嚴(yán)穎　趙慧　鄒立思　劉訓(xùn)紅　柴川　王勝男　華愉教

[摘要]為了探討生態(tài)環(huán)境對(duì)杜仲代謝物合成積累的影響，本文采用液相色譜串聯(lián)三重四級(jí)桿飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜（LCQTOF MS/MS）結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析技術(shù)對(duì)不同產(chǎn)地杜仲中化學(xué)成分差異性進(jìn)行研究。通過(guò)二級(jí)串聯(lián)質(zhì)譜分析，對(duì)其質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行峰匹配、峰對(duì)齊、濾噪處理等，并進(jìn)行特征峰提??；用主成分分析（PCA）和偏最小二乘法判別分析（PLSDA）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；根據(jù)一級(jí)質(zhì)譜精確質(zhì)荷比和二級(jí)質(zhì)譜碎片信息，結(jié)合軟件數(shù)據(jù)庫(kù)搜索、標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)及相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行成分鑒定。結(jié)果顯示，3個(gè)不同產(chǎn)地杜仲樣品間的化學(xué)組成得到有效區(qū)分；初步鑒定出23個(gè)差異化學(xué)成分，其中14種共有差異化學(xué)成分呈現(xiàn)不同的變化規(guī)律。該結(jié)果為揭示生態(tài)環(huán)境對(duì)杜仲代謝物合成積累的影響規(guī)律提供基礎(chǔ)資料。

[關(guān)鍵詞]杜仲； 液相色譜串聯(lián)三重四極桿飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜； 產(chǎn)地； 化學(xué)成分

[Abstract]In order to study the influence of ecological environment regarding the synthesis and accumulation of metabolites in Eucommiae Cortex， LCQTOF MS/MS method combined with multivariate statistical analysis was used to analyze the differences of chemical constituents in Eucommiae Cortex from different habitats Through the analysis of the multistage tandem mass spectrometry， the characteristic peaks were extracted with mass spectrometry data peak matching， peak alignment， and noise filtering Principal component analysis （PCA） and partial leastsquares discriminant analysis （PLSDA） were used for data processing The chemical constituents were identified or tentative presumed according to MS accurate mass and MS/MS spectrometry fragmentation information， combined with the software of database search， comparison with reference standards and literature The results show the differences among samples of Eucommiae Cortex from different habitats are distinguishable A total of 23 chemical constituents in Eucommiae Cortex were identified or tentative presumed Among of them， 14 kinds of common differential chemical constituents （aucubin， geniposidic acid， neochlorogenic acid， syringin， olivil4′，4′diOβDglucopyranoside， chlorogenic acid， cryptochlorogenic acid， 1hydroxypinoresinol 4′，4′diOβDglucopyranoside， caffeic acid， pinoresinoldiOβDglucopyranoside， syringaresionldiOβDglucopyranoside， pinoresinol4′OβDglucopyranoside， eucommiol， isochlorogenic acid C and asiatic acid） presented different changing laws This study provides basic information for revealing the influence law of ecological environment on the biosynthesis of metabolites in Eucommiae Cortex

[Key words]Eucommiae Cortex； LCQTOF MS/MS； habitats； chemical constituents

杜仲為我國(guó)特有的名貴藥材，藥用歷史悠久，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，來(lái)源于杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoides Oilv的干燥樹(shù)皮，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、安胎之功效，用于肝腎不足，腰膝酸痛，筋骨無(wú)力，頭暈?zāi)垦＃焉锫┭?，胎?dòng)不安等癥[1]。現(xiàn)代研究表明，杜仲含有木脂素類(lèi)、環(huán)烯醚萜類(lèi)、苯丙素類(lèi)、多糖等多類(lèi)藥效活性成分，具有降血壓、降血脂、降血糖、抗腫瘤、抗菌抗病毒、保肝護(hù)腎、抗骨質(zhì)疏松等多方面藥理作用[23]。杜仲屬落葉喬木，在我國(guó)主要分布在秦嶺以南華中地區(qū)的四川、貴州、湖南、湖北、陜西等省。近年來(lái)我國(guó)杜仲引種栽培，資源不斷擴(kuò)大，市售杜仲藥材主要為栽培品。由于杜仲植物地理分布廣，形體變化大，藥材品質(zhì)差異大，藥材質(zhì)量參差不齊，難以實(shí)現(xiàn)商品藥材標(biāo)準(zhǔn)化[4]。目前對(duì)杜仲藥材的研究主要集中于化學(xué)成分、藥理作用和品質(zhì)評(píng)價(jià)方面，對(duì)于不同產(chǎn)地杜仲藥材的研究主要集中于主要成分含量變化，亦有指紋圖譜研究，紫外譜線組鑒別等[57]，運(yùn)用植物代謝組學(xué)技術(shù)分析不同產(chǎn)地杜仲中化學(xué)成分差異的研究還很少。

