段雅婕++陳晶晶++龐振才++胡玉林++李偉明++胡會(huì)剛

摘 要 對(duì)豆粕有機(jī)質(zhì)發(fā)酵液的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，為香蕉枯萎病提供穩(wěn)定、有效的生物學(xué)防治方法。研究采用單因素試驗(yàn)考察不同因素對(duì)豆粕有機(jī)質(zhì)發(fā)酵的影響，運(yùn)用正交試驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，豆粕有機(jī)質(zhì)最佳發(fā)酵工藝為豆粕有機(jī)質(zhì)混懸液稀釋5倍，紅糖濃度為2.0 g/100 mL發(fā)酵15 d。為豆粕發(fā)酵液進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)提供了數(shù)據(jù)支持。

關(guān)鍵詞 豆粕有機(jī)質(zhì) ；發(fā)酵液 ；發(fā)酵條件 ；優(yōu)化

中圖分類號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.07.019

Optimization of Fermentation Conditions for Soybean Meal Fermented Liquid

DUAN Yajie CHEN Jingjing PANG Zhencai HU Yulin LI Weiming HU Huigang

（South Subtropical Crops Research Institute， CATAS / Ministry of Agriculture Key

Laboratory for Biology of Tropical Fruit Trees， Zhanjiang， Guangdong 524091）

Abstract The fermentation conditions for producing soybean meal fermented liquid was optimized and used to control banana fusarium wilt. Single factor experiment was designed to determine the effect of different factors on the soybean meal fermentation， based on which orthogonal experiments were arranged to optimize the experimental conditions. Some factors that had higher influence on the fermentation of soybean meal organic matter were selected. The orthogonal experiment showed that soybean meal suspension was diluted at a ratio of 1：5 with the brown sugar concentration of 2.0 g/100 ml and fermented for 15 days to produce better soybean meal fermented liquid. This provided data support for commercial production of soybean meal fermented liquid.

Keywords Soybean meal organic matter ； fermented liquid ； fermentation conditions ； optimization

香蕉枯萎病是香蕉生產(chǎn)上一種毀滅性病害，嚴(yán)重威脅著香蕉的正常生長(zhǎng)。據(jù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，目前香蕉枯萎病危害最為嚴(yán)重的是4號(hào)生理小種，其寄主的香蕉栽培品種范圍很廣，危害面積最大，是一種香蕉枯萎病的強(qiáng)致病菌，這種菌經(jīng)過(guò)鑒定為真菌，毒性很強(qiáng)，對(duì)香蕉栽培生產(chǎn)造成的危險(xiǎn)性和毀滅性最大[1-2]。目前，香蕉枯萎病的防治主要采用化學(xué)防治和輪作等農(nóng)業(yè)防治措施，而上述防治方法均存在較多的問(wèn)題[3-4]。經(jīng)多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)及田間使用證明，防治土傳性病害較有效的方法是改善土壤微生物的群體作用[5]，而使用豆粕有機(jī)質(zhì)發(fā)酵液有利于土壤微生物多樣性的恢復(fù)，可有效控制香蕉枯萎病的發(fā)病率，而且不會(huì)產(chǎn)生農(nóng)藥殘留，不會(huì)產(chǎn)生抗藥性[6]。通過(guò)對(duì)豆粕有機(jī)質(zhì)發(fā)酵液中微生物的分析，發(fā)現(xiàn)其中含有多種對(duì)香蕉枯萎病病菌具有拮抗作用的菌株，也是豆粕有機(jī)質(zhì)發(fā)酵液防治香蕉枯萎病的主要原因[7]。不同的發(fā)酵方法和發(fā)酵對(duì)微生物的種類、數(shù)量產(chǎn)生決定性的影響[8-9]。在使用豆粕有機(jī)質(zhì)防治香蕉枯萎病的過(guò)程中，蕉農(nóng)一般采用傳統(tǒng)的自然發(fā)酵方法使豆粕有機(jī)質(zhì)發(fā)酵，然后直接施用到蕉園中。由于發(fā)酵方法粗放，發(fā)酵過(guò)程中各種條件缺乏科學(xué)的管理和控制，施用到蕉園后，對(duì)香蕉枯萎病的防治效果差異巨大，難以達(dá)到穩(wěn)定控制香蕉枯萎病發(fā)病的效果。本研究通過(guò)對(duì)豆粕有機(jī)質(zhì)發(fā)酵液的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，以期摸索出生產(chǎn)豆粕有機(jī)質(zhì)發(fā)酵液的最佳發(fā)酵條件，為香蕉枯萎病提供穩(wěn)定、有效的生物學(xué)防治方法。

