鄭娟娟姚保利邵曉鵬

1)(西安電子科技大學物理與光電工程學院,西安 710071)

2)(中國科學院西安光學精密機械研究所,瞬態(tài)光學與光子技術國家重點實驗室,西安710119)

基于光強傳輸方程相位成像的寬場相干反斯托克斯拉曼散射顯微背景抑制?

鄭娟娟1)姚保利2)?邵曉鵬1)

1)(西安電子科技大學物理與光電工程學院,西安 710071)

2)(中國科學院西安光學精密機械研究所,瞬態(tài)光學與光子技術國家重點實驗室,西安710119)

(2016年12月17日收到;2017年3月31日收到修改稿)

相干反斯托克斯拉曼散射(CARS)顯微能夠對樣品的特殊化學組分進行選擇性成像,無需熒光標記,在生物醫(yī)學領域被廣泛應用.然而,傳統(tǒng)的CARS圖像往往存在非共振背景信號.本文將基于光強傳輸方程的單光束相位成像技術用于CARS顯微成像,來抑制CARS的非共振背景信號.該方法通過記錄樣品在三個相鄰平面上的CARS圖像,然后利用光強傳輸方程獲取CARS光場的相位分布,最后利用共振CARS信號和非共振背景信號在相位上的差異,實現(xiàn)了對背景噪聲的抑制.該方法無需參考光,通過三次測量可完成CARS的背景噪聲抑制,具有良好的應用前景.

相干反斯托克斯拉曼散射顯微,相干成像,相位成像,背景噪聲

1 引言

相干反斯托克斯拉曼散射(coherent anti-Stokes Raman scattering,CARS)顯微成像是一種無需熒光標記、通過探測特定分子的振動來進行三維成像的顯微技術.該方法也是目前極具潛力的活體成像的重要手段之一,可以對生物體內脂類(不易被標記)、藥物等特定小分子物質,以及核酸、蛋白質等生物大分子進行無標記成像.CARS的成像過程是抽運光和斯托克斯光相互作用的非線性四波混頻過程.假定抽運光和斯托克斯光的頻率分別為ωP和ωS,當頻率差ωP?ωS與樣品中的分子振動頻率一致,將激發(fā)出頻率為ωAS=2ωP?ωS的反斯托克斯(anti-Stokes)光.CARS過程涉及四個光子相互作用,該過程滿足動量守恒和能量守恒關系,其中CARS信號的強度與激發(fā)光強度有以下關系:,式中,ICARS表示CARS信號的強度,IP和IS分別代表抽運光與斯托克斯光的強度.一般情況下,三階電極化張量χ(3)包括共振部分和非共振部分.其中,共振部分來自于特定的化學鍵的振動,是人們所關注的信息;非共振部分來自于極化過程中分子內電子的貢獻,它的存在使得CARS成像出現(xiàn)背景噪聲,降低了CARS圖像的信噪比.

迄今為止,人們對CARS成像的背景抑制已經開展了大量研究,例如,已經提出了反向探測法[3]、偏振法[4]、時間分辨法[5]和空間相位控制法[6]等來抑制背景噪聲.利用相位成像來抑制CARS的背景噪聲已逐漸成為該研究的主流方法:共振和非共振信號在相位上相差π/2,這使得通過相位成像來抑制背景噪聲成為可能.光學外差探測方法[7?12]就是通過這一點實現(xiàn)共振和非共振CARS信號的分離:該方法在CARS顯微鏡的基礎上,引入一個獨立的參考光,和分子輻射出的CARS光場進行干涉,利用相移技術可以從干涉圖樣中分離出共振信號和背景信號,達到去除背景噪聲的目的.該方法有較高的精度,但是需要引入一個獨立的參考光場和CARS光場進行干涉,增加了裝置的復雜性.同時,該方法對環(huán)境擾動(例如振動、溫度變化等)比較敏感.近期研究人員采用波前探測器來獲取CARS復振幅的相位,這種方法不需要參考光,可以進行相位成像[13,14].然而,該方法需要價格昂貴的高精度波前探測器,并且其空間分辨率受到了微透鏡孔徑的限制,不能滿足生物成像對分辨率方面的要求.我們也曾提出基于強度迭代的單光束相位成像技術來分離去除CARS成像中的背景噪聲[15],該方法需要記錄一系列的強度分布,通過迭代算法重構出CARS信號的相位分布.

