葉藝旺，烏 達，劉繼先，吳 昊

（北京大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518036）

·實驗研究·

FasL和Caspase-8蛋白表達及Caspase-8基因甲基化在非小細胞肺癌中的應(yīng)用價值研究

葉藝旺，烏 達△，劉繼先，吳 昊

（北京大學(xué)深圳醫(yī)院，廣東 深圳 518036）

目的 探討FasL和Caspase－8蛋白表達及Caspase－8基因甲基化在非小細胞肺癌中的應(yīng)用價值。方法 選取手術(shù)切除的非小細胞肺癌患者100例，均分別切除癌組織和癌旁組織（以腫瘤為中心6 cm為半徑的肺組織），其中肺鱗癌55例，肺腺癌30例，肺腺鱗癌15例；低分化癌50例，中分化癌30例，高分化癌20例；伴有淋巴轉(zhuǎn)移65例，無淋巴轉(zhuǎn)移35例。另取正常肺內(nèi)組織100例進行對照。采用免疫組化S－P染色法檢測非小細胞肺癌標(biāo)本FasL和Caspase－8蛋白表達；采用甲基化特異性聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測非小細胞肺癌組患者的Caspase－8基因甲基化狀態(tài)。結(jié)果 FasL蛋白主要散布在腫瘤細胞漿液中，少數(shù)排列在細胞膜上；Caspase－8蛋白散布于細胞漿液中。在非小細胞肺癌中，F(xiàn)asL蛋白及Caspase－8蛋白存在不同程度的陽性表達，F(xiàn)asL蛋白陽性表達率明顯大于癌旁組織和正常組織，在肺腺癌的陽性表達率明顯大于鱗癌及腺鱗癌（P＜0.05），在低分化癌中的陽性表達率明顯大于中分化癌及高分化癌，伴淋巴轉(zhuǎn)移FasL蛋白陽性率大于非淋巴轉(zhuǎn)移，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而Caspase－8蛋白陽性表達率明顯小于癌旁組織和正常組織，在肺腺癌的陽性表達率明顯小于鱗癌及腺鱗癌，在高分化癌中的陽性表達率明顯大于中分化癌及低分化癌，伴淋巴轉(zhuǎn)移Caspase－8蛋白陽性率低于非淋巴轉(zhuǎn)移，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。癌組織Caspase－8基因甲基化率明顯大于癌旁組織和正常組織，在肺腺癌的陽性表達率明顯大于在鱗癌及腺鱗癌的陽性表達率，在低分化癌中的陽性表達率明顯大于中分化癌及高分化癌，伴淋巴轉(zhuǎn)移Caspase－8基因甲基化陽性率高于非淋巴轉(zhuǎn)移，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論 非小細胞肺癌中出現(xiàn)FasL蛋白高表達和Caspase－8基因高甲基化的變化，加快肺癌細胞與免疫細胞聯(lián)合的速率，抑制免疫細胞的活性，致使腫瘤內(nèi)部形成無免疫區(qū)域而促進腫瘤細胞的分裂和滋長，成為腺癌較易發(fā)生早期轉(zhuǎn)移的重要原因。Caspase－8蛋白在鱗癌中表達增高，這是鱗癌預(yù)后較好的主要因素，也是判斷非小細胞肺癌預(yù)后的重要指標(biāo)之一。Caspase－8參與了非小細胞肺癌的演變，與非小細胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系，作為非小細胞肺癌預(yù)后的重要指標(biāo)，為臨床對非小細胞肺癌進行綜合性、針對性的治療提供了重要理論依據(jù)。

FasL蛋白表達；Caspase－8蛋白表達；Caspase－8基因甲基化；非小細胞肺癌

近年來，肺癌的發(fā)病率高、死亡率高，已成為嚴(yán)重危害我國人民健康的惡性腫瘤[1－2]，而非小細胞肺癌占肺癌的80%～85%。惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展與機體的免疫系統(tǒng)有直接關(guān)系，腫瘤宿主的免疫功能缺失，會加快腫瘤的滋長和分裂速度[3]。臨床常將提高機體免疫功能、促進免疫細胞活性及加快腫瘤細胞凋亡速率歸結(jié)為治療腫瘤的三大有效方法[4－5]。有研究顯示，細胞的凋亡主要通過線粒體途徑及由細胞膜參與凋亡的死亡受體途徑[6－7]。在后一種途徑中，F(xiàn)asL發(fā)揮了重要作用，其能和Fas聯(lián)合使其凋亡。以Caspase－8為核心的Caspase家族是凋亡過程中重要的催化劑，Caspase－8參與了凋亡反應(yīng)的整個過程，發(fā)揮了不容小覷的作用[8]。另有研究顯示，在腫瘤細胞滋長期間，DNA甲基化能作用于DNA和蛋白，并影響二者間的相互聯(lián)系，破壞其組成，進而阻礙基因轉(zhuǎn)錄的速度[9－10]。本研究中通過對人體非小細胞肺癌各組織、類型、分化程度及伴隨淋巴轉(zhuǎn)移中FasL和Caspase－8蛋白的表達情況和Caspase－8基因甲基化狀態(tài)進行研究，探究FasL和Caspase－8蛋白表達及Caspase－8基因甲基化在非小細胞肺癌中的應(yīng)用價值，為臨床指導(dǎo)治療提供科學(xué)依據(jù)?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