1 材料和方法

1.1 材料

豆粕有機(jī)質(zhì)：南亞熱帶作物研究所，本實(shí)驗(yàn)室保存。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15～20 g，自來(lái)水1 000 mL。

菌株：香蕉枯萎病菌（Fusariumoxysporumf.sp.cubense Snyder & Hansen，簡(jiǎn)稱為Foc）為尖孢鐮刀菌古巴?；?號(hào)生理小種，中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院海口實(shí)驗(yàn)站/香蕉研究所，曾會(huì)才課題組提供。

儀器：振蕩器、搖床、三角瓶、涂玻棒、無(wú)菌操作臺(tái)、酒精燈、離心管、離心機(jī)、PCR儀等。

1.2 方法

1.2.1 影響因素的篩選

豆粕有機(jī)質(zhì)磨碎，加水配制成1 g/mL的混懸液，按照不同的發(fā)酵方法分別進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵之后，取發(fā)酵液稀釋至10倍，備用。取Foc4菌絲塊（以下稱“靶標(biāo)菌株”）接入PDA培養(yǎng)基平板中間，所得的豆粕發(fā)酵液接種在距靶標(biāo)菌株菌絲塊2～3 cm處的四周，28℃培養(yǎng)1～2 d，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)，計(jì)算抑菌帶寬度的平均值。

抑制率%=（對(duì)照菌直徑-處理菌直徑）/（對(duì)照菌直徑-菌餅直徑）。

數(shù)據(jù)采用和統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析及多重比較。

1.2.2 豆粕有機(jī)質(zhì)濃度的選擇

豆粕有機(jī)質(zhì)分別稀釋至2、4、5、8、10、15倍，按照1.2.1的方法進(jìn)行發(fā)酵，并測(cè)定不同稀釋濃度的豆粕有機(jī)質(zhì)發(fā)酵后抑菌帶的寬度。比較豆粕有機(jī)質(zhì)濃度對(duì)豆粕有機(jī)質(zhì)發(fā)酵液抑菌效果的影響。

1.2.3 發(fā)酵基質(zhì)的選擇

在豆粕有機(jī)質(zhì)混懸液分別加入蔗糖、紅糖、麩皮、椰糠、玉米粉，按照1.2.1的方法進(jìn)行發(fā)酵，并測(cè)定抑菌帶寬度?？疾觳煌l(fā)酵基質(zhì)對(duì)豆粕有機(jī)質(zhì)發(fā)酵液抑菌效果的影響。

1.2.4 發(fā)酵基質(zhì)濃度的選擇

根據(jù)1.2.1篩選出的基質(zhì)，分別設(shè)定0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 g/100 mL 6個(gè)不同的濃度，按照1.2.1的方法進(jìn)行發(fā)酵，并測(cè)定抑菌帶寬度?？疾觳煌幕|(zhì)濃度對(duì)發(fā)酵液抑菌作用的影響。

1.2.5 發(fā)酵時(shí)間的選擇

根據(jù)1.2.1篩選出的基質(zhì)，按照1.2.1的方法進(jìn)行發(fā)酵，并在第1、3、5、10、15、17 d取發(fā)酵液，分別測(cè)定其抑菌帶寬度?？疾彀l(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵液抑菌作用的影響。

1.2.6 發(fā)酵條件的優(yōu)化

根據(jù)單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇豆粕有機(jī)質(zhì)濃度、發(fā)酵基質(zhì)濃度和發(fā)酵時(shí)間為考察因素，每個(gè)因素設(shè)置低、中、高水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，分別測(cè)定各豆粕有機(jī)質(zhì)發(fā)酵液的抑菌帶寬度。各因素水平如表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆粕有機(jī)質(zhì)濃度對(duì)發(fā)酵液抑菌效果的影響

隨著豆粕有機(jī)質(zhì)稀釋倍數(shù)的增加，豆粕有機(jī)質(zhì)發(fā)酵液的抑菌帶寬度呈先上升后降低的趨勢(shì)，稀釋5倍的抑菌帶寬度達(dá)到最大值。不同稀釋倍數(shù)的豆粕有機(jī)質(zhì)發(fā)酵液的抑菌帶寬度如圖1。