光強傳輸方程(transport of intensity equation,TIE),于1983年由Teague[16]利用亥姆霍茲方程在傍軸近似條件下首次推導得出.TIE是一個二階橢圓型偏微分方程,闡明了平行于光軸方向上光強度的變化量與光波的相位之間的定量關系.與基于強度迭代的單光束相位成像技術[15]相比,該方法無需通過迭代來恢復相位,而是利用樣品像面附近的三幅光強分布(直接測量),通過數(shù)值求解光強傳輸方程,直接獲取物光波的相位分布.相比于傳統(tǒng)基于干涉的相位測量方法,該方法具有無需參考光、對照明光相干性要求低(可利用傳統(tǒng)明場顯微鏡中的鹵素燈科勒照明或LED照明)、無需相位解包裹(直接獲得絕對相位)、無需復雜的光學系統(tǒng)及苛刻的實驗環(huán)境等諸多獨特優(yōu)勢.在TIE相位成像的應用方面:Roddier[17]將光強傳輸方程TIE應用于自適應光學領域.Nugent等[18,19]成功地將基于TIE的相位成像技術應用于X射線衍射成像與中子射線成像領域.近年來,基于TIE的相位成像技術還被廣泛應用于電子顯微學[20]、光學顯微定量相位成像[21,22].例如,左超等[23]將光強傳輸方程理論應用在活細胞的動態(tài)高分辨率定量相位顯微成像等.

本文將基于光強傳輸方程的相位成像應用于CARS顯微,實現(xiàn)了對CARS非共振背景信號的有效抑制.該方法通過記錄樣品像面附近三個相鄰空間平面上的CARS強度圖像,然后采用光強傳輸方程獲取CARS光場的相位分布,實現(xiàn)了對背景噪聲的抑制.這種抑制背景噪聲的方法無需參考光,裝置簡單,實用性強,對于高信噪比CARS成像具有一定的借鑒意義.

2 基于TIE的CARS相位成像技術

圖1 (網(wǎng)刊彩色)CARS相位成像裝置示意圖Fig.1.(color online)Schematic setup for CARS phase imaging.

基于TIE的CARS相位成像所采用的實驗裝置如圖1所示:一波長為532 nm的Neodymium-Vanadate激光器用來抽運一個Titanium-Sapphire激光器,輸出重復頻率為76 MHz,波長為829.93 nm的脈沖激光.輸出的激光經光束分束器分成兩束:第一束光被用作斯托克斯光,另一束經過一光學參量放大器OPO,產生在600—1000 nm范圍內波長可調諧的抽運光.抽運光和斯托克斯光分別經過望遠鏡系統(tǒng)L3-L4和L1-L2縮束5倍,然后通過二向色分光鏡BS的合束作用實現(xiàn)空間上重合在一起.通過調節(jié)時間延遲裝置,使得抽運光和斯托克斯光在時間上實現(xiàn)脈沖重合.重合的兩束光經過物鏡MO1聚焦到樣品上.產生的CARS信號通過物鏡MO2和透鏡L5組成的望遠鏡系統(tǒng)成像到CMOS相機上.濾光片(Semrock FF01-650/SP-25和FF01-563/9-25)用來濾掉抽運光和斯托克斯光.該成像系統(tǒng)總放大倍率為60倍,成像視場大小為50μm×50μm.物鏡MO2的數(shù)值孔徑為0.75,決定了成像裝置的橫向分辨率為458 nm.

