于孟飛，王倩，劉松青，沈金花，劉慶華(中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢430074)

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羅紅霉素對小鼠乙酰膽堿預(yù)收縮氣管環(huán)的舒張作用

于孟飛，王倩，劉松青，沈金花，劉慶華
(中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，武漢430074)

目的 觀察羅紅霉素對小鼠氣管環(huán)的舒張作用，并探討其作用機制。方法 取BALB/c小鼠15只，處死后分離氣管環(huán)，將氣管環(huán)置于灌流槽中，經(jīng)過高鈣液平衡后開始實驗。使用激動劑乙酰膽堿(Ach)100 μmol/L收縮氣管環(huán)，待氣管環(huán)張力達到平臺期后,分別加入終濃度為10-2、10-1.5、10-1、10-0.5、100、100.5、100.75、101mg/mL的羅紅霉素，觀察不同濃度羅紅霉素作用下的氣管環(huán)肌張力和舒張比率，將引起氣管環(huán)最大舒張的最低藥物濃度100.75mg/mL作為羅紅霉素最佳藥物濃度。向灌流槽中加入100 μmol/L Ach預(yù)收縮氣管環(huán)，隨后加入L型鈣離子通道抑制劑硝苯地平、非選擇性陽離子通道抑制劑吡唑鹽3(Pyr3)，待抑制劑舒張氣管作用達到平臺期后，加入100.75mg/mL羅紅霉素，觀察氣管環(huán)的肌張力變化和舒張比率。結(jié)果 Ach預(yù)收縮的氣管環(huán)的肌張力為(7.03±0.35)mN，加入最佳濃度的羅紅霉素后，肌張力降至(3.47±0.29)mN(P<0.05)。加入硝苯地平、Pyr3后氣管環(huán)的肌張力降低，舒張比率增加(P均<0.05)；繼續(xù)加入羅紅霉素后，氣管環(huán)的肌張力繼續(xù)降低，舒張比率較前升高(P均<0.05)。結(jié)論 羅紅霉素對小鼠Ach預(yù)收縮的氣管環(huán)具有舒張作用，并可增強硝苯地平、Pyr3對于Ach預(yù)收縮氣管環(huán)的舒張作用，其主要通過調(diào)控鈣離子通道來發(fā)揮作用。

氣管環(huán)；乙酰膽堿；羅紅霉素；鈣離子通道；氣管舒張；哮喘

哮喘是由嗜酸粒細胞、淋巴細胞等多種炎性細胞參與的慢性氣道炎癥，其發(fā)病機制與以支氣管平滑肌收縮為主的過敏反應(yīng)有關(guān)，其氣道阻塞是可逆的[1]。哮喘發(fā)作時，乙酰膽堿能神經(jīng)興奮可引起乙酰膽堿(Ach)大量釋放，并導(dǎo)致氣管平滑肌細胞膜上的鈣離子通道(主要是L型鈣離子通道和非選擇性陽離子通道)的開放，引起Ca2+內(nèi)流、氣管收縮和氣管腔縮窄，造成呼吸困難。研究顯示，L型鈣離子通道特異性抑制劑硝苯地平可以有效緩解哮喘患者的癥狀[2]，非選擇性陽離子通道抑制劑Pyr3對氣管環(huán)也具有舒張作用，對哮喘具有一定的治療效果[3]。羅紅霉素作為一種抗炎藥物，常用于單獨或聯(lián)合其他藥物(如沙丁胺醇)治療哮喘[4～10]，來緩解咳嗽等相關(guān)癥狀。近期研究發(fā)現(xiàn)，苦物質(zhì)對氣管具有強烈的舒張作用，具有開發(fā)成為治療藥物的潛力[11]。羅紅霉素作為一種苦物質(zhì)，除了具有消炎作用之外，是否可以對氣管發(fā)揮舒張作用，從而實現(xiàn)對哮喘的治療尚無定論。2016年2～6月，我們以Ach作為氣管環(huán)收縮的激動劑，觀察羅紅霉素對氣管環(huán)的舒張作用，并觀察羅紅霉素對L型鈣離子通道抑制劑硝苯地平、非選擇性陽離子通道抑制劑吡唑鹽3(Pyr3)舒張氣管作用的影響，探討羅紅霉素治療哮喘的機制。