標(biāo)本選?。哼x取2015年1月至2016年4月我院確診為非小細胞肺癌并行手術(shù)切除的患者100例，手術(shù)切除后立即進行標(biāo)本采集，癌旁組織是以腫瘤為中心、6 cm為半徑的肺組織。將標(biāo)本隨機分為2份，一份經(jīng)液氮冷凍10min后置－80℃冰柜中儲存；另一份以10%的福爾馬林和石蠟包藏，連續(xù)切片后進行HE染色，遵照世界衛(wèi)生組織（WHO）頒布的《肺腫瘤組織學(xué)分型》[11]對切片進行分類。100例患者中，男65例，女35例；年齡（59.4±10.3）歲；鱗癌55例，腺癌30例，腺鱗癌15例；低分化癌50例，中分化癌30例，高分化癌20例；伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移65例，不伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移35例。同時取正常肺組織（距癌旁組織1 cm外）100例作為對照。

納入標(biāo)準(zhǔn)[12]：入院前未進行針對性治療；未進行免疫治療；手術(shù)前進行頭、胸等部位CT檢查，排除癌細胞轉(zhuǎn)移可能；依從性良好，并簽署知情同意書；除癌組織外，其他部位均未發(fā)現(xiàn)癌細胞。

儀器與試劑：石蠟切片機（德國萊卡公司）；閉式自動脫水機，微量加樣器及恒溫水浴箱（上海醫(yī)療器械廠）；冰柜（西門子公司）；微波爐（美的公司）；離心管、臺式恒溫離心機及DNA熱循環(huán)儀（Eppendorf公司）；紫外分光光度計（美國Beckman公司）等。兔抗人FasL單克隆抗體，兔抗人Caspase－8多克隆抗體，兔抗鼠IgG多克隆抗體，S－P免疫染色試劑盒，APES丙酮稀釋液及DAB顯色劑，均由上海田源生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；組織DNA提取試劑盒和Caspase－8引物及糖原均由上海生工生物工程有限公司生產(chǎn)；SSSI酶由紐英倫生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 FasL和Caspase－8蛋白表達檢測

采用免疫組化S－P染色法。1）將免疫組化所需載玻片用洗滌液洗滌后，置弱酸中1 d，后用蒸餾水反復(fù)清洗，置75℃烤箱烘干[13]。2）將載玻片放入APES丙酮溶液（丙酮－蒸餾水＝1∶5）0.5min后再放入體積分?jǐn)?shù)為100%的丙酮溶液中清洗3次，后將載玻片用蒸餾水清洗干凈，常溫干燥，密封保存。3）將蓋玻片于弱酸中放置6 h后，先后用蒸餾水及無水乙醇清洗，常溫干燥，密封保存。4）將石蠟中包藏的切片放進65℃烤箱內(nèi)1 h，取出后立即置二甲苯中冷卻，連續(xù)進行2次，每次持續(xù)10～15 min。最后用3種體積分?jǐn)?shù)（100%，95%，75%）的乙醇對切片進行脫苯，再用蒸餾水清洗切片[14]。5）用體積分?jǐn)?shù)為30%的過氧化氫與蒸餾水以 1∶10的比例制備溶液，于室溫下孵育10min，再用蒸餾水連續(xù)清洗3次，后放入PBS溶液中5 min。6）將切片置枸櫞酸鈉弱酸溶液中，對其進行加熱，待溶液沸騰后冷卻，連續(xù)操作3次后用PBS緩沖液洗滌。7）滴加一抗：在切片上滴加兔抗人FasL單克隆抗體和兔抗人Caspase－8多克隆抗體稀釋液，置4℃的冰箱12 h，然后將切片取出，置室溫，用PBS清洗3次。8）滴加二抗：再滴加一定量的兔抗鼠IgG多克隆抗體，置 37.5℃的冰箱內(nèi) 15～20 min，再用 PBS溶液沖洗3次，保留一抗與二抗相結(jié)合部分。9）滴加辣根過氧化物酶對鏈霉素抗生素蛋白進行標(biāo)記，于室溫下孵育10min，再用 PBS清洗 3次。10）滴加 DAB顯色，用流水沖洗 10 min，再用蘇木素進行輕度復(fù)染，脫水，用中性樹膠封片，在高倍顯微鏡下進行觀察。