植物代謝組學(xué)技術(shù)是對(duì)植物提取物中代謝組進(jìn)行高通量、無(wú)偏差全面分析的技術(shù)，特別適合于中藥中多組分復(fù)雜體系的分析[8]，使中藥研究更符合祖國(guó)醫(yī)學(xué)的整體觀念。本實(shí)驗(yàn)借鑒植物代謝組學(xué)的研究思路和方法，采用液相色譜串聯(lián)三重四極桿飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜（LCQTOF MS/MS）技術(shù)分析不同產(chǎn)地杜仲化學(xué)成分的差異性，并通過(guò)多元統(tǒng)計(jì)分析找出差異顯著的化學(xué)成分及其變化規(guī)律，為揭示生態(tài)環(huán)境對(duì)杜仲代謝產(chǎn)物合成積累的影響規(guī)律及探討杜仲藥材的品質(zhì)形成機(jī)制提供基礎(chǔ)資料。

1材料

QTOFTM 5600 SystemMS/MS電噴霧飛行時(shí)間高分辨質(zhì)譜儀（配備Peakview 12數(shù)據(jù)處理工作站，美國(guó)Sciex公司）；SIL20A XR超快速液相色譜儀（日本Shimadzu公司）；Anke TGL16B離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器有限公司）；BSA224S 電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；KQ500B型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；MilliQ超純水制備儀（美國(guó)Millipore公司）。

乙腈、甲酸（色譜純，德國(guó)Merck公司）；甲醇（批號(hào)143135，色譜純，江蘇漢邦科技有限公司）；實(shí)驗(yàn)用水由MilliQ純水器制備的超純水。

杜仲樣品分別于2016年5月實(shí)地采集于貴州湄潭、湖北利川和陜西寧強(qiáng)，每個(gè)產(chǎn)地5份樣品，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉訓(xùn)紅教授鑒定為杜仲科植物杜仲E ulmoides的干燥樹(shù)皮。留樣憑證保存于南京中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定實(shí)驗(yàn)室。

2方法與結(jié)果

21供試品溶液的制備

精密稱(chēng)取樣品粉末06 g，精密加入50%甲醇30 mL，密閉，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率30 kHz）20 min，放置冷卻，再次稱(chēng)定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足質(zhì)量損失，過(guò)濾，濾液以12 000 r·min-1離心10 min，取上清液，過(guò)022 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得供試品溶液。

22實(shí)驗(yàn)條件

221色譜條件色譜柱Agilent ZORBAX SBC18柱（46 mm ×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相A為01%甲酸水溶液，B為乙腈， 梯度洗脫， 洗脫程序?yàn)?0～10 min， 5%～10% B，10～12 min， 10%～15% B，12～22 min， 15%～20% B，22～35 min， 20%～30% B，35～42 min，30%～60% B，42～55 min，60%～85% B，55～57 min，85%～5% B，57～60 min，5%B；柱溫30 ℃；流速10 mL·min-1；進(jìn)樣量10 μL。

222質(zhì)譜條件電噴霧離子源（ESI）負(fù)離子模式；質(zhì)量掃描范圍m/z 50 ～ 1 500；氣簾氣壓力（CUR）為2758 kPa；霧化氣壓力（GS1）為3792 kPa；輔助氣壓力（GS2）為3792 kPa；離子源溫度（TEM）為550 ℃；噴霧電壓（IS）為-4 500 V；脫簇電壓（DP）為-100 V。

23樣品處理方法的選擇

供試品溶液的制備中分別考察了甲醇、70%甲醇、50%甲醇3種溶劑，結(jié)果表明50%甲醇為溶劑的色譜峰峰形優(yōu)于其他2種溶劑。又考察超聲提取10，20，40，60 min，結(jié)果表明超聲提取20 min相對(duì)峰面積較大。

