吳追樂，邱美榕

電針后血清對大鼠成骨細胞增殖活性的影響

吳追樂1，邱美榕2

（1.福建中醫(yī)藥大學針灸學院，福建福州350122；2.福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建福州350122）

目的觀察電針后血清對大鼠成骨細胞增殖活性的影響。方法取30只SD雌性大鼠按抽簽法隨機分為空白組、雌二醇組、電針組，每組各10只?？瞻捉M不做任何處理；雌二醇組以戊酸雌二醇后肢肌肉注射，每周1次，連續(xù)90 d；電針組取穴大杼（BL11）、命門（DU4）、足三里（ST36），電針干預15 min，每日1次，10次為1個療程，療程間休息5 d，共干預6個療程，持續(xù)90 d。90 d后，每組腹主動脈采血制備血清。另外，將新生24 h SD乳鼠麻醉斷頭處死，取下顱蓋骨，建立成骨細胞體外培養(yǎng)體系，培養(yǎng)至第3代時同步化后進行干預，采用MTT法分別確定電針后血清的有效干預時間及干預濃度?？瞻捉M、雌二醇組、電針組分別在有效濃度作用下干預成骨細胞，在有效干預時間點采用MTT法觀察成骨細胞的增殖。結(jié)果與24、48、96 h比較，干預72 h成骨細胞OD值高于其它3個時間點，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；10%電針后血清濃度組明顯高于5%、20%血清濃度組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。在10%血清濃度的作用下干預72 h，電針組第3代成骨細胞OD值高于雌二醇組（P＜0.05）。結(jié)論電針后血清能加速成骨細胞增殖，維持成骨細胞活性。

骨質(zhì)疏松癥；電針；血清；成骨細胞；細胞活性

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）屬中醫(yī)“骨痿”范疇，按照中醫(yī)“腎主骨生髓”的理論，腎虛是OP發(fā)病的首要病因［1］。目前醫(yī)學研究證實，中醫(yī)學的腎虛證與下丘腦-垂體-性腺軸功能降低密切相關，針灸可針對此軸的功能進行良性調(diào)節(jié)，穩(wěn)定體內(nèi)雌激素的水平，從而抑制骨吸收，增強骨形成，達到治療OP的作用［2］。前期研究證實，針刺能減少骨丟失，改善骨強度和超微結(jié)構(gòu)，對OP有防治作用［3-7］。本研究以“腎主骨”“骨會大杼”“腎為先天之本，脾為后天之本”理論為指導，以補腎健脾、溫陽通脈、強筋壯骨為治療原則，精選大杼（BL11）、命門（DU4）、足三里穴（ST36）治療。大杼（BL11）為八會穴之一，骨會大杼（BL11），強筋壯骨；命門（DU4）可培元補腎，強健腰膝（補先天）；足三里（ST36）有溫陽益氣，健脾益胃（補后天）之功效。將電針后血清引入成骨細胞增殖的研究中，觀察電針后血清影響成骨細胞增殖活性的作用機制。

1 實驗材料

1.1 實驗動物選用3月齡SD雌性大鼠30只，用于制備電針后血清；新生24 h的SD乳鼠10只，用于成骨細胞的培養(yǎng)和傳代。動物均購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司［許可證號：SCKK（滬）2012-0002］。福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供清潔級實驗動物環(huán)境及相關設施［許可證號：SYXK（閩）2014－ 0005］。所有實驗動物均嚴格按照國家機構(gòu)關于實驗動物衛(wèi)生指導使用及符合國際倫理準則，實驗獲得福建中醫(yī)藥大學動物保護委員會批準。

1.2 試劑和儀器Ⅰ型膠原酶（Invitrogen公司）；小牛血清-FBS、胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)液（Hyclone公司）；MTT﹑DMSO（Sigma公司）；戊酸雌二醇（廣州先靈藥業(yè)有限公司；批號：230B）。GBB16二氧化碳培養(yǎng)箱（上海力新實業(yè)有限公司）；SW-CJ-1F超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術公司）；ELX800酶標儀（美國BIO-Tek公司）；IX 70倒置式系統(tǒng)顯微鏡（日本太陽交易株式會社）；0.30 mm×13 mm毫針、電針儀（華佗SDZ-V；蘇州醫(yī)療用品廠有限公司）。

