基，胎牛血清，025%胰蛋白酶溶液（Gibco，美國），青霉素/鏈霉素，DMSO，II型膠原酶，β甘油磷酸鈉，抗壞血酸，茜素紅，二甲基亞砜（Sigma，美國），PBS 磷酸鹽緩沖液（粉劑）（北京昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司），堿性磷酸酶染色試劑盒（南京建成生物制品有限公司），BCA 蛋白定量試劑盒（北京賽諾博生物科技有限公司），ECL（Millipore，美國），山羊抗兔IgG（H+L），HRP，山羊抗小鼠IgG（H+L），HRP，牛抗山羊IgG（H+L），HRP（北京天德悅生物科技有限責(zé)任公司），GAPDH 鼠單抗（Immunoway，美國），βcatenin，Wnt1，TCF（Cell Signaling Technology，美國），Axin，F(xiàn)rizzled2（Santa Cruz，美國），TRNzol Universal 總RNA 提取試劑，F(xiàn)astQuant RT Kit（With gDNase）（天根生化科技有限公司）。

14儀器細(xì)胞超凈操作臺（蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司），CO2培養(yǎng)箱，F(xiàn)resco低溫冷凍離心機(jī)，MultiSkan3酶標(biāo)儀（Thermo Scientific，美國），電腦型倒置顯微鏡（OLYMPUS，日本），Mini P4電泳槽，濕轉(zhuǎn)電泳槽（北京凱元信瑞儀器有限公司），電泳儀，半干槽（BioRad，美國），水平脫色搖床（江蘇其林貝爾儀器有限公司），酸度計(jì)pH211（Hanna，意大利），電動(dòng)組織勻漿器（Fluka，美國），ABI 7900HT熒光定量PCR儀（KAPA Biosystems，美國）。

2方法

21刺老苞根皮含藥血清制備與分組含藥血清制備：SPF級健康雌性SD大鼠80只適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，通過在脛骨上打孔模擬骨折二期愈合的理想力學(xué)環(huán)境：早期模擬堅(jiān)強(qiáng)固定下的力學(xué)環(huán)境，后期隨骨傳導(dǎo)支架形成，開始承受應(yīng)力刺激，模擬二期愈合力學(xué)環(huán)境。術(shù)后第2天用SPSS軟件隨機(jī)數(shù)字的方法分成4組，分別為模型組、刺老苞根皮低劑量組、刺老苞根皮中劑量組、刺老苞根皮高劑量組，每組20只。用藥劑量根據(jù)人體習(xí)用安全劑量（70 kg體重20 g生藥），按人/鼠表面積比率換算等效計(jì)量法計(jì)算。刺老苞根皮灌胃劑量為18 g·kg-1·d-1，以臨床劑量為中劑量，1/2，2倍劑量為低、高劑量（即分別為09，36 g·kg-1·d-1）。模型組給予等劑量等頻率蒸餾水。術(shù)后7 d取材（取材前進(jìn)食12 h），末次給藥后1 h，稱重，3%戊巴比妥鈉（3 mg·kg-1）腹腔注射麻醉，在無菌操作下腹主動(dòng)脈采血，將采集來的血樣在室溫下靜置2 h后，1 800 r·min-1離心20 min，分離出血清，56 ℃水浴滅活30 min，在022 μm微孔膜過濾除菌后分裝，保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

實(shí)驗(yàn)共分為4組：模型組（20%模型組大鼠血清+αMEM）、低劑量組（20%刺老苞低劑量含藥血清+αMEM）、中劑量組（20%刺老苞中劑量含藥血清+αMEM）、高劑量組（20%刺老苞高劑量含藥血清+αMEM）。

22原代成骨細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定取新生24 h內(nèi)的SD乳鼠10只，放入75%乙醇浸洗乳鼠，將乳鼠轉(zhuǎn)移到一個(gè)有蓋培養(yǎng)皿內(nèi)，在無菌操作下，分離顱骨，清除顱骨表面的結(jié)締組織，用PBS簡單沖洗顱蓋骨后放入15 mL離心管內(nèi)，加入3 mL 025%胰蛋白酶液Ⅱ型膠原酶溶液（1∶2），37 ℃恒溫水浴振蕩消化5 min，棄上清液。加入3 mL消化液，37 ℃恒溫水浴振蕩消化10 min，收集上清液，并重復(fù)消化4次，將收集的消化液1 500 r·min-1離心4 min，棄上清液，重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度后接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)24 h后，換成骨細(xì)胞分化培養(yǎng)基（10% FBS+10 mmol·L-1β甘油磷酸鈉+50 mg·L-1抗壞血酸），每3 d換液1次，待細(xì)胞融合50%～70%后，消化并傳代，取3～6代細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。取第3代純化的原代成骨細(xì)胞，經(jīng)ALP染色和茜素紅染色鑒定獲得的是成骨細(xì)胞。