2.2 不同發(fā)酵基質(zhì)對(duì)發(fā)酵液抑菌效果的影響

通過(guò)在豆粕有機(jī)質(zhì)混懸液中添加不同發(fā)酵基質(zhì)，豆粕有機(jī)質(zhì)發(fā)酵液的抑菌效果有不同程度的提高，抑菌帶寬度均有所增加，其中添加了紅糖的豆粕有機(jī)質(zhì)發(fā)酵液抑菌效果最好，結(jié)果如表2。因此，本實(shí)驗(yàn)中選擇紅糖作為發(fā)酵基質(zhì)。

2.3 發(fā)酵基質(zhì)濃度對(duì)發(fā)酵液抑菌效果的影響

隨著豆粕有機(jī)質(zhì)混懸液中紅糖濃度的增加，豆粕有機(jī)質(zhì)發(fā)酵液的抑菌效果逐漸增強(qiáng)，并在2.5 g/mL之后趨于穩(wěn)定。

2.4 發(fā)酵天數(shù)對(duì)發(fā)酵液抑菌效果的影響

隨著發(fā)酵天數(shù)的增加，豆粕有機(jī)質(zhì)發(fā)酵液的抑菌帶寬度呈先上升后下降的趨勢(shì)，并且在發(fā)酵第15 d時(shí)達(dá)到最大值，結(jié)果如圖3。

2.5 正交試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵條件的優(yōu)化

根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，選擇L9（34）正交表安排試驗(yàn)，具體實(shí)驗(yàn)如表3。

通過(guò)對(duì)正交試驗(yàn)的結(jié)果分析可以看出，各因素對(duì)豆粕有機(jī)質(zhì)發(fā)酵液抑菌效果影響從大到小依次為：C>B>A，最佳發(fā)酵工藝組合為A2B2C2，即豆粕有機(jī)質(zhì)混懸液稀釋5倍，紅糖濃度為2.0 g/100 mL發(fā)酵15 d。

3 討論

生物防治是目前公認(rèn)比較安全和有效的防控香蕉枯萎病的措施之一，并符合環(huán)保和有機(jī)食品要求[10]。有機(jī)質(zhì)餅肥發(fā)酵而成的液體肥料能較好的抑制多種病原菌，降低作物的發(fā)病率[11]。抑制土傳病害需要依賴土壤微生物群體作用，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)越豐富、物種越均勻、多樣性越高時(shí)，抑制病原菌能力越強(qiáng)。豆粕有機(jī)質(zhì)發(fā)酵液中微生物，尤其是其中的拮抗菌，是防治香蕉枯萎病的重要因素。而發(fā)酵條件對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中微生物的種類和數(shù)量起著決定性作用。本研究通過(guò)單因素對(duì)影響微生物的多項(xiàng)因素進(jìn)行篩選，并通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)豆粕有機(jī)質(zhì)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，通過(guò)比較不同處理對(duì)香蕉枯萎病病菌的抑制作用，得到了豆粕有機(jī)質(zhì)發(fā)酵的最優(yōu)條件，即豆粕有機(jī)質(zhì)混懸液稀釋5倍，紅糖濃度為2.0 g/100 mL發(fā)酵15 d。采用上述條件，發(fā)酵所得的豆粕有機(jī)質(zhì)發(fā)酵液具有較好的抑菌效果。為豆粕發(fā)酵液進(jìn)行規(guī)模化生產(chǎn)提供了數(shù)據(jù)支持，也為豆粕發(fā)酵液大范圍應(yīng)用于香蕉枯萎病的防治提供理論依據(jù)。

由于土壤微生物是個(gè)非常復(fù)雜的系統(tǒng)，僅僅依賴該方法難以充分認(rèn)識(shí)土壤微生物的多樣性和復(fù)雜性，需要結(jié)合分子生物學(xué)及其他方法，如可結(jié)合基因芯片、穩(wěn)定同位素探針等技術(shù)更深入、全面了解土壤微生物信息。本實(shí)驗(yàn)?zāi)壳爸粚?duì)發(fā)酵液進(jìn)行了平板抑菌實(shí)驗(yàn)。因此，進(jìn)行盆栽苗和大田香蕉植株的防治實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化豆粕有機(jī)質(zhì)發(fā)酵液的發(fā)酵條件，以期形成相對(duì)成熟的豆粕有機(jī)質(zhì)發(fā)酵方法，從不同角度深入認(rèn)識(shí)土壤微生物多樣性變化，闡述其與香蕉枯萎病害發(fā)病程度的相互關(guān)系，為生態(tài)控制土傳病害提供技術(shù)支撐，以更好地發(fā)揮生物防治對(duì)香蕉枯萎病的防治效果，探索香蕉枯萎病生物防治的新途徑。

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