2 實驗方法

2.1 電針后血清的制備3月齡SD雌性大鼠30只，按抽簽法隨機分為3組，即：空白組、雌二醇組、電針組，每組各10只?？瞻捉M不做任何處理；雌二醇組以戊酸雌二醇后肢肌肉注射，按人鼠劑量換算，每只鼠每次肌注0.1 mg／kg，每周1次，連續(xù)90 d；電針組取穴大杼（BL11）、命門（DU4）、足三里（ST36），穴位常規(guī)消毒，毫針進針，采用提插捻轉(zhuǎn)行針手法，使用電針儀（脈沖強度10V，脈沖頻率8 Hz，連續(xù)波）進行電針干預15 min［8］，每日1次，10次為1個療程，療程間休息5 d，共干預6個療程，持續(xù)90 d。各組SD大鼠采血前禁食12 h，均于第90 d末次針刺1 h后在水合氯醛麻醉狀態(tài)下進行腹主動脈采血4～5 mL，分別單獨裝瓶。在離心機下以3000 r／min離心15 min，分離血清，恒溫水浴鍋56℃水浴，滅活30 min，經(jīng)0.22 μm濾膜抽濾除菌，分裝，－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 成骨細胞的培養(yǎng)將新生24 h的SD乳鼠麻醉后斷頭處死，無菌操作，切開皮膚及皮下組織，切下顱蓋骨，浸泡于DMEM培養(yǎng)液中，去除周圍軟組織、血管及骨膜，0.01 mol／L磷酸鹽緩沖液反復沖洗2次，剪成1 mm×1 mm大小置于25 mL培養(yǎng)瓶中，于37℃下，用2.5 g／L胰蛋白酶和Ⅰ型膠原酶混合液（1∶1）預消化20 min，棄消化液。再用Ⅰ型膠原酶消化，每20 min輕搖培養(yǎng)瓶1 min，消化2 h后用400目不銹鋼濾網(wǎng)收集消化液，去除骨片，用等體積的15%FBS DMEM培養(yǎng)液稀釋，余渣再加入Ⅰ型膠原酶消化1次，步驟同上，將2次收集的消化液1000 r／min離心5 min，棄上清，用15%FBS DMEM培養(yǎng)液重懸成骨細胞沉淀，按一定密度置于37℃、5%CO2飽和濕度二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)接種培養(yǎng)，并根據(jù)細胞的接種密度進行消化傳代。本實驗采用經(jīng)2次傳代、純化的第3代細胞，并根據(jù)不同步驟的需要將細胞調(diào)整成適當?shù)拿芏取?/p>

2.3 建立干預成骨細胞活性時效關系及量效關系

2.3.1 電針后血清干預成骨細胞活性時效關系第3代成骨細胞以2×103／孔接種于96孔板中，含10%FBS DMEM培養(yǎng)24 h。用不含10%FBS DMEM培養(yǎng)24 h同步化成骨細胞，分別加入含10%空白組、電針組的血清DMEM培養(yǎng)，每組成骨細胞設定6孔，分別培養(yǎng)24、48、72、96 h。棄培養(yǎng)液，100 μL PBS（1×）沖洗1遍，每孔加入20 μL 0.5%MTT溶液，37℃溫育4 h，棄MTT溶液，100 μL PBS（1×）沖洗1遍，加200 μL DMSO，37℃充分振蕩10 min，酶標儀λ570 nm檢測每孔OD值。

2.3.2 電針后血清干預成骨細胞活性量效關系第3代成骨細胞以2×103／孔接種于96孔板中，含10%FBS DMEM培養(yǎng)24 h。用不含10%FBS DMEM培養(yǎng)24 h同步化成骨細胞，分別加入含5%、10%、15%、20%的空白組、電針組的血清DMEM培養(yǎng)，每組成骨細胞設定6孔，培養(yǎng)72 h。棄培養(yǎng)液，100 μL PBS（1×）沖洗1遍，每孔加入20 μL 0.5%MTT溶液，37℃溫育4 h，棄MTT溶液，100 μL PBS（1×）沖洗1遍，加200 μL DMSO，37℃充分振蕩10 min，酶標儀λ570 nm檢測每孔OD值。