1 材料與方法

1.1 材料 8～10周齡SPF級BALB/c小鼠，購于湖北省實驗動物中心。自由飲水、進食，每周更換墊料。羅紅霉素分散片(江蘇黃河藥業(yè))，氯化鈉、氯化鉀、六水氯化鎂、鹽酸、氫氧化鈉、葡萄糖等購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司。無水氯化鈣購于天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。HEPES、Ach、硝苯地平、Pyr3、二甲基亞砜(DMSO)購于美國Sigma公司。高鈣液(PSS)的配制：135 mmol/L NaCl，5 mmol/L KCl，1 mmol/L MgCl2，2 mmol/L CaCl2，10 mmol/L HEPES，10 mmol/L葡萄糖注射液(pH=7.4)。硝苯地平、Pyr3溶于DMSO制成100×母液，-80 ℃保存?zhèn)溆?。將羅紅霉素分散片碾碎并溶解于PSS中，制成56.2 mg/mL的羅紅霉素母液。

1.2 氣管環(huán)的制備 靜脈注射戊巴比妥鈉150 mg/kg處死小鼠，剪下氣管，去除附著組織，剪成3～4 mm長的氣管環(huán)。將氣管環(huán)套入張力換能器的三角形掛鉤中，掛鉤上端連接張力換能器，下端固定于氧氣出口上方的掛鉤上，浸泡于通氧的37 ℃的PSS灌流槽中。將氣管環(huán)前負荷設(shè)置為0.3 g。每15 min更換PSS一次，共換液4次，完成預(yù)平衡。用100 μmol/L Ach對氣管環(huán)進行預(yù)刺激，待張力達到平臺期后，以PSS洗脫Ach，等氣管環(huán)張力達到基線，完成1次預(yù)刺激。預(yù)刺激3次后開始正式實驗。

1.3 羅紅霉素最佳藥物濃度的確定 向灌流槽中加入不同體積的羅紅霉素母液，使灌流槽中的羅紅霉素濃度依次達到10-2、10-1.5、10-1、10-0.5、100、100.5、100.75、101mg/mL，在藥物作用達到平臺期時，讀取張力換能器顯示的張力數(shù)值。實驗結(jié)束后，將氣管環(huán)置于56 ℃烘箱中烘干12 h，然后稱取干重(mg)。氣管環(huán)的瞬間肌張力(mN)=(瞬間張力值-300)mg/氣管環(huán)干重(mg)。羅紅霉素對氣管環(huán)的舒張比率=(未加羅紅霉素時平臺期肌張力-添加某一濃度羅紅霉素后平臺期肌張力)/未加藥物時肌張力×100%。比較不同濃度羅紅霉素對氣管環(huán)的舒張比率，將引起氣管環(huán)最大舒張的最低藥物濃度100.75mg/mL作為羅紅霉素的最佳濃度。

1.4 羅紅霉素對硝苯地平舒張氣管環(huán)作用影響的觀察 氣管環(huán)經(jīng)平衡和預(yù)刺激后，向灌流槽中加入100 μmol/L Ach，刺激氣管環(huán)使其收縮達到最大值，并進入平臺期，讀取張力換能器顯示的肌張力數(shù)值。然后加入10 μmol/L硝苯地平舒張氣管環(huán)。待舒張作用達到穩(wěn)定后，讀取肌張力數(shù)值。最后，加入100.75mg/mL羅紅霉素，讀取肌張力數(shù)值。

1.5 羅紅霉素對Pyr3舒張氣管環(huán)作用影響的觀察 氣管環(huán)經(jīng)平衡和預(yù)刺激后，向灌流槽中加入100 μmol/L Ach，刺激氣管環(huán)使其收縮達到最大值，并進入平臺期，讀取肌張力數(shù)值。然后，加入30 μmol/L Pyr3舒張氣管環(huán)，待舒張作用達到穩(wěn)定后，讀取肌張力數(shù)值。最后，加入100.75mg/mL羅紅霉素，讀取肌張力數(shù)值。