23茜素紅染色法檢測骨礦化功能收集第3代原代成骨細(xì)胞，以1×105 個(gè)/mL，接種于24孔板，每孔1 mL，培養(yǎng)48 h后按實(shí)驗(yàn)分組更換不同培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，每2 d換液1次，并每天觀察細(xì)胞狀態(tài)，10 d后，取出24孔板，用PBS沖洗3遍，每孔加入2 mL 4%多聚甲醛固定15 min，蒸餾水沖洗3遍，每孔加入2 mL茜素紅染液，放置于37 ℃，45 min后蒸餾水沖洗3遍，用熒光倒置顯微鏡拍照，并計(jì)數(shù)鈣化結(jié)節(jié)數(shù)量。

24Westernblot檢測βcatenin，Wnt1，F(xiàn)rizzed2，TCF和Axin的蛋白表達(dá)量收集第3代原代成骨細(xì)胞，以1×105個(gè)/mL，接種于6孔板，每孔2 mL，培養(yǎng)48 h后按實(shí)驗(yàn)分組更換不同培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，用預(yù)冷RIPA蛋白抽提試劑提取總蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白定量，調(diào)整蛋白濃度后煮沸變性進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，將膜完全浸沒于3%BSATBST中室溫輕搖30 min，室溫下一抗孵育10 min，4 ℃過夜，TBST洗膜，二抗孵育40 min，TBST洗膜，ECL加到膜上后反應(yīng)3～5 min，膠片曝光，顯影，定影，對印跡目的條帶進(jìn)行掃描，TotalLab Quant軟件分析圖片中的條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)4次。

25熒光定量PCR檢測βcatenin，Wnt1，F(xiàn)rizzed2，TCF和Axin mRNA的表達(dá)量收集第3代原代成骨細(xì)胞，以1×105 個(gè)/mL，接種于6孔板，每孔2 mL，培養(yǎng)48 h后按實(shí)驗(yàn)分組更換不同培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，用Trizol Universal 試劑提取總RNA，使用FastQuant RT Kit（With gDNase）將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。使用PrimerBlast設(shè)計(jì)引物，退火溫度55～60 ℃，PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：95 ℃預(yù)變性30 s進(jìn)入循環(huán)，95 ℃變性15 s，56 ℃復(fù)性20 s，72 ℃延伸20 s，共40個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增之后，做溶解曲線檢測產(chǎn)物的均一性。每個(gè)反應(yīng)均重復(fù)3次。引物序列見表1。經(jīng)檢測，每對引物的擴(kuò)增效率均接近于1。使用2-ΔΔCt方法計(jì)算樣本目標(biāo)基因相對含量，GAPDH為內(nèi)參基因。

經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，分析數(shù)據(jù)。

26統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 200軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P<005為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<001有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3結(jié)果

31原代成骨細(xì)胞的鑒定原代成骨細(xì)胞用成骨細(xì)胞完全培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）在37 ℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。經(jīng)倒置顯微鏡觀察，細(xì)胞在24 h后開始貼壁，48 h后完全貼壁，細(xì)胞為單核，呈長梭形和多角形等形態(tài)，10 d左右細(xì)胞融合成鋪路石樣，并伴有礦化結(jié)節(jié)的出現(xiàn)，見圖1。

32茜素紅染色法檢測骨礦化功能不同濃度含藥血清對成骨細(xì)胞作用10 d后，經(jīng)茜素紅染色后，計(jì)數(shù)鈣化結(jié)節(jié)的個(gè)數(shù)，結(jié)果顯示：與對照組相比較，不同濃度含藥血清組干預(yù)后的成骨細(xì)胞產(chǎn)生的鈣化結(jié)節(jié)皆有所增多，低劑量組差異明顯（P<005），中劑量組和高劑量組差異顯著（P<001），見表2。

33Western blot檢測βcatenin，Wnt1，F(xiàn)rizzled2，TCF和Axin的蛋白表達(dá)量經(jīng)Western blot檢測不同濃度含藥血清對原代成骨細(xì)胞分化過程中不同細(xì)胞因子相對蛋白表達(dá)量的影響，結(jié)果顯示：與對照組相比較，不同濃度含藥血清組可以有效地上調(diào)βcatenin，TCF，Wnt1，F(xiàn)rizzled2蛋白表達(dá)，下調(diào)Axin蛋白表達(dá)。其中與對照組相比，低劑量組的βcatenin，TCF和Frizzled2蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P<005），中劑量組βcatenin蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P<001），TCF和Frizzled2蛋白表達(dá)明顯上調(diào)（P<005），高劑量組βcatenin，TCF和Frizzled2蛋白表達(dá)顯著上調(diào)（P<001）；各劑量組Wnt1蛋白的表達(dá)量較對照組顯著上調(diào)（P<001）。與對照組相比，低劑量組Axin蛋白表達(dá)下調(diào)（P<005），且中劑量組與高劑量組較對照組顯著下調(diào)（P<001），見表3。