2.4 電針后血清對成骨細胞增殖的影響第3代成骨細胞以2×103／孔接種于96孔板中，含10%FBS DMEM培養(yǎng)24 h。用不含10%FBS DMEM培養(yǎng)24 h同步化成骨細胞，分別加入含10%空白組、雌二醇組、電針組的血清DMEM培養(yǎng)，每組成骨細胞設定6孔，培養(yǎng)72 h。棄培養(yǎng)液，100 μL PBS（1×）沖洗1遍，每孔加入20 μL 0.5%MTT溶液，37℃溫育4 h，棄MTT溶液，100 μL PBS（1×）沖洗1遍，加200 μL DMSO，37℃充分振蕩10 min，酶標儀λ570 nm檢測每孔OD值。

2.5 統(tǒng)計學方法采用SPSS 14.0軟件進行統(tǒng)計學處理，數(shù)據(jù)以（x±s）表示，計量資料采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 成骨細胞的形態(tài)學觀察原代細胞培養(yǎng)第1 d可見大部分在培養(yǎng)液中懸浮，胞體圓形，核大，見圖1A；2 d時細胞完全貼壁，胞體呈三角形、多角形等，核呈卵圓形，見圖1B；5 d時細胞分裂明顯增加，突起緊密連接，呈集落生長，似魚鱗狀，見圖1C；7 d時可見細胞形態(tài)多樣，重疊生長，胞漿豐富，呈鋪石狀，符合成骨細胞的形態(tài)學特征，見圖1D。當達到80%匯合時消化傳代，消化后棄去組織塊，傳代后2 h倒置顯微鏡觀察，部分細胞開始貼壁，細胞呈多邊形、紡錘形、梭形，胞核較大，呈圓形且清晰。24 h后細胞大部分貼壁生長，排列緊密，多呈梭形和多邊形。隨時間推移，細胞重疊生長，數(shù)量增加，經(jīng)反復消化、傳代后得到純化的成骨細胞。

3.2 時效及量效關系的建立

3.2.1 建立時效關系第3代成骨細胞，空白組OD值，干預72、96 h明顯高于干預前（P＜0.05）；電針組OD值干預72 h明顯高于其它3個時間點（P＜0.05）。因此確定72 h作為后續(xù)成骨細胞實驗的最佳檢測時間點，見表1。

3.2.2 建立量效關系第3代成骨細胞，干預后，2組OD值，10%、15%、20%均明顯高于5%（P＜0.01）；電針組，10%與15%比較無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），但隨著血清濃度的進一步增加，成骨細胞OD值明顯降低。因此確定10%血清濃度作為最佳干預濃度，見表2。

3.3 成骨細胞增殖的影響見表3。

4 討論

4.1 電針后血清建立的理論依據(jù)近年來，中醫(yī)藥在治療OP方面進展很大，具有療效穩(wěn)定、作用廣泛、使用安全、毒副作用小的特點，發(fā)展前景良好。針灸屬于祖國傳統(tǒng)醫(yī)學的特色療法，是一種“自然療法”“整體療法”，療效確切，無不良反應，能充分調(diào)動機體的自我調(diào)節(jié)能力。研究證實，針灸對生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)具有調(diào)節(jié)作用，可明顯提高雌二醇［9-11］。另外，電針具有消腫止痛、舒筋活絡、補腎壯骨益髓的作用，多層面、多靶點、多途徑作用于經(jīng)絡系統(tǒng)，經(jīng)過中樞神經(jīng)系統(tǒng)的整合及信號通路的調(diào)控，調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡及機體的免疫應答反應，從而進一步改善患者的臨床癥狀和體征［12］。