在CARS成像過程中,通過調節(jié)抽運光的波長,使得抽運光和斯托克斯光的頻率差與樣品的共振頻率相匹配.當調節(jié)斯托克斯光和抽運光之間的頻率差與樣品中分子的振動鍵相匹配時,樣品在共振模式下輻射出共振CARS信號.當斯托克斯光和抽運光的頻率差調到遠離樣品分子的振動區(qū)域時,樣品在非共振模式下產生CARS背景信號非共振CARS場和共振CARS場可以分別表示為[13?15]

φχ常被稱為振動相位.由(2)式可知,當沒有共振信號時,φχ等于零;有共振信號存在時,由共振和非共振CARS場的比值決定φχ的值,φχ的具體范圍在0到π/2之間.反而言之,利用該相位差異可以實現(xiàn)CARS光場的去背景:表示去除背景噪聲后的CARS光場,表示共振模式下CARS信號的總強度.在本文提出的方法中,我們對共振模式和非共振模式下的CARS光場分別進行相位成像,最后得到φχ,從而對非共振信號進行抑制.

在本文提出的方法中,為了求解CARS光場(如共振模式下的CARS光場)的相位分布,我們記錄沿軸向方向樣品像平面附近三個空間平面內的強度圖樣I?1(x,y),I0(x,y)和I1(x,y),如圖2所示.根據(jù)光TIE,這三個強度分布和光場的相位存在以下關系:

這里,φ0(x,y)為像平面的相位.?=?xex+?yey是在x-y平面的二維梯度算符;ex,ey是單位方向矢量;λ是光波波長;z是相鄰平面間的距離.在求解φ0(x,y)過程中,用一個輔助函數(shù)?ψ來取代(3)式中I0?φ0[24?26]:

圖2 (網(wǎng)刊彩色)TIE-CARS相位成像示意圖Fig.2.(color online)Schematic diagram for TIECARS phase imaging.

這里,FT{·}是二維傅里葉變換算符;κx和κy分別是在x和y方向的頻譜坐標.通過對(5)式取逆傅里葉變換可解出ψ(x,y).再利用I0?φ0=?ψ,可以重構相位導數(shù)φx和φy.最終,通過利用Frankot–Chellappa算法[27?29]對相位梯度進行積分可以再現(xiàn)出CARS光場的相位分布:

這里,FT{}和IFT{}分別指傅里葉變換算符和逆傅里葉變換算符.該方法僅需要記錄三幅強度分布就可以再現(xiàn)出物光場的相位分布,具有相位獲取速度快的優(yōu)點.這個方法直接重構了相位,避免了傳統(tǒng)相位成像[30?34]中的相位解包裹程序.然而,上述方法是通過求解相位函數(shù)的導數(shù),然后通過(6)式的積分來獲取被測場的相位分布.因此,該方法僅可以用于相位連續(xù)變化的樣品.

圖3 (網(wǎng)刊彩色)基于TIE方法的CARS相位成像(a),(b)共振CARS和非共振CARS分別在z=?2,0,2 mm處的強度分布;(c),(d)共振CARS在x和y方向的相位梯度;(e)再現(xiàn)出的共振CARS場的相位分布Fig.3.(color online)TIE based CARS phase imaging:(a)and(b)Intensity distributions at the position z=?2,0,2 mm of the CARS fi eld under resonant and nonresonant mode,respectively;(c)and(d)the phase derivatives of the resonant CARS along x and y direction,respectively;(e)the reconstructed phase of the resonant CARS fi eld by integrating the phase derivations in(c)and(d).

3 實驗結果

我們對基于TIE方法的CARS相位成像實驗進行了驗證.將直徑為5μm的聚苯乙烯粒子浸在折射率為1.59的ZnI2溶液中作為樣品,其中ZnI2溶液是用來減小聚苯乙烯粒子與周圍非共振介質之間的折射率差.我們調節(jié)OPO的抽運光的輸出波長(光譜寬度0.4 nm)至668.5 nm,和聚苯乙烯的拉曼振動光譜2915 cm?1相匹配,此時對應共振CARS成像模式.通過沿軸向方向在樣品的像平面附近移動探測器,記錄彼此間隔為2 mm的三幅CARS的強度圖像,其強度分布分別如圖3(a)所示.同時,調節(jié)OPO的輸出波長至675 nm,此時為非共振成像模式.同樣記錄間隔為2 mm的三幅CARS強度圖像,如圖3(b)所示.

