劉茜 劉興辰 嚴(yán)小莉 高靜賢江蘇省醫(yī)療器械檢驗(yàn)所 （江蘇 南京 210022）

次氯酸傷口抗菌液體敷料的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測方法探討

劉茜 劉興辰 嚴(yán)小莉 高靜賢＊江蘇省醫(yī)療器械檢驗(yàn)所 （江蘇 南京 210022）

目的：探討次氯酸傷口抗菌液體敷料的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測方法。方法：依據(jù)《中華人民共和國藥典》2015 年版1143 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，考察次氯酸傷口抗菌液體敷料對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的干擾作用，確定其最大不干擾濃度。結(jié)果：次氯酸傷口抗菌液體敷料在稀釋8倍時對細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)無干擾作用，其細(xì)菌內(nèi)毒素限值符合規(guī)定。結(jié)論：使用鱟試劑檢查次氯酸傷口抗菌液體敷料的細(xì)菌內(nèi)毒素是可行的。

次氯酸傷口抗菌液體敷料 細(xì)菌內(nèi)毒素

次氯酸作為抗菌劑，現(xiàn)已廣泛用于牙科的抗菌治療[1]。研究證明，即便是沒有進(jìn)行手術(shù)清創(chuàng)處理，只是用次氯酸沖洗溶液進(jìn)行治療，傷口也可很快恢復(fù)且不留疤痕，所以可以將次氯酸用于傷口抗菌處理[2]。本文參照《中華人民共和國藥典》[3]2015年版1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，來確定次氯酸傷口抗菌液體敷料的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法。

1.資料與方法

1.1 一般資料

樣品：①次氯酸傷口抗菌液體敷料（0.01%次氯酸溶于（W/W）150mM氯化鈉溶液），批號：16110811，國內(nèi)某公司生產(chǎn)。②細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品（中國食品藥品檢定研究院，規(guī)格：80EU/支，批號：150601-201681）。③細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水（以下簡稱BET水）（中國食品藥品檢定研究院，規(guī)格：5mL/支，批號：160006-201401；湛江安度斯生物有限公司，規(guī)格：100mL，批號：1609280）。④鱟試劑（以下簡稱TAL）（湛江安度斯生物有限公司，規(guī)格：0.1mL/支，批號：1606061，標(biāo)示靈敏度：0.25EU/mL；福州新北生化工業(yè)有限公司，規(guī)格：0.1mL/支，批號：16040612，標(biāo)示靈敏度：0.25EU/mL）。

儀器：混和器（天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠，ZH-2），細(xì)菌內(nèi)毒素凝膠法測定儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司，ET-96），潔凈工作臺（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，SW-CJ-2F），隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（天津市泰斯特儀器有限公司，規(guī)格：GH6000），電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司，DHG-143BS-II）

1.2 方法

復(fù)核鱟試劑靈敏度：按《中華人民共和國藥典》[3]2015年版1143細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法復(fù)核TAL靈敏度。所用兩個廠家的TAL標(biāo)示靈敏度λ為0.25 EU/mL。

樣品的最大有效稀釋倍數(shù)：參照次氯酸傷口抗菌液體敷料的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，及其他相關(guān)文獻(xiàn)，本品內(nèi)毒素限值定為2.0EU/mL[4,5]。樣品的最大有效稀釋倍數(shù)（MVD）按下式進(jìn)行計(jì)算：MVD=L/λ，其中L為次氯酸傷口抗菌液體敷料的細(xì)菌內(nèi)毒素限值；λ為TAL標(biāo)示靈敏度。目前市售TAL靈敏度一般在0.03～0.50EU/mL，則次氯酸傷口抗菌液體敷料的對應(yīng)有效稀釋倍數(shù)為：MVD0.5=2/0.5=4倍；MVD0.25=2/0.25=8倍；MVD0.125=2/0.125=16倍；MVD0.06=2/0.5=32倍；MVD0.03=2/0.03=64倍。所以樣品在對應(yīng)不同靈敏度TAL時的最大有效稀釋倍數(shù)分別為4、8、16、32、64倍。

干擾試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)：將樣品用BET水稀釋成4、8、16、32、64倍。用系列稀釋溶液加入細(xì)菌內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液，使不同稀釋倍數(shù)溶液中均含有2λ濃度（0.5EU/mL）的內(nèi)毒素[3,6]。每一濃度設(shè)兩管，與靈敏度為0.25 EU/mL的TAL進(jìn)行反應(yīng)，設(shè)陰性（NC）和陽性（PC）對照管，混勻后封口，37?C恒溫60 min。

正式干擾試驗(yàn)：按《中華人民共和國藥典》[3]2015年版1143進(jìn)行正式干擾試驗(yàn)，分別用BET水及樣品8倍稀釋液將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品配制成濃度為2λ、λ、0.5λ、 0.25λ的溶液，每一濃度設(shè)四管，與靈敏度（λ）為0.25 EU/mL的TAL進(jìn)行反應(yīng)，設(shè)BET水陰性（NC）和樣品陰性（NPC）對照管，混勻后封口，37?C恒溫60 min。

樣品檢測：將樣品用BET水制成8倍稀釋液，用此濃度稀釋液將內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為2λ濃度的溶液，作為樣品陽性對照，用靈敏度（λ）為0.25EU/mL的TAL按《中華人民共和國藥典》[3]2015年版1143進(jìn)行細(xì)菌內(nèi)毒素檢查。

