陳麗萍 江興華福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司福州350014

禽流感疫苗抗原濃縮工藝的研究

陳麗萍 江興華福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司福州350014

為了提升禽流感疫苗中的抗原效價，本研究采用密理博公司的切向流超濾系統(tǒng)，選用不同孔徑的超濾膜和濃縮倍數(shù)對禽流感病毒（H9N2亞型，HP株）進(jìn)行濃縮，觀察HA和EID50的變化。結(jié)果顯示：膜包孔徑越大，病毒透過越多，但膜包孔徑過小，濃縮時間長；隨著濃縮倍數(shù)增加，HA和EID50均呈正相關(guān)增長，但高濃縮倍數(shù)耗時較長。說明禽流感疫苗生產(chǎn)中應(yīng)根據(jù)抗原相對分子質(zhì)量、HA、EID50和生產(chǎn)效率選擇合適的超濾膜孔徑和濃縮倍數(shù)。

抗原濃縮禽流感病毒疫苗病毒含量

禽流感（Avian influenza，AI）是由正黏病毒科、A型流感病毒屬的禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引起家禽、野鳥和部分哺乳動物發(fā)病的一種傳染病。由于AIV血清型眾多，不同毒株間毒力差異很大，給臨床診斷和防控帶來很大的問題[1]。H9N2亞型AIV最早于1966年從火雞體內(nèi)分離到[2]，1997年以后H9N2亞型AIV在中國大陸的雞和其他家禽甚至豬群中被分離到[3]，證實了中等毒力以下H9亞型AI在我國普遍存在，是影響我國養(yǎng)禽業(yè)的主要AIV亞型，且對禽的危害越來越嚴(yán)重，雖然表現(xiàn)低致病性，但由于傳播廣泛能造成免疫抑制并使宿主容易發(fā)生繼發(fā)感染，特別是可導(dǎo)致雞群產(chǎn)蛋下降或完全停止[2]，對養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失，其危害不容忽視。目前，對AI并沒有有效的治療措施，控制AI的有效手段是進(jìn)行疫苗免疫接種，常規(guī)的免疫劑量內(nèi)不能容納足夠的多種抗原，影響其免疫效力；要使免疫動物獲得足量的AIV（H9N2亞型，HP株）抗原，就必須加大注射劑量，從而影響疫苗的應(yīng)用[4]。疫苗的效果與其抗原量成正相關(guān)，要想獲得較高的免疫保護(hù)率，足夠的抗原量必不可少。提高單位體積的抗原含量是生產(chǎn)AIV（H9N2亞型，HP株）疫苗的關(guān)鍵，而通過濃縮來提高AIV（H9N2亞型，HP株）含量是理想的辦法[5]。AIV（H9N2亞型，HP株）濃縮倍數(shù)的多少直接關(guān)系到抗原病毒含量和生產(chǎn)成本。所以，對不同濃縮倍數(shù)的參數(shù)進(jìn)行摸索，對生產(chǎn)可以起到事半功倍的效果。

本研究主要是用密理博公司的切向流濃縮系統(tǒng)，開展兩項試驗。第一，使用30 K、100 K、300 K再生纖維素超濾膜，對3批抗原進(jìn)行濃縮，摸索膜包孔徑對濃縮效果的影響，以確定適合的膜包孔徑；第二，用密理博公司的切向流濃縮系統(tǒng)，使用100 K再生纖維素超濾膜，通過對不同病毒含量的AIV（H9N2亞型，HP株）抗原分別進(jìn)行2倍、3倍、4倍、5倍濃縮，對比其濃縮前與濃縮后的病毒含量、病毒損失情況及不同濃縮倍數(shù)的濃縮效率，從而為產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供濃縮工藝參數(shù)，提高濃縮工作效率、產(chǎn)品病毒含量，從而提高產(chǎn)品免疫效果。

1 材料

1.1 種毒原始種毒，來自河南農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病研究中心；生產(chǎn)用種毒，本公司自傳。

1.2 種蛋非免蛋，購自揚州康威；SPF蛋，購自梅里亞維通公司。

1.3 設(shè)備高速管式離心機(jī)，購自上海浦東天本離心機(jī)械有限公司；切向流超濾系統(tǒng)，購自密理博公司；30 K、100 K、300 K再生纖維素超濾膜，購自密理博公司。

2 方法

2.1 抗原制備將AIV（H9N2亞型，HP株）種毒作適當(dāng)倍數(shù)稀釋，然后尿囊腔內(nèi)接種發(fā)育良好的10日齡SPF雞胚，每胚0.2 mL，置37℃繼續(xù)孵育，接種后24 h照蛋一次，將在24 h前死亡的雞胚棄去。24 h后，每4～8 h照蛋一次，死亡的雞胚隨時取出，直至96 h，不論死亡與否全部取出，置2～8℃冷卻，然后收獲雞胚胚液裝于滅菌容器內(nèi)，置-15℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 抗原離心將抗原提前取出置常溫解凍，待完全解凍后，將抗原倒入罐體內(nèi)，連接高速連續(xù)離心機(jī)對抗原進(jìn)行離心，離心后的抗原接至罐體內(nèi)，備用。