1.2.2 組織標(biāo)本DNA提取

1）取 50 mg組織碎塊，置 2 mL離心管中，加入20μL ZZZ－1緩沖液和25μLOB蛋白酶，混勻后放入50℃恒溫水浴鍋中12 h，待離心管中液體完全裂解后，以10 000 r／min的速率離心1min，離心結(jié)束后取上清液置新的離心管中。2）向上清液離心管中加入220μL ZZ－2緩沖液漩渦混勻，置65℃水溫箱中15min，再滴入與ZZ－2等量的無水乙醇，混均。3）將混合液導(dǎo)入裝在收集試管上的Mu－Pu分離柱內(nèi)，以8 000 r／min的速率離心1min，棄流出液和收集管；另取1支新的收集管，將柱子裝在收集管內(nèi)，滴入 DNA洗滌緩沖液（經(jīng)720μL稀釋），以8 000 r／min的速率離心1min，棄流出液和收集管；再取1支新的收集管，將柱子裝在收集管內(nèi)，滴入DNA洗滌緩沖液（經(jīng)720μL稀釋），以8 000 r／min的速率離心1min，棄流出液，再以12 000 r／min的速率高速離心2min。4）將柱子置小離心管中，用70℃的雙蒸水進行預(yù)熱，室溫下放置5min后，以8 000 r／min的速率離心1min，最后將流出液脫出。取等量等溫度的雙蒸水置柱子中，下接小離心管，室溫下放置5min后，以8 000 r／min的速率離心1 min，再將流出液脫出，將2次流出液混勻。5）取8μL DNA溶液，置600μL雙蒸水中，測定260 nm與280 nm波長處的吸光度值，計算DNA濃度，再將DNA平均分成2份，分別置EP管內(nèi)，于－20℃儲存。

1.2.3 DNA的亞硫酸化修飾

向質(zhì)量濃度為2 000 ng／L的DNA溶液中加入去離子水和3 mol／L NaOH 5.5μL，于42℃水浴中靜置30 min，后加入30μL的10 mmol／L氫醌和510μL的3.9mol／L亞硫酸氫鈉（NaHSO3），最后加入14.5μL去離子水至總體積為610μL。將上述液體混合均勻后離心，再滴入適量石蠟油，避光水浴中保存15 h。

1.2.4 DNA的純化

1）將上述溶液去除油層，留下0.5 m L，加入1 mL純化樹脂搖晃均勻，將混合液倒入下接EP管的一次性注射針管內(nèi)，塞進針管活塞使混合物透過濾過柱，讓DNA黏附于樹脂上。2）用相同方法使2mL異丙醇透過濾過柱并進行洗滌。3）濾過柱連接離心管，于室溫下以13 000 r／min的速率離心2min，將樹脂干燥。再將濾過柱與新的離心管連接，向濾過柱中加入60℃左右的超凈水，以13 000 r／min的速率離心2min，洗脫DNA后，放入EP管內(nèi)。4）加入5μL濃度為0.3mol／L的NaOH溶液和33μL的10mol／L乙酸胺，使溶液的pH提示為中性，后將溶液濃度濃縮至3 mol／L，加入1μL糖原，再注入3μL無水乙醇，置－20℃冰箱中靜置12 h，使得DNA完全沉淀。5）以14 000 r／min的速率離心20min后取上清液，用75%乙醇清洗，再以12 000 r／min的速率離心5 min，將管壁液體去除后自然干燥，最后用30μL超凈水懸浮 DNA，于 －20℃環(huán)境密封儲存。6）Caspase－8甲基化引物及非甲基化引物均由上海生物工程公司合成。

1.2.5 瓊脂糖凝膠PCR產(chǎn)物的電泳

在微波爐中將 2%的瓊脂糖凝膠溶解[15]，冷卻至55℃后加入質(zhì)量濃度為10 g／L的溴化乙錠，混勻后制成凝膠，待其完全凝固后置TBE緩沖液中電泳，另取5μL PCR擴增物置緩沖液中，按5∶1的比例充分混合，置2%瓊脂糖凝膠孔中，電泳30min后用紫外線觀察目標(biāo)條帶，攝影，記錄。

1.3 結(jié)果評定標(biāo)準(zhǔn)

免疫組化S－P染色結(jié)果：用PBS代替一抗設(shè)為陰性空白對照，已知肺癌陽性表達淋巴細胞為陽性對照，F(xiàn)asL蛋白主要遍布在腫瘤細胞漿液中，少數(shù)排列在細胞膜上，而Caspase－8蛋白則分布于細胞漿液中，陽性顯色呈棕黃色，依據(jù)腫瘤組織細胞的染色強度進行判斷。若整張切片上無棕黃色細胞，且細胞數(shù)少于25%，則為陰性；若染色細胞數(shù)介于25%～50%，則為弱陽性；若染色細胞數(shù)介于50%～75%，則為陽性；若染色細胞數(shù)大于75%，則為強陽性。