24色譜條件的優(yōu)選

流動(dòng)相的選擇分別考察了甲醇水、乙腈水、甲醇01%甲酸水、乙腈01%甲酸水及梯度洗脫條件下對(duì)樣品中各峰分離度的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用乙腈01%甲酸水溶液梯度洗脫時(shí)，峰型較好且有良好的分離效果。最終確定了最佳的色譜條件。

25樣品分析

根據(jù)設(shè)定的液相色譜質(zhì)譜條件，取供試品溶液進(jìn)樣分析。不同產(chǎn)地杜仲樣品在負(fù)離子模式下的LCQTOF MS/MS基峰強(qiáng)度離子流（BPI）色譜圖，見(jiàn)圖1。

26多元統(tǒng)計(jì)分析

將原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)和色譜圖導(dǎo)入Peakview 12進(jìn)行峰匹配、峰對(duì)齊、濾噪處理等，結(jié)果導(dǎo)入SIMCAP 130進(jìn)行分析。采用主成分分析（PCA），通過(guò)初步觀察各樣品的聚集情況，直觀地表達(dá)不同產(chǎn)地杜仲的化學(xué)組成差異；隨后以偏最小二乘辨別分析（PLSDA）分別對(duì)各樣品進(jìn)行分類(lèi)，其中R2X，R2Y越接近1表示模型越穩(wěn)定，Q2 >05表示預(yù)測(cè)率高。根據(jù)PLSDA模型得到的變量權(quán)重值（VIP >1）找到潛在的差異化學(xué)成分。采用t檢驗(yàn)，驗(yàn)證多維統(tǒng)計(jì)中找到的差異化學(xué)成分是否在單維統(tǒng)計(jì)中具有顯著性差異，其中P<005有顯著性差異。

261PCA分析主成分分析也稱(chēng)為主分量分析，旨在利用降維的思路將原來(lái)變量重新組合成一組新的互相無(wú)關(guān)的幾個(gè)綜合變量，同時(shí)根據(jù)實(shí)際情況從中選取幾個(gè)較少的綜合變量，盡可能多的反映原來(lái)變量信息的統(tǒng)計(jì)方法。采用PCA多變量模式識(shí)別方法對(duì)3個(gè)產(chǎn)地杜仲樣品進(jìn)行降維分析。3個(gè)產(chǎn)地杜仲PCA分析的散點(diǎn)圖（t[1]：680%；t[2]：239%），見(jiàn)圖2，可以看出，3個(gè)產(chǎn)地杜仲樣品分布在不同區(qū)域，分類(lèi)結(jié)果較為理想，說(shuō)明3個(gè)產(chǎn)地的杜仲樣品的化學(xué)成分存在明顯差異。

262PLSDA分析PLSDA分析是一種有監(jiān)督的模式識(shí)別方法，本文中用于確定不同產(chǎn)地杜仲之間的差異變量，即差異化學(xué)成分。常用變量載荷評(píng)價(jià)參數(shù)（VIP）值用于描述變量的貢獻(xiàn)程度，一般認(rèn)為當(dāng)VIP >1時(shí)，該變量是重要的。首先對(duì)貴州湄潭和湖北利川2個(gè)產(chǎn)地的杜仲樣品進(jìn)行PLSDA分析，在散點(diǎn)圖中2個(gè)產(chǎn)地的樣品可以明顯的分開(kāi)，見(jiàn)圖3a。模型驗(yàn)證結(jié)果（R2Y=0999，Q2=0999）顯示其有效可靠。與無(wú)監(jiān)督模式的主成分分析（PCA）相比較，2個(gè)產(chǎn)地的杜仲樣品得到更大程度的分離，且有助于尋找差異的化學(xué)成分。VIP的得分圖見(jiàn)圖3b顯示，對(duì)2組分類(lèi)貢獻(xiàn)較大的差異性成分（VIP>1）的共有114個(gè)特征峰。

對(duì)貴州湄潭和陜西寧強(qiáng)2個(gè)產(chǎn)地的杜仲樣品進(jìn)行PLSDA分析，2個(gè)產(chǎn)地的樣品區(qū)分明顯，見(jiàn)圖4a。模型驗(yàn)證結(jié)果（R2Y=0999，Q2=0999）證明其可靠程度較高。根據(jù)VIP得分圖，見(jiàn)圖4b，所示對(duì)2組分類(lèi)貢獻(xiàn)較大的差異性成分（VIP>1），得到99個(gè)特征峰。