2.3 抗原濃縮

1）將3批離心過的病毒含量均為108.37EID50/ 0.1 mL的AIV（H9N2亞型，HP株）抗原用切向流超濾系統(tǒng)進(jìn)行濃縮，分別選用30 K、100 K、300 K再生纖維素超濾膜，濃縮3倍后分別取樣、待檢。

2）將5批離心過的AIV（H9N2亞型，HP株）抗原在切向流超濾系統(tǒng)進(jìn)行濃縮，選用100 K再生纖維素膜，在濃縮到2倍、3倍、4倍、5倍時分別取樣、待檢。

2.4 血凝價HA測定用微量移液器向96孔板每孔加入生理鹽水25 uL，用移液器取病毒液樣品25 uL加入第一孔內(nèi)，吸頭浸于液體中洗吹幾次混勻后，再吸取25 uL至第2孔，如此連續(xù)稀釋至第15孔，15孔吸取25 uL液體棄去；病毒稀釋倍數(shù)依次為1:2～1:215，第16孔為紅細(xì)胞對照。再用移液器每孔加1%雞紅細(xì)胞懸浮液25 uL，振蕩器上振蕩混勻，再置常溫作用15～20 min，讀取結(jié)果。

2.5 病毒含量EID50測定[6]將病毒液樣品分別用滅菌生理鹽水進(jìn)行10倍系列稀釋，取10-7、10-8、10-9三個稀釋度的病毒液，分別尿囊腔內(nèi)接種5枚10日齡發(fā)育良好的SPF雞胚，每胚接種0.1 mL，接種后置37℃溫室孵育至120 h。棄去72 h前死亡的雞胚不計，隨時取出72～120 h死亡的雞胚，收獲雞胚胚液，將10-7、10-8、10-9三個滴度的雞胚液分別測定紅細(xì)胞凝集價，通過公式計算出病毒含量。

3 結(jié)果

3.1 用不同孔徑膜包濃縮AIV（H9N2亞型，HP株）抗原取3批離心后的抗原，濃縮前病毒含量均為108.37EID50/0.1 mL，分別用30 K、100 K、300 K再生纖維素超濾膜進(jìn)行濃縮，記錄濃縮用時，濃縮后分別取樣檢測病毒含量。結(jié)果顯示膜包孔徑越大，濃縮用時越短，說明孔徑大，濃縮速度快；不同孔徑膜包濃縮后血凝價、病毒含量并沒有太大差別；膜包孔徑為30 K和100 K時，從廢液HA和廢液病毒增殖上看，廢液病毒沒有流失；膜包孔徑為300 K時，廢液HA為3log2，但廢液病毒增殖并未發(fā)現(xiàn)感染，說明病毒流失不多（見表1）。

3.2 禽流感病毒（H9N2亞型，HP株）抗原濃縮用時用100 K膜包對5批AI抗原進(jìn)行2倍、3倍、4倍、5倍濃縮，濃縮過程記錄下濃縮所用時間，結(jié)果顯示濃縮倍數(shù)越大，濃縮用時越長。結(jié)果見表2。

表2 禽流感病毒（H9N2亞型，HP株）抗原濃縮不同濃縮倍數(shù)的用時

3.3 不同濃縮倍數(shù)樣品禽流感病毒（H9N2亞型，HP株）抗原HA測定對6批AI抗原進(jìn)行2倍、3倍、4倍、5倍濃縮，對每批抗原濃縮后的樣品測定HA，結(jié)果顯示濃縮后HA呈正相增長，但與濃縮倍數(shù)不是呈線型關(guān)系；廢液HA均為0，說明沒有病毒透過至廢液中。結(jié)果見表3。

3.4 不同濃縮倍數(shù)樣品禽流感病毒（H9N2亞型，HP株）抗原病毒含量EID50的測定對6批抗原進(jìn)行2倍、3倍、4倍、5倍濃縮，取樣測其病毒含量。結(jié)果顯示濃縮后EID50呈正相增長，廢液病毒增殖沒有發(fā)現(xiàn)感染。在濃縮2倍、3倍、4倍時EID50增長與理論值較為接近，但5倍濃縮時增長不多。結(jié)果見表4。

表1 不同孔徑膜包濃縮禽流感病毒（H9N2亞型，HP株）抗原結(jié)果對比

表3 不同濃縮倍數(shù)樣品禽流感病毒抗原HA的變化情況

表4 不同濃縮倍數(shù)樣品禽流感病毒抗原EID50的變化情況

4 結(jié)論與討論

1）該研究采用的切向流超濾濃縮技術(shù)可有效地用于AIV尿囊液的濃縮，同時選擇的超濾濃縮系統(tǒng)具有濃縮快速和樣品處理量大等特點，可1 h處理近百升的抗原液，適合于規(guī)?；a(chǎn)。本試驗可為其他病毒尿囊液或細(xì)胞培養(yǎng)液的濃縮提供參考。