甲基化性質(zhì)：PCR擴增后，若出現(xiàn)甲基化引物擴增條帶，則說明發(fā)生了甲基化，若無條帶，則說明未發(fā)生甲基化；全部形成甲基化產(chǎn)物，稱之為完全甲基化；除甲基化產(chǎn)物外還有剩余未甲基化的產(chǎn)物，稱之為部分甲基化；若完全沒有甲基化產(chǎn)物，則稱之為無甲基化。本研究中將完全甲基化和部分甲基化均歸為甲基化陽性。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 FasL和Caspase－8蛋白的表達

不同癌組織：FasL蛋白主要遍布腫瘤細胞漿液中，少數(shù)排列在細胞膜上，陽性表達率明顯高于癌旁組織和正常肺組織；Caspase－8蛋白則散布于細胞漿液中，陽性表達率顯著低于癌旁組織和正常肺組織。各組間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表1。

表1 非小細胞肺癌各組織中FasL和Caspase－8蛋白陽性表達率s，%，n＝100）

表1 非小細胞肺癌各組織中FasL和Caspase－8蛋白陽性表達率s，%，n＝100）

注：與癌組織比較，*P＜0.05；與癌旁組織比較，△P＜0.05。

不同癌組織類型：FasL蛋白在肺腺癌中的表達水平明顯高于鱗癌和腺鱗癌，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；Caspase－8蛋白在肺腺癌中的表達水平明顯低于鱗癌和腺鱗癌，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表2。

表2 非小細胞肺癌各組織類型中FasL和Caspase－8蛋白陽性表達率（s，%）

表2 非小細胞肺癌各組織類型中FasL和Caspase－8蛋白陽性表達率（s，%）

注：與腺癌比較，*P＜0.05；與鱗癌比較，△P＜0.05。

?

不同癌分化程度：FasL蛋白在低分化癌中的表達水平最高，顯著高于中、高分化癌，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；Caspase－8蛋白在低分化癌中的表達水平最低，顯著低于中、高分化癌，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表3。

表3 非小細胞肺癌各分化程度中FasL和Caspase－8蛋白陽性表達率（s，%）

表3 非小細胞肺癌各分化程度中FasL和Caspase－8蛋白陽性表達率（s，%）

注：與低分化組比較，*P＜0.05；與中分化組比較，△P＜0.05。

不同轉(zhuǎn)移情況：轉(zhuǎn)移淋巴組織中FasL蛋白陽性表達率高于無轉(zhuǎn)移淋巴組織，前者中Caspase－8蛋白陽性表達率低于后者，組間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表4。

表4 非小細胞肺癌淋巴組織中FasL和Caspase－8蛋白表達情況（±s，%）

表4 非小細胞肺癌淋巴組織中FasL和Caspase－8蛋白表達情況（±s，%）

注：與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組比較，*P＜0.05。

?

蛋白表達與腫瘤部位、性別和年齡的關(guān)系：中心型非小細胞肺癌中，F(xiàn)asL和Caspase－8蛋白陽性表達率均高于外周型非小細胞肺癌，但各組間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。對非小細胞肺癌組織中FasL 和Caspase－8蛋白表達與患者性別和年齡之間的關(guān)系進行分析，各組間比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表5。

表5 非小細胞肺癌組織中FasL和Caspase－8蛋白表達與腫瘤部位、性別和年齡的關(guān)系（±s，%）

表5 非小細胞肺癌組織中FasL和Caspase－8蛋白表達與腫瘤部位、性別和年齡的關(guān)系（±s，%）

注：各組組內(nèi)比較，*P＞0.05。

?

2.2 Caspase－8基因甲基化的表達

不同癌組織：癌組織中Caspase－8基因甲基化率顯著高于癌旁組織和正常肺組織，且癌組織和癌旁組織同正常肺組織相比，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表6。

不同癌組織類型：Caspase－8基因甲基化在腺癌中的表達率最高，明顯高于鱗癌和腺鱗癌，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表7。

表6 非小細胞肺癌不同組織中Caspase－8基因甲基化表達情況（n＝100）

表7 非小細胞肺癌不同組織類型中Caspase－8基因甲基化表達情況

不同癌分化程度：低分化非小細胞肺癌Caspase－8基因甲基化率明顯高于中分化及高分化非小細胞肺癌，組間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表8。

表8 非小細胞肺癌各分化程度中Caspase－8基因甲基化表達情況

不同轉(zhuǎn)移情況：伴有淋巴轉(zhuǎn)移組織中 Caspase－8基因甲基化的表達率明顯高于無淋巴轉(zhuǎn)移組織，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。詳見表9。