圖1 成骨細胞的形態(tài)學觀察

表1 電針后血清干預成骨細胞活性的時效關系（OD值，x±s）

表2 電針后血清干預成骨細胞活性的量效關系（OD值，x±s）

表3 電針后血清對成骨細胞增殖影響（x±s）

針灸調(diào)整內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)的研究一直是中醫(yī)針灸科研領域的重點課題，從神經(jīng)體液角度入手的研究較多，主要探討針灸作用的神經(jīng)機制，欠缺體液機制的探討，直接證據(jù)獲得較少。而針灸調(diào)整內(nèi)分泌免疫系統(tǒng)研究的數(shù)據(jù)，大多數(shù)來源于在體實驗的研究。在體實驗研究中，針灸可對血清中某些相關活性成分的水平進行不同程度的調(diào)節(jié)，所獲得的數(shù)據(jù)大部分是通過間接觀察得到的結(jié)果。因此，針灸專家陳漢平教授提出“針灸血清”的方法，很大程度上提高了針灸科研的觀察水平。其要領是把針灸治療后獲取的血清直接加入到體外反應體系中進行干預，通過對離體靶器官、組織、細胞等形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動的觀察，分析針灸血清所產(chǎn)生的具體效應［13-15］。

現(xiàn)代醫(yī)學認為，OP的主要病理變化是在骨代謝過程中骨形成和骨吸收的偶聯(lián)產(chǎn)生缺陷，致使人體內(nèi)鈣磷代謝失衡，進而骨量逐步減少而引發(fā)相關臨床癥狀。人體的骨代謝，一方面是成骨細胞的骨形成，另一方面是破骨細胞的骨吸收，兩者之間協(xié)調(diào)平衡，從而使體內(nèi)的骨轉(zhuǎn)換處于正常水平狀態(tài)。因此任何影響破骨細胞和成骨細胞功能和（或）數(shù)量的因素，使骨吸收過多或骨形成不足，均可出現(xiàn)骨質(zhì)疏松。成骨細胞是骨形成的關鍵細胞，骨代謝正常與否與成骨細胞的分化成熟、功能活性密切相關。盡管目前骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機制仍不清楚，但研究表明，骨質(zhì)疏松發(fā)病過程中，成骨細胞數(shù)量減少，骨形成不足，與成骨細胞增殖分化水平下降及成骨能力功能障礙有著密切的關系［16-17］。

因此，本研究根據(jù)人體與動物藥物等效劑量換算，制備了電針后血清。采用電針后血清作用于體外培養(yǎng)的成骨細胞，模擬電針的經(jīng)絡調(diào)節(jié)過程，為后續(xù)開展成骨細胞增殖、維持成骨細胞活性提供有效的實驗平臺。

4.2 成骨細胞增殖方法及意義本研究首先采用梯度時間法、梯度濃度法建立電針后血清干預成骨細胞活性的時效及量效關系，結(jié)果表明，成骨細胞干預72 h為最佳干預時間點，10%血清濃度為最佳干預濃度。成骨細胞在電針后10%血清濃度的作用下干預72 h，檢測成骨細胞增殖情況的結(jié)果表明，電針組比雌二醇組更能促進成骨細胞增殖。

電針后血清能加速成骨細胞增殖，維持成骨細胞活性，但隨著干預時間的延長，其維持成骨細胞活性的能力具有自限性，96 h后效果欠佳，這可能是由于96 h后軟骨細胞營養(yǎng)物質(zhì)缺乏，代謝產(chǎn)物堆積，細胞進入平臺期并開始衰退。眾所周知，骨形成是一個極其復雜的過程，成骨細胞是骨形成的關鍵細胞，電針是如何促進成骨細胞的增殖？是否電針后導致雌激素水平上升從而加速成骨細胞的增殖？通過何種途徑激活細胞增殖相應的信號通路？信號通路之間又是如何相互影響的？這些問題有待于今后進一步研究和探討。

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R245

B

1000-338X（2017）03-0040-04

2016-04-03

福建省自然科學基金資助項目（2015J05161）；福建省衛(wèi)生計生委青年科研課題（2015-1-78）；福建中醫(yī)藥大學校管課題（X2012021）

吳追樂（1982—），男，醫(yī)學博士，主要從事針灸治療骨質(zhì)疏松的研究。