34熒光定量PCR 檢測βcatenin，Wnt1，F(xiàn)rizzled2，TCF，Axin mRNA的表達(dá)量經(jīng)熒光實(shí)時(shí)定量PCR（Realtime PCR）檢測含藥血清對原代成骨細(xì)胞特定表達(dá)基因的相對表達(dá)量。結(jié)果顯示：與對照組相比較，不同濃度含藥血清組可以有效地上調(diào)βcatenin，TCF，Wnt1，F(xiàn)rizzled2 mRNA表達(dá)，下調(diào)Axin mRNA表達(dá)。其中與對照組相比，低劑量組的βcatenin，TCF，Wnt1和Frizzled2 mRNA表達(dá)較對照組明顯上調(diào)（P<005），中劑量組中βcatenin，Wnt1 mRNA表達(dá)量顯著上調(diào)（P<001），TCF，F(xiàn)rizzled2 mRNA表達(dá)明顯上調(diào)（P<005）；高劑量組中βcatenin，TCF，Wnt1，F(xiàn)rizzled2 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)（P<001）。與對照組相比，低劑量組和中劑量組中 Axin mRNA表達(dá)下調(diào)（P<005），高劑量組Axin mRNA表達(dá)顯著下調(diào)（P<001），見表4。

4討論

Wnt/βcatenin信號通路被稱為Wnt的經(jīng)典通路，是4條Wnt信號通路之一[3]。Wnt經(jīng)典通路，通過βcatenin激活基因轉(zhuǎn)錄，是骨重建調(diào)控的重要途徑。在骨重建過程中成骨細(xì)胞起著關(guān)鍵性的作用，因此探討成骨細(xì)胞的成骨分化對研究骨折愈合有著重要的意義。大量研究證明，在Wnt的經(jīng)典通路中βcatenin是核心調(diào)控因子，它決定著骨軟骨祖細(xì)胞在模內(nèi)和軟骨內(nèi)向軟骨細(xì)胞還是成骨細(xì)胞分化的重要因素，當(dāng)Wnt與卷曲蛋白（Frizzled2）受體結(jié)合后，通過破壞由Axin，APC，GSK3，βcatenin等結(jié)合形成的“破壞復(fù)合體”，使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的βcatenin穩(wěn)定，并很快進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，促進(jìn)TCF/LEF與特定靶基因的啟動(dòng)子結(jié)合，激活靶基因轉(zhuǎn)錄，使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向骨軟骨細(xì)胞前體分化，從而促使成骨細(xì)胞的成骨分化，最終促進(jìn)骨形成，使骨折愈合[7]。由此可見βcatenin，TCF，Wnt1，F(xiàn)rizzled2在Wnt/βcatenin信號通路起正調(diào)節(jié)作用，Axin具有負(fù)向調(diào)節(jié)作用。土家族在長期醫(yī)療實(shí)踐中，形成了土家族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)理論體系，其中的“三元”學(xué)說認(rèn)為，骨折后必須經(jīng)脈暢通，氣、血、精充分滋養(yǎng)，三元（頭元、腹元、足元）調(diào)和，冷熱平衡，才能愈合。刺老苞根皮是土家族習(xí)用草藥，有著滋陰補(bǔ)腎，祛風(fēng)濕，壯筋骨，散淤血，消腫毒等功效。在治療骨折時(shí)，慣用內(nèi)服刺老苞根皮水煎劑，并有很好的療效[56，89]。以往研究表明，刺老苞根皮黃酮化合物可有效抗維甲酸引起的大鼠骨生長抑制及骨丟失，并對絕經(jīng)后所致骨質(zhì)疏松引起的骨折有一定防治作用[10]。刺老苞根皮水提物有增強(qiáng)堿性磷酸酶活性，促進(jìn)骨形成，提高骨礦物質(zhì)水平與骨密度值的作用[11]。在臨床上，通過刺老苞膠囊治療60例膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者的臨床療效發(fā)現(xiàn)刺老苞膠囊既能減輕膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者局部癥狀、體征，恢復(fù)關(guān)節(jié)功能，并能改善患者其他并發(fā)癥，且服用安全[12]。現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：經(jīng)刺老苞根皮含藥血清干預(yù)后，Axin表達(dá)下調(diào)，βcatenin，TCF，Wnt1和Frizzled2表達(dá)上調(diào)，說明由Axin，APC，GSK3，βcatenin等結(jié)合形成的“破壞復(fù)合體”被破壞，胞質(zhì)內(nèi)βcatenin積累并轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi)，與TCF/LEF啟動(dòng)靶基因，從而促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化與增殖。由于βcatenin是Runx2和Osterix的上游信號因子，目前研究證明Runx2和Osterix缺失的小鼠，完全缺乏成骨細(xì)胞，產(chǎn)生的軟骨骨架完全缺乏礦化基質(zhì)[1315]。因此，實(shí)驗(yàn)選取βcatenin，Wnt1，TCF，Axin 和 Frizzled2細(xì)胞因子探討刺老苞根皮對骨折愈合作用的分子機(jī)制，為進(jìn)一步研究提供新思路，為臨床用藥提供新依據(jù)。盡管如此，有關(guān)刺老苞根皮促進(jìn)骨折愈合的作用機(jī)制還存在很多不清楚的地方，尚需進(jìn)一步探討。

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[責(zé)任編輯張寧寧]