表9 非小細胞肺癌淋巴組織中Caspase－8基因甲基化表達情況

淋巴組織中甲基化表達與腫瘤部位、性別和年齡的關(guān)系：中心型非小細胞肺癌Caspase－8基因甲基化的表達率低于外周型非小細胞肺癌，但組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。對非小細胞肺癌組織中Caspase－8基因甲基化的表達率與患者性別和年齡之間的關(guān)系進行比較，各組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表10。

3 討論

3.1 非小細胞肺癌中FasL和Caspase－8蛋白的表達

FasL蛋白的檢測結(jié)果表明，非小細胞肺癌組織的陽性表達明顯高于正常組織和癌旁組織，其中以正常組織的表達率最低（P＜0.05）。另外，F(xiàn)asL在肺腺癌、肺鱗癌及肺腺鱗癌的表達，以肺腺癌為最高，其次為肺鱗癌及肺腺鱗癌（P＜0.05），表明在不同組織類型的癌癥中FasL存在表達差異。非小細胞肺癌的不同分化階段，F(xiàn)asL蛋白在低分化癌細胞的表達最高，在中分化及高分化癌細胞中的表達有所降低（P＜0.05），說明在不同分化階段，F(xiàn)asL的表達亦有差異性。非小細胞肺癌淋巴組織檢測結(jié)果表明，F(xiàn)asL蛋白在伴有淋巴轉(zhuǎn)移組的表達明顯高于無淋巴轉(zhuǎn)移組（P＜0.05）。對Caspase－8蛋白的檢測結(jié)果顯示，在非小細胞肺癌的陽性表達明顯低于正常組織和癌旁組織（P＜0.05），在肺腺癌、鱗癌及腺鱗癌的表達，以肺腺癌為最低，其次為肺腺鱗癌及肺鱗癌（P＜0.05），同時Caspase－8蛋白在高分化癌細胞的表達最高，在中分化及低分化癌細胞中的表達有所降低（P＜0.05），Caspase－8蛋白在伴有淋巴轉(zhuǎn)移組的表達低于于無淋巴轉(zhuǎn)移組（P＜0.05）。由表5可見，非小細胞肺癌腫瘤的發(fā)生部位及年齡、性別等一線資料與 FasL和 Caspase－8蛋白的表達關(guān)系不明顯（P＞0.05）。

表10 非小細胞肺癌淋巴組織中Caspase－8基因甲基化表達與腫瘤部位、性別和年齡的關(guān)系

研究結(jié)果顯示，F(xiàn)asL蛋白在肺腺癌中的表達率最高，這也是肺腺癌易早期轉(zhuǎn)移且病情最惡劣的主要原因[16]。腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與腫瘤細胞的無限增殖、過度轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，當(dāng)機體免疫細胞對腫瘤細胞的約束力受到控制，腫瘤細胞無法正常凋亡時，癌基因會被激活并過度表達，最終加快了癌癥的惡化速度。研究中發(fā)現(xiàn)，結(jié)合淋巴轉(zhuǎn)移組的FasL蛋白表達明顯高于無淋巴轉(zhuǎn)移組，說明FasL參與了腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的全過程，加快其轉(zhuǎn)移速度，幫助腫瘤細胞侵入機體淋巴等免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)靶器官細胞凋零，為轉(zhuǎn)移的腫瘤細胞制造了良好的滋長環(huán)境[17]。由此可見，非小細胞肺癌FasL蛋白表達與腫瘤轉(zhuǎn)移和惡化的關(guān)系不容小覷。與FasL的表達恰好相反，Caspase－8蛋白的檢測結(jié)果顯示，在非小細胞肺癌的陽性表達明顯低于正常組織和癌旁組織，同時在低分化的癌組織中亦有較低的表達率，由此推斷，非小細胞肺癌的惡化與Caspase－8蛋白失表達密切相關(guān)。Caspase－8蛋白在伴有淋巴轉(zhuǎn)移組的相對低表達，對非小細胞肺癌的惡化起到了負面的推動作用。本研究結(jié)果顯示，Caspase－8蛋白在肺鱗癌的高表達率也恰當(dāng)?shù)亟忉屃朔西[癌患者預(yù)后優(yōu)于腺癌和鱗癌的原因。另有研究顯示，利用免疫組化法對宮頸癌切片進行檢測發(fā)現(xiàn)，Caspase－8蛋白在宮頸癌中的表達程度明顯低于正常宮頸組織，隨著宮頸癌病理檢測分級的升高，Caspase－8蛋白的表達程度卻隨之降低[18]。由此推斷，Caspase－8蛋白在腫瘤中的失表達抑制了腫瘤細胞的凋亡，間接地加快了腫瘤細胞的分裂增生，促進了腫瘤的進展。

綜上所述，在非小細胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中，貫穿其中的是FasL蛋白和Caspase－8蛋白的表達與失表達。在腫瘤免疫細胞作用下，促使FasL蛋白的表達不斷升高，相反，Caspase－8蛋白的表達卻不斷降低。在腫瘤惡化過程中，F(xiàn)asL蛋白的高表達進一步打亂了細胞的內(nèi)循環(huán)，延緩腫瘤細胞的凋亡，同時壓制Caspase－8的表達，惡性循環(huán)下，最終FasL蛋白的高表達占據(jù)了主導(dǎo)地位，這也促使腫瘤細胞最大限度地逃避了機體免疫細胞的噬殺，從而導(dǎo)致了癌細胞的擴散。臨床，可根據(jù)檢測FasL蛋白與Caspase－8蛋白的表達程度，對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展程度和預(yù)后轉(zhuǎn)歸進行相應(yīng)推測。

3.2 非小細胞肺癌中Caspase－8基因甲基化的應(yīng)用

以人為代表的哺乳動物體內(nèi)均發(fā)生DNA甲基化，所謂甲基化即指以 S－腺苷甲硫氨酸為基本供體，以甲基轉(zhuǎn)移酶為催化劑，使發(fā)生復(fù)制反應(yīng)的DNA在CpG二核苷酸的胞嘧啶5′碳位共價鍵上形成1個甲基[19]。CpG通常有2種存在形式：一種存在于哺乳動物的DNA中，呈散在形式分布；另一種以CpG島的形式存在。人體內(nèi)的DNA甲基化是構(gòu)成染色質(zhì)的重要組成條件，其模式能通過模擬或遺傳方式而保持多維有序的存在[20]。從胚胎形成、細胞增殖、分裂、腫瘤的形成到機體的衰老，DNA甲基化在整個生長過程中占據(jù)了不可替代的位置[21]。甲基化在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中有兩方面的作用：一是在DNA復(fù)制時，胞嘧啶殘基的5位碳原子會被S－腺苷酰甲硫氨酸上的甲基所取代，使得甲基胞嘧啶轉(zhuǎn)化成為胸腺嘧啶，CpG二核苷酸轉(zhuǎn)化成TpG二核苷酸，此時的DNA結(jié)構(gòu)已被完全打破，嚴(yán)重影響了DNA分子、轉(zhuǎn)錄因子等蛋白的合成，進一步使基因的表達異常，從而影響正常的生理功能，最后發(fā)生突變直至喪失活性。其二，抑癌基因甲基化導(dǎo)致該基因沉默，CpG島高甲基化可使抑癌基因轉(zhuǎn)錄失去活性，喪失對腫瘤的抑制能力，進而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

可將Caspase家族分成三類：第一類是以激發(fā)Caspase家族其他成員為主要作用的凋亡起始組，包括Caspase－2，Caspase－8，Caspase－9和Caspase－10；第二類是以可在激發(fā)下發(fā)生自身凋亡的效應(yīng)組，包括Caspase－1，Caspase－4，Caspase－5，Caspase－12等；第三類是以參與炎性反應(yīng)為主要作用的炎癥組，包括Caspase－1，Caspase－4，Caspase－5，Caspase－12等[22]。作為第一類凋亡起始組的成員，Caspase－8可在源頭起到遏制腫瘤的作用。本研究通過PCR試驗方法可對Caspase－8基因甲基化進行高敏感度的檢測。研究結(jié)果顯示，Caspase－8蛋白基因的甲基化在非小細胞肺癌的陽性表達明顯高于正常組織和癌旁組織（P＜0.05），從而推測，Caspase－8基因的高甲基化與非小細胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展休戚相關(guān)，結(jié)合Caspase－8蛋白失表達的檢測結(jié)果，可以大膽推斷正是由于Caspase－8基因的高甲基化，才導(dǎo)致了Caspase－8蛋白的失表達，從而使非小細胞肺癌不斷惡化。在不同癌癥類型中，肺腺癌Caspase－8基因的甲基化程度最高，Caspase－8基因的甲基化程度與不同類型的肺癌亦有一定關(guān)系，這也證實了肺腺癌不良預(yù)后的臨床轉(zhuǎn)歸，臨床可根據(jù)Caspase－8基因的甲基化程度來判定非小細胞肺癌的預(yù)后。在不同分化程度的非小細胞肺癌中，Caspase－8基因的甲基化在低分化組中的表達最高（P＜0.05），說明Caspase－8基因甲基化在不同分化程度肺癌中有顯著差異。在是否伴有淋巴轉(zhuǎn)移的關(guān)于Caspase－8基因甲基化的分組檢測中，可通過伴有淋巴轉(zhuǎn)移組的甲基化高表達和結(jié)合Caspase－8蛋白低表達推斷，是由于Caspase－8高甲基化導(dǎo)致了 Caspase－8蛋白在淋巴轉(zhuǎn)移組的表達異常，故Caspase－8甲基化程度可作為診斷肺癌是否有淋巴轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)之一[23]。