利用(3)—(6)式,可以得到共振和非共振模式下的CARS場的相位分布.圖3(c)和圖3(d)顯示了共振CARS在x和y方向的相位梯度,而圖3(e)表示共振模式下CARS場的相位分布.利用相同方法我們也計算了非共振模式CARS光場的相位分布利用(7)式可以得到抑制背景后的CARS強度圖像,如圖4(b)所示.與傳統(tǒng)的CARS圖像(如圖4(a)所示)相比,圖4(a)中聚苯乙烯粒子和周圍的ZnI2溶液之間都存在CARS信號,而圖4(b)中聚苯乙烯粒子被高亮度地顯示出來,非共振背景得到了很好的抑制.

圖4 (網(wǎng)刊彩色)基于TIE相位成像技術的CARS背景抑制(a)共振CARS在z=0 mm處的強度分布;(b)聚苯乙烯無背景的CARS強度.Fig.4.(color online)CARS imaging with background suppression based on TIE:(a)Intensity distribution of the resonant CARS image of polystyrene beads at z=0 mm position;(b)intensity distribution of the resonant CARS image after background suppression.

為了更好地驗證TIE相位成像技術在CARS去背景上的可行性和有效性,我們將該技術與文獻[15]中報道的基于迭代法CARS相位成像技術在CARS去背景上進行了比較.基于迭代的CARS相位方法[15]需要記錄不同軸向距離下的多幅CARS強度圖像(如圖5(a)中I?3,I?2,···,I2,I3所示),通過在這7幅圖像之間反復迭代獲得CARS光場的相位分布.最后,利用相位圖像得到去背景后的CARS強度分布,如圖5(b)所示.TIE相位成像技術只需記錄CARS光場在像面附近的三幅強度圖像(圖5(a)中I?1,I0,I1),采用TIE方法獲取CARS的相位圖像.利用(7)式可以得到去背景后的CARS強度分布,如圖5(c)所示.圖5(d)定量比較了圖5(a)—圖5(c)中三條虛線對應的強度分布.方便起見,我們將圖像信噪比定義為:CARS共振信號(來自聚乙烯小球中心)與背景噪聲(無聚乙烯小球區(qū)域強度分布的平均值)之間的比值.傳統(tǒng)CARS成像、基于迭代的方法以及基于TIE相位成像方法對應的信噪比分別為:2.8±0.2,102.4±4.6,53.2±3.0.三者的比較說明,基于相位成像的CARS去背景技術都可以有效地抑制CARS成像中的背景噪聲.雖然基于迭代的方法[15]具有更好的噪聲抑制能力,但是需要記錄更多的強度圖像.基于TIE相位成像方法僅僅需要記錄三幅強度分布,可以將信噪比提高10倍以上,更加適合于快速CARS相位成像.需要說明的是,本文報道的方法以及其他相位成像技術不能提高由系統(tǒng)衍射極限所決定的成像分辨率,僅能減小背景噪聲和相位畸變對成像分辨率的影響.

4 結論

CARS顯微能夠在無需熒光標記的前提下對樣品的特殊化學鍵進行選擇性成像.在CARS成像過程中,獲取的CARS圖像往往存在著非共振背景信號.本文從實驗上證明了采用TIE方法可以有效地抑制寬場CARS成像中的非共振背景噪聲.該方法是基于光傳輸?shù)膯喂馐辔怀上穹椒?可以在不需要參考光的前提下實現(xiàn)相位成像,本文利用該方法實現(xiàn)了去除CARS成像中的背景噪聲.該方法僅需要記錄三幅強度分布就可以再現(xiàn)出物光場的相位分布,相位成像速度快.這個方法直接重構了相位,避免了傳統(tǒng)相位成像中的相位解包裹程序.與此同時,本文的方法也存在不足,該方法是通過求解相位函數(shù)的導數(shù),然后通過積分來獲取被測場的相位分布.因此,該方法僅可以用于相位連續(xù)變化的樣品.