2.結(jié)果

2.1 鱟試劑靈敏度的復(fù)核

TAL靈敏度試驗(yàn)結(jié)果見表1。

2批TAL的λc均在0.5～2.0λ，表明2批TAL靈敏度均符合規(guī)定，可用于細(xì)菌內(nèi)毒素檢查，并以λ作為該批TAL的靈敏度。

2.2 干擾試驗(yàn)預(yù)試驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1. 靈敏度復(fù)核結(jié)果

表2. 干擾預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3. 正式干擾試驗(yàn)的結(jié)果

表4. 銀離子傷口敷料的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查結(jié)果

預(yù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，樣品濃度在4倍稀釋時對TAL與內(nèi)毒素的反應(yīng)有抑制作用，樣品濃度在8～64倍的稀釋范圍內(nèi)對TAL與內(nèi)毒素的反應(yīng)無干擾。筆者選用2個廠家的TAL進(jìn)行比較，證明不同廠家的樣品結(jié)果一致。

2.3 正式干擾試驗(yàn)

試驗(yàn)結(jié)果見表3。

結(jié)果表明，選用兩個廠家的TAL，8倍的樣品稀釋液均無干擾作用。Es（用BET水制成的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值）均在0.5～2.0λ，Et（用樣品稀釋液制成的內(nèi)毒素溶液的反應(yīng)終點(diǎn)濃度的幾何平均值均）在0.5～2.0Es，說明樣品8倍稀釋液對細(xì)菌內(nèi)毒素試驗(yàn)無干擾作用，該樣品可以采用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法進(jìn)行檢測。

2.4 樣品檢測

試驗(yàn)結(jié)果見表4。

結(jié)果表明，該樣品的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查是符合規(guī)定的，即樣品中的細(xì)菌內(nèi)毒素含量小于2EU/mL。

3.討論

熱原試驗(yàn)是用于檢測醫(yī)療器械或材料浸提液安全性評價的重要試驗(yàn)之一。熱原試驗(yàn)常用的兩種方法是細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法和家兔法[7]。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法相對于家兔法具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、快速簡便等優(yōu)點(diǎn)。但樣品能否采用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的先決條件之一是樣品經(jīng)過一定處理?xiàng)l件下，在滿足限度檢查要求的濃度下不干擾鱟試劑與內(nèi)毒素產(chǎn)生特異性凝聚反應(yīng)。

在進(jìn)行干擾試驗(yàn)時發(fā)現(xiàn)樣品濃度在4倍稀釋時對TAL與內(nèi)毒素的反應(yīng)有干擾，樣品濃度在8～64倍的稀釋范圍內(nèi)對TAL與內(nèi)毒素的反應(yīng)無干擾，說明可以通過稀釋法避免對細(xì)菌內(nèi)毒素法的干擾作用[8]。所以可以用本方法來次氯酸傷口抗菌液體敷料的細(xì)菌內(nèi)毒素含量。

[1] 馬楠, 仇麗鴻. 次氯酸鈉影響牙本質(zhì)黏結(jié)的研究進(jìn)展[J]. 中國實(shí)用口腔科雜志, 2016,9(9):570-573.

[2] Crew J, Varilla R, Rocas TA, et al. Treatment of Acute Necrotizing Fasciitis Using Negative Pressure Wound Therapy and Adjunctive Neutro Phase Irrigation Under theFoam[J]. Wounds, 2013,25(10):272-277.

[3] 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典:2015年版四部[M]. 北京:中國醫(yī)藥科技出版社, 2015:154-157.

[4] GB/T16886.12-2005,醫(yī)療器械生物學(xué)評價第12部分:樣品制備與參照樣品[S]. 北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社, 2005.

[5] 陳丹丹, 付海洋, 付步芳. 納米銀婦女外用抗菌凝膠的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測[J]. 生物醫(yī)學(xué)工程與臨床, 2010,14(4):282-284.

[6] 王欣放. 清開靈注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的建立[J]. 中國當(dāng)代醫(yī)藥, 2012,19(21):81-83.

[7] 鄒文, 袁暾, 蔡永福, 等. 家兔法與內(nèi)毒素法檢查生物材料熱原的適用性研究[J]. 生物醫(yī)學(xué)工程研究, 2011,30(3):155-158.

[8] 何進(jìn), 高軍, 陳金旺. 凝膠法細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的干擾因素及消除[J]. 中國藥師, 2010,13(2):284-287.

Bacterium Endotoxin Test for Hypochlorite Wound Antisepti Dressing

LIU Qian LIU Xing-chen YAN Xiao-li GAO Jing-xian＊Jiangsu Province Institute for MedicaL Equipment Testing (Jiangsu Nanjing 210022)

Objective: To research the reviewed method of bacterium endotoxin test method for hypochlorite wound antisepti dressing. Method: The bacterium endotoxin tests were performed to detect valid dilution concentration and limit value according to the Chinese Pharmacopoeia 2015 edition. Result: The diluent of sample which was diluted 8 times didn’t disturb the bacterium endotoxin test and the limit value accord with demand. Conclusion: This method of bacterial endotoxin detection can ensure that hypochlorite wound antisepti dressing meet the requirements.

hypochlorite wound antisepti dressing, bacterium endotoxin

1006-6586(2017)11-0061-03

R197.39

A

2017-03-02