綜上所述，Caspase－8表達下調(diào)的主要原因在于Caspase－8基因CpG島甲基化抑制了Caspase－8基因的表達，Caspase－8基因高甲基化可使該基因失去活性，無法形成Caspase－8蛋白，且Caspase－8基因甲基化的水平與Caspase－8蛋白的形成呈反比例關(guān)系，而Caspase－8蛋白的丟失使得腫瘤細胞的凋亡功能喪失，導(dǎo)致腫瘤細胞無休止地增生、分裂，進而大大提高了腫瘤的發(fā)生率。Caspase－8基因甲基化在臨床中可被廣泛應(yīng)用于對早期肺癌判定的重要指標(biāo)，也為非小細胞肺癌的轉(zhuǎn)歸和預(yù)后提供了良好的評判平臺，為非小細胞肺癌的綜合治療指引了新的方向。

[1]韓仁強，鄭榮壽，張思維，等.1989年－2008年中國肺癌發(fā)病性別、城鄉(xiāng)差異及平均年齡趨勢分析[J].中國肺癌雜志，2013，16（9）：445－451.

[2]姚曉軍，劉倫旭.肺癌的流行病學(xué)及治療現(xiàn)狀[J].現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2014，22（8）：1982－1986.

[3]楊露璐.非小細胞肺癌新的治療性靶點的探索[D].廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2014.

[4]李 艷，郭其森.晚期非小細胞肺癌維持治療進展[J].中華腫瘤防治雜志，2014，21（10）：800－804.

[5]王 帥.非小細胞肺癌分子標(biāo)志物的臨床意義及靶向治療相關(guān)研究[D].北京：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所，2014.

[6]羅 慧.AKT／β－catenin／FoxO3a信號通路在亞硒酸鈉誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細胞凋亡中機制研究[D].北京：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院，2013.

[7]石 萌.對Fas信號通路誘導(dǎo)胃腸道腫瘤產(chǎn)生EMT現(xiàn)象的研究及microRNA對其調(diào)控機制的分析[D].廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2014.

[8]劉 偉.乙型肝炎病毒核心蛋白（HBc）抑制Fas介導(dǎo)的肝細胞凋亡及機制[D].福州：福建醫(yī)科大學(xué)，2015.

[9]閻 瑾.Caspase－8及Caspase－3基因多態(tài)性與晚期非小細胞肺癌鉑類藥物化療敏感性研究[D].錦州：遼寧醫(yī)學(xué)院，2014.

[10]孫 曼.C－myc、Caspase－8在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義研究[D].鄭州：鄭州大學(xué)，2014.

[11]袁寧璐，趙 青，韓楚源，等.胸腺腫瘤WHO組織學(xué)分型與CT征象相關(guān)性分析[J].中國美容醫(yī)學(xué)，2012，21（8）：157－158.

[12]方楚玲，郭琳瑯.miRNA對肺癌化療耐藥調(diào)控研究進展[J].中華腫瘤防治雜志，2014，21（1）：72－76.

[13]張 強.非小細胞肺癌中FasL、Caspase－8蛋白的表達及Caspase－8基因甲基化的相關(guān)性研究[D].蘇州：蘇州大學(xué)，2012.

[14]呂 晉.石蠟包埋組織個體識別研究[D].廣州：南方醫(yī)科大學(xué)，2013.

[15]綦廷娜，劉志廣，王 濤，等.瓊脂糖凝膠電泳與核酸印跡雜交法檢測細菌毒力基因PCR產(chǎn)物的靈敏度比較研究[J].疾病監(jiān)測，2011，26（8）：651－653.

[16]劉瑞芬.凋亡相關(guān)基因P53、Fas／Fasl在非小細胞肺癌中的表達及臨床意義研究[D].鄭州：鄭州大學(xué)，2013.

[17]楊 芳，于 雁.腫瘤微環(huán)境——腫瘤轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素[J].中國肺癌雜志，2015，18（1）：48－54.

[18]劉帥斌，胡麗娜.腫瘤微環(huán)境與宮頸癌的研究進展[J].實用婦產(chǎn)科雜志，2014，30（8）：585－587.

[19]張 元 .早期阿爾茨海默病鼠模型（presenilin－1／presenilin－2雙基因敲除小鼠）海馬中甲基化致病基因的篩選研究[D].瀘州：四川醫(yī)科大學(xué)，2015.

[20]王瑞嫻，徐建紅.基因組DNA甲基化及組蛋白甲基化[J].遺傳，2014，36（3）：191－199.

[21]沈 圣，屈彥純，張 軍.下一代測序技術(shù)在表觀遺傳學(xué)研究中的重要應(yīng)用及進展[J].遺傳，2014，36（3）：256－275.