2）在用300 K膜包濃縮過程中，病毒廢液HA為3log2，但濃縮廢液病毒增殖并沒有感染，濃縮后病毒含量并沒有明顯差別，說明濃縮過程有少量病毒透過，但對總體病毒含量影響不大。用30 K、 100 K膜包濃縮病毒HA均為0，濃縮廢液病毒增殖也沒有感染，30 K膜包濃縮后病毒含量相對較100 K、300 K高，但是濃縮時間比較長，效率較低，所以，100 K膜包更適合規(guī)?；a(chǎn)。

3）在病毒液濃縮過程中，病毒液的效價并沒有按照濃縮體積的倍數(shù)遞增，表明在濃縮過程中還會有部分病毒損失。AIV粒子直徑80～120 nm[7]，膜包孔徑為100 K、300 K，在濃縮過程中病毒有少部分透過，可能在濃縮過程中的剪切力對病毒也有一定損傷。在高濃縮倍數(shù)時，濃縮后HA和EID50均增長不多，且濃縮時間也比較長，效價損失較大，加上高濃縮倍數(shù)的生產(chǎn)成本也高，所以，在生產(chǎn)中不建議高濃縮倍數(shù)。

綜合考慮，生產(chǎn)中可以選用100 K膜包、2～3倍濃縮AIV來提高抗原病毒含量，另一方面應(yīng)在生產(chǎn)抗原時改進(jìn)抗原生產(chǎn)工藝來提升抗原效價，提升產(chǎn)品質(zhì)量。

[1]孫泉云,陳琦,夏爐明.H9N2亞型禽流感流行現(xiàn)狀[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2011,32(10):107-111.

[2]高彥生.香港發(fā)生人的H9N2禽流感[J].動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué),2004,21(10):26.

[3]陸海融,樊曉暉.禽流感病毒H9N2亞型的研究進(jìn)展[J].廣西醫(yī)學(xué),2005,27(5):699-701.

[4]阮武營,崔保安,李新生,等.新城疫病毒-減蛋綜合征病毒抗原液與抗原濃縮液的HA效價關(guān)系[J].中國畜牧獸醫(yī), 2010,37(1):180-181.

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[6]江興華.雞新城疫(La Sota株)活疫苗生產(chǎn)中不同時間段死亡雞胚胚液效價的研究[J].福建畜牧獸醫(yī),2006,28(6):34.

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福建省畜牧獸醫(yī)學(xué)會工作動態(tài)

根據(jù)《福建省畜牧獸醫(yī)學(xué)會章程》的相關(guān)規(guī)定，福建省畜牧獸醫(yī)學(xué)會第十二次會員代表大會擬于2017年9月下旬在福州舉行。會議將聽取并審議學(xué)會第十一屆理事會工作報告，審議《福建省畜牧獸醫(yī)學(xué)會章程（修改草案）》，選舉產(chǎn)生福建省畜牧獸醫(yī)學(xué)會第十二屆理事會，并進(jìn)行表彰獎勵。為確保大會順利召開，現(xiàn)正進(jìn)行大會代表和理事候選人選舉推薦工作，可關(guān)注不斷完善中的福建省畜牧業(yè)協(xié)會、福建省畜牧獸醫(yī)學(xué)會官網(wǎng)《福建畜牧網(wǎng)》(www.fjxmw.org.cn)。

為表彰在開展學(xué)術(shù)交流、科技咨詢、技術(shù)培訓(xùn)、科學(xué)普及等方面做出貢獻(xiàn)的學(xué)會會員，根據(jù)《福建省畜牧獸醫(yī)學(xué)會章程》及《福建省畜牧獸醫(yī)學(xué)會理事管理制度》的相關(guān)規(guī)定，福建省畜牧獸醫(yī)學(xué)會決定對2016-2017年度推廣畜牧獸醫(yī)科技先進(jìn)集體和學(xué)會工作先進(jìn)個人進(jìn)行表彰。評選結(jié)果將在《福建畜牧網(wǎng)》、《福建畜牧獸醫(yī)》雜志等相關(guān)媒體上公示。獲獎的先進(jìn)集體將授予牌匾、頒發(fā)證書，獲獎的先進(jìn)個人將頒發(fā)榮譽證書，并予以適當(dāng)獎勵。

（本刊訊）

Study on the concentration skills of antigen of avian influenza vaccines

Chen Liping Jiang Xinghua
（Fuzhou Dabeinong Biotechnology Co.Ltd.,Fuzhou 350014）

In order to increase antigen levels of avian influenza vaccines,avian influenza viruses（H9N2 subtype,HP strain）were concentrated with difference pore diameter uLtrafiltration membrane and difference concentration times by tangential flow filtration systems of Merck Millipore.And the HA and EID50of avian influenza viruses concentrated were examined to compare and analyze.The resuLts showed that more avian influenza viruses were wasting with increasing of pore diameter of uLtrafiltration membrane,but it took more time with decreasing of pore diameter.Also,HA and EID50increased depending on concentration times,and it took more time with increasing of concentration times.Overall,it shouLd synthetically consider relative molecuLar mass of antigen,HA,EID50and production efficiency to choose appropriate pore diameter uLtrafiltration membrane and concentration times in production of avian influenza vaccines.

Antigen concentration Avian influenza virus Vaccine Virus content

A

1003-4331（2017）04-0005-03