對(duì)湖北利川和陜西寧強(qiáng)的杜仲樣品進(jìn)行PLSDA分析，在其散點(diǎn)圖中兩者可以明顯得到區(qū)分，見(jiàn)圖5a。模型驗(yàn)證顯示其有效可靠（R2Y=0999，Q2=0998），同樣對(duì)VIP得分圖，見(jiàn)圖5b，進(jìn)行考察，得到119個(gè)特征峰。

27差異化學(xué)成分的鑒定

通過(guò)一級(jí)質(zhì)譜確定精確相對(duì)分子質(zhì)量，二級(jí)質(zhì)譜獲得裂解信息，結(jié)合HMDB（http： //www hmdb ca/）和METLIN（http： //metlin Scripps edu /）數(shù)據(jù)庫(kù)搜索、對(duì)照品比對(duì)及已報(bào)道文獻(xiàn)[922]對(duì)VIP>1且P<005的差異化學(xué)成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，初步鑒定出23個(gè)化學(xué)成分，結(jié)果見(jiàn)表1。

28共有差異化學(xué)成分的相對(duì)含量變化

所分析的3個(gè)不同產(chǎn)地杜仲樣品中共有14個(gè)為共有差異化學(xué)成分，提取各共有差異成分在各組樣品間對(duì)應(yīng)的峰面積代表其相對(duì)含量，對(duì)不同產(chǎn)地杜仲樣品間同一物質(zhì)峰面積的平均值標(biāo)準(zhǔn)差進(jìn)行計(jì)算，得到共有差異成分在不同產(chǎn)地杜仲間的相對(duì)含量變化，見(jiàn)圖6。其中除咖啡酸和松脂醇單葡萄糖苷含量以陜西寧強(qiáng)產(chǎn)的較高，積雪草酸以湖北利川產(chǎn)較高外，桃葉珊瑚苷、京尼平苷酸、新綠原酸、橄欖素二葡萄糖苷、綠原酸、隱綠原酸、1羥基松脂素二葡萄糖苷、松脂醇二葡萄糖苷、丁香素二葡萄糖苷、杜仲醇和異綠原酸C均以貴州湄潭產(chǎn)的含量較高。

3討論

建立了基于LCQTOF MS/MS結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析技術(shù)的不同產(chǎn)地杜仲化學(xué)成分差異的分析方法，并從樣品制備、色譜圖分析、數(shù)據(jù)處理等方面進(jìn)行探討。PCA分析結(jié)果顯示不同產(chǎn)地杜仲樣品在PCA軸上呈逐步變化的趨勢(shì)，可以看出3個(gè)產(chǎn)地杜仲樣

品分布在不同區(qū)域，分類(lèi)結(jié)果較為理想，說(shuō)明3個(gè)產(chǎn)地的杜仲樣品的化學(xué)成分存在明顯差異。所鑒定的3個(gè)不同產(chǎn)地杜仲樣品中的23個(gè)差異化學(xué)成分中有14個(gè)為共有差異化學(xué)成分，分別為：桃葉珊瑚苷、

京尼平苷酸、新綠原酸、橄欖素二葡萄糖苷、綠原酸、隱綠原酸、1羥基松脂素二葡萄糖苷、咖啡酸、松脂醇二葡萄糖苷、丁香素二葡萄糖苷、松脂素單葡萄糖苷、杜仲醇、異綠原酸C和積雪草酸。其中，松脂醇二葡萄糖苷為2015年版《中國(guó)藥典》中杜仲的含量測(cè)定質(zhì)量評(píng)價(jià)指標(biāo)，松脂醇二葡萄糖苷相對(duì)含量以貴州湄潭產(chǎn)的較高，其他共有差異化學(xué)成分，除咖啡酸和松脂素單葡萄糖苷含量以陜西寧強(qiáng)產(chǎn)的較高，積雪草酸以湖北利川產(chǎn)較高外，均以貴州湄潭產(chǎn)的含量較高。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為揭示生態(tài)環(huán)境對(duì)杜仲代謝產(chǎn)物合成積累的影響規(guī)律以及探討杜仲藥材的品質(zhì)形成機(jī)制提供基礎(chǔ)資料。

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[責(zé)任編輯丁廣治]