[22]何永勤.Flavopiridol協(xié)同 TRAIL誘導(dǎo)細胞凋亡的分子機制研究[D].北京：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院，2013.

[23]宗振峰，袁 君，楊 博，等.非小細胞肺癌中Caspase－8的表達及意義分析[J].中國醫(yī)藥導(dǎo)刊，2013，15（5）：761－762.

App lication Value of FasL，Caspase－8 Protein Expression and Caspase－8 Gene M ethylation in Non－Sm all Cell Lung Cancer

Ye Yiwang，Wu Da，Liu Jixian，Wu Hao
（Shenzhen Hospital of Peking University，Shenzhen，Guangdong，China 518036）

Objective To investigate the application value of FasL，Caspase－8 protein expression and Caspase－8 gene methylation in non－small cell lung cancer（NSCLC）.M ethods Totally 100 patients with NSCLC were selected，whose cancer tissues and paracancerous tissues（with tumor as the center of radius of 6 cm）were resected，among them；55 cases of pulmonary squamous cell carcinoma，30 cases of lung adenocarcinoma，and 15 cases of squamous cell carcinoma of the lung；50 cases were poorly differentiated carcinoma，30 cases were moderately differentiated carcinoma and 20 cases were highly differentiated carcinoma；there were 65 cases with lymph node metastasis，35 cases without lymph node metastasis，and 100 cases of normal lung tissue were taken as control.Immunohistochemical staining of S－P was used to detect the expression of FasL and Caspase－8 proteins in NSCLC specimens，methylation status of Caspase－8 gene in patients with NSCLC was detected by methylation specific polymerase chain reaction（PCR）.Resu lts FasL protein was mainly distributed in the serous layer of tumor cells，and a few were spread over the cell membrane.Caspase－8 protein distributed in the cell serous.In NSCLC，F(xiàn)asL protein and Caspase－8 protein in different degree of positive expression，the positive expression rate of FasL protein was significantly higher than those of adjacent tissues and normal tissues（P＜0.05），the positive expression in lung adenocarcinoma was significantly higher than those in squamous cell carcinoma and squamous cell carcinoma（P＜0.05），the positive expression rate in poorly differentiated carcinomas was obviously higher than those in moderately differentiated carcinoma and highly differentiated carcinoma（P＜0.05），the positive rate of FasL protein in lymph node metastasis was significantly lower than that in nonlymphatic metastasis（P＜0.05）.The positive expression rate of Caspase－8 protein was significantly lower than those of adjacent tissues and normal tissues（P＜0.05），the positive expression in lung adenocarcinoma was significantly lower than those in squamous cellcarcinoma and squamous cell carcinoma（P＜0.05），the positive expression rate in highly differentiated carcinomas was obviously higher than those in moderately differentiated carcinoma and poorly differentiated carcinoma（P＜0.05），the positive rate of Caspase－8 protein in lymph node metastasis was significantly lower than that in non－lymphatic metastasis（P＜0.05）.The rate of Caspase－8 gene methylation in cancer tissues was significantly higher than that in adjacent tissues and normal tissues，the positive expression in lung adenocarcinoma was significantly higher than in squamous cell carcinoma and squamous cell carcinoma,the positive expression rate in poorly differentiated carcinomas is obviously higher than that of moderately differentiated carcinoma and highly differentiated carcinoma, the positive rate of Caspase－8 gene methylation in lymph node metastasis was significantly lower than that in non－lymphatic metastasis(P＜0.05).Conclusion High expression of FasL protein and Caspase－8 gene hypermethylation in NSCLC can accelerate the rate of lung cancer cells and tumor cells in the joint，inhibit the activity of immune cells，result in tumor formation without immune region and promote tumor cell division and growth，which become an important cause of early metastasis of adenocarcinoma.The expression of Caspase－8 protein in squamous cell carcinoma is higher，which is the main prognostic factor of squamous cell carcinoma.It is also one of the important indexes to judge the prognosis of NSCLC.Caspase－8 is involved in the evolution of NSCLC，and is closely related to the occurrence，development and metastasis of NSCLC.As an important prognostic factor of NSCLC，Caspase－8 provides an important theoretical basis for the comprehensive and targeted treatment of NSCLC.

FasL protein expression；Caspase－8 protein expression；Caspase－8 gene methylation；non－small cell lung cancer

R730.4；R734.2

：A

：1006－4931(2017)12－0001－07

2017－03－10)

10.3969／j.issn.1006－4931.2017.12.001

2014年深圳市衛(wèi)生計生委系統(tǒng)科研項目[201401043]。

葉藝旺（1985－），博士研究生，主治醫(yī)師，研究方向為肺癌的診治，（電子信箱）yyw.ghl＠163.com。

△通訊作者：烏達，主任醫(yī)師，研究方向為肺癌的診治，（電子信箱）yywszyy＠163.com。