2 結(jié)果

2.1 羅紅霉素對Ach預(yù)收縮氣管環(huán)的舒張作用 不同濃度羅紅霉素對Ach預(yù)收縮的氣管環(huán)肌張力、舒張比率的影響見表1。100.75mg/mL羅紅霉素作用后的氣管環(huán)舒張比率最高，為最佳藥物濃度。見表1。

2.2 羅紅霉素對硝苯地平舒張氣管環(huán)作用的影響 加入硝苯地平前，氣管環(huán)的肌張力為(8.61±0.42)mN，舒張比率為0；加入硝苯地平后，肌張力降至(7.31±0.34)mN，舒張比率增加至15.1%±4.9%(P均<0.05)；繼續(xù)加入羅紅霉素后，肌張力降至(5.22±0.51)mN，舒張比率增加至39.4%±5.9%(P均<0.05)。

表1 不同濃度羅紅霉素對Ach預(yù)收縮的氣管環(huán)的舒張作用

2.3 羅紅霉素對Pyr3舒張氣管環(huán)作用的影響 加入Pyr3前，氣管環(huán)的肌張力為(7.63±0.72)mN,舒張比率為0；加入Pyr3后，肌張力降至(5.40±0.71)mN，舒張比率增加至29.2%±9.3%(P均<0.05)；繼續(xù)加入羅紅霉素后，肌張力降至(3.54±0.53)mN，舒張比率增加至53.6%±6.9%(P均<0.05)。

3 討論

哮喘是由多種細胞及細胞組分參與的慢性氣道炎癥，常伴隨氣道反應(yīng)性增高、氣道平滑肌收縮力增強，導(dǎo)致反復(fù)發(fā)作的喘息、氣促、胸悶和(或)咳嗽等癥狀，此類癥狀常伴有廣泛而多變的氣流阻塞，能夠自行或通過藥物干預(yù)治療而逆轉(zhuǎn)。糖皮質(zhì)激素是目前治療哮喘應(yīng)用最廣泛的藥物，但長期服用可引起肌肉無力、消化性潰瘍、水鈉潴留、高脂血癥等不良反應(yīng)，導(dǎo)致其臨床應(yīng)用受限。因此，尋找和開發(fā)治療哮喘的新藥從而進一步緩解哮喘，成為重要的研究課題。

哮喘發(fā)作時，主要是膽堿能神經(jīng)興奮，促使Ach大量釋放。隨后Ach通過與平滑肌細胞膜上的特異性受體結(jié)合，激活L型鈣離子通道和細胞膜上的G蛋白；然后激活下游的磷脂酶C、三磷酸肌醇和二酰甘油，引起肌細胞內(nèi)Ca2+濃度升高；最后激活肌球蛋白輕鏈蛋白的磷酸化，從而觸發(fā)肌細胞收縮。硝苯地平作為L型鈣離子通道阻斷劑，可以有效阻止氣管平滑肌細胞Ca2+通道開放，導(dǎo)致Ca2+內(nèi)流減少、氣管舒張。Ach在引起氣管環(huán)收縮的過程中，可以同時激活L型鈣離子通道和非選擇性陽離子通道[13]。因此，L型鈣離子通道抑制劑硝苯地平、非選擇性陽離子通道抑制劑Pyr3可被用來緩解哮喘癥狀。然而，這兩種藥物在臨床治療哮喘過程中仍存在一些問題亟待進一步闡明。其治療哮喘的分子作用機制仍有待深入研究。

近期研究發(fā)現(xiàn)，苦物質(zhì)具有舒張氣管的作用。羅紅霉素作為一種苦物質(zhì)，是否可以通過舒張氣管從而治療哮喘尚不明確。此外，羅紅霉素是十四元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，是紅霉素的衍生物，可以通過糾正Th1/Th2細胞因子失衡，發(fā)揮抑制炎癥作用，臨床常用其治療敏感菌、支原體、衣原體等感染后引起的呼吸道感染和哮喘等疾病[5，6]。但單純抗炎治療并不能根治哮喘，不能完全消除部分哮喘患者的氣道高反應(yīng)性，即氣管平滑肌收縮力增強和敏感性升高的現(xiàn)象。鑒于羅紅霉素已被臨床證明具有安全、高效和廉價等優(yōu)點，因此羅紅霉素具備作為解痙劑來治療哮喘的潛力。本研究結(jié)果顯示，在硝苯地平或者Pyr3存在的條件下，羅紅霉素能夠?qū)夤墉h(huán)的肌張力由(7.31±0.34)mN和(5.40±0.71)mN分別降低至(5.22±0.51)mN和(3.54±0.53)mN,舒張比率分別達到39.4%±5.9%和53.6%±6.9%。表明硝苯地平與羅紅霉素聯(lián)合作用可以使Ach預(yù)收縮氣管環(huán)發(fā)生部分舒張，Pyr3與羅紅霉素聯(lián)合作用也可以使Ach預(yù)收縮的氣管環(huán)發(fā)生部分舒張，推測羅紅霉素可通過增強L型鈣離子通道抑制劑、非選擇性陽離子通道抑制劑，發(fā)揮促進Ach預(yù)收縮的氣管環(huán)舒張的作用，提示羅紅霉素與硝苯地平或Pyr3聯(lián)用可以更好地控制哮喘[12]。

綜上所述，羅紅霉素可以增強L型鈣離子通道抑制劑硝苯地平及非選擇性陽離子通道抑制劑Pyr3對Ach預(yù)收縮氣管環(huán)的舒張作用，其機制可能與抑制L型鈣離子通道和非選擇性陽離子通道有關(guān)。

[1] 鄭國毅.孟魯司特對哮喘患者NF-κB、IL-10及氣道反應(yīng)的作用[J].中國藥師,2009,12(12):1783-1785.

[2] 李淑平.硝苯地平控釋片治療支氣管哮喘的臨床療效觀察[J].醫(yī)學(xué)理論與實踐,2014,27(24):3290-3291.

[3] Wang L, Li J, Zhang J, et al. Inhibition of TRPC3 downregulates airway hyperresponsiveness, remodeling of OVA-sensitized mouse[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2017,484(1):209-217.

[4] 陳雪峰.羅紅霉素治療咳嗽變異型哮喘療效觀察[J].兒科藥學(xué)雜志,2004,10(6):53.

[5] 林潔,戴元榮,趙初環(huán),等.羅紅霉素對哮喘大鼠氣道重塑中成肌纖維細胞、TGF-β1和IFN-γ的影響[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué),2008,13(10):1116-1121.

[6] 王瑞麗,陳慧君,戴元榮,等.caveolin-1和p42/p44MAPK在哮喘大鼠氣道重塑中的作用及羅紅霉素對其表達的影響[J].溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2013,43(3):166-170.

[7] 徐慧,夏夢玲,戴元榮.羅紅霉素通過缺氧誘導(dǎo)因子-1α對吸煙哮喘小鼠組蛋白去乙?；副磉_的影響[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué),2015,20(6):606-610.

[8] 顏孫舜,戴元榮,吳立琴,等.羅紅霉素對哮喘大鼠NF-κB及氣道炎癥的影響[J].中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué),2009,14(7):748-753.

[9] 趙瑞卿.沙胺丁醇、羅紅霉素聯(lián)合酮替芬治療小兒咳嗽變異性哮喘療效觀察[J].山東醫(yī)藥,2008,48(4):89-90.

[10] 鄭小珍,劉積鋒,鐘蔚,等.小劑量羅紅霉素對吸煙哮喘患者氣道炎癥的影響[J].重慶醫(yī)學(xué),2013,42(28):3357-3359.

[11] Zhang CH, Lifshitz LM, Uy KF,et al.The cellular and molecular basis of bitter tastant-induced bronchodilation[J]. PLoS Biol, 2013,11(3):e1001501-e1001501.

[12] Kanoh S, Rubin BK. Mechanisms of action and clinical application of macrolides as immunomodulatory medications[J]. Clin Microbiol Rev, 2010,23(3):590-615.

[13] Zhang T, Luo XJ, Sai WB, et al. Non-selective cation channels mediate chloroquine-induced relaxation in precontracted mouse airway smooth muscle[J]. PLoS One, 2014,9(7):e101578.

國家自然科學(xué)基金面上項目(31571200)。

劉慶華(E-mail: 2011093@mail.scuec.edu.cn)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.26.011

Q253; Q28

A

1002-266X(2017)26-0038-03

2017-01-22)