圖5 (網(wǎng)刊彩色)基于TIE相位成像技術與迭代相位成像技術的CARS背景抑制比較(a)在共振模式下CCD沿軸向依次移動2 mm所得的7幅CARS強度圖像;(b)利用迭代方法[15]從I?3,I?2,···,I2,I3中所得到的去背景后的CARS圖像;(c)利用TIE相位成像方法從I?1,I0和I1中得到的去背景后的CARS圖像;(d)圖(a),(b),(c)中的虛線對應的強度分布Fig.5.(color online)Comparison of the proposed method with the reported iterative phase imaging method[15]on CARS background suppression:(a)7 intensity distributions recorded of the resonant CARS fi eld at di ff erent axial position with the interval of 2 mm;(b)obtained CARS image with background suppression from I?3,I?2,···,I3by using the iterative method;(c)obtained CARS image from I?1,I0,I1by using TIE based method;(d)intensity pro fi le of the dashed line in(b)and(c).

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PACS:42.65.Dr,42.30.Rx,42.25.Kb,42.30.–dDOI:10.7498/aps.66.114206

Nonresonant background suppression in wide- fi eld coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy with transport of intensity equation based phase imaging?

Zheng Juan-Juan1)Yao Bao-Li2)?Shao Xiao-Peng1)
1)(School of Physics and Optoelectronic Engineering,Xidian University,Xi’an 710071,China)
2)(State Key Laboratory of Transient Optics and Photonics,Xi’an Institute of Optics and Precision Mechanics,Chinese Academy of Sciences,Xi’an 710119,China)

17 December 2016;revised manuscript

31 March 2017)

Coherent anti-Stokes Raman scattering(CARS)microscopy is a valuable tool for label-free imaging of biological samples,since it enables providing contrast via vibrational resonances of a speci fi c chemical bond.However,in a conventional CARS image the Raman resonant anti-Stokes radiation is often superimposed by a nonresonant contribution arising from the electronic part of the polarization.The situation becomes worse if a sample is composed of a signi fi cant amount of water,where a strong nonresonant background over the whole image is obtained.

To date,various approaches including Epi,polarization sensitive,time-resolved,and CARS phase imaging have been implemented to suppress the undesirable nonresonant background in CARS microscopy.Notably,optical heterodyne based phase imaging schemes are of particular interest due to their intrinsic ability to retrieve Im(χ(3)),which is proportional to the Raman resonant signal.Nevertheless,all the reported phase imaging methods that require an independent reference wave lead to an increase in the setup complexity,thus making the measurement sensitive to external perturbations.In order to simplify the setup,single-beam scheme has also been utilized for vibrational CARS imaging by using wave-front sensors to acquire the phase of the complex anti-Stokes amplitude.However,this method demands highly accurate wave-front sensors.

In this paper we present a reference-less CARS phase imaging technique to suppress nonresonant CARS background based on transport of intensity equation(TIE).Resonant CARS radiationcan be obtained when the frequency di ff erence between the pump and Stokes beams is tuned to match a molecular vibration frequency(Raman resonant mode).In contrast,the nonresonant backgroundcan be obtained when the frequency di ff erence between the pump and Stokes beams does not match a molecular vibration frequency(Raman resonant mode).Considering the fact that there is a phase shift of π/2 between the resonant and non-resonant CARS fi eld,the phase imaging of both resonant and nonresonant CARS fi eld can provide a background-free image.In implementation,three intensity images of the CARS fi eld under resonant mode are recorded at three neighboring planes by moving the CCD camera along the axial direction.In the meantime,three images of the CARS fi eld under non-resonant mode are also recorded.Considering the fact that the TIE links the intensity distributions in three neighboring planes(through which a beam transverses)with the phase distribution of the fi eld,the phase images of the CARS fi eld under both resonant and nonresonant modes are reconstructed from the recorded intensity images.The phase di ff erence φχbetween the resonant CARS fi eld and the non-resonant CARS fi eld is calculated.Eventually,the CARS background is efficiently suppressed by using the relation

Compared with conventional CARS background suppression techniques,the proposed method is robust against environmental disturbance,since it does not require an additional reference beam.Furthermore,the proposed method is easy to incorporate in a conventional CARS con fi guration.Therefore,the proposed method has the potential to become a versatile technique to image deep tissue with low background signal.

coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy,coherent imaging,phase imaging,nonresonant background

10.7498/aps.66.114206

?國家自然科學基金(批準號:61605150,61475187,61575154,61377008)、中央高校基本科研業(yè)務費專項資金(批準號:JB160511,

XJS16005,JBG160502)、the“Thüringer Ministerium für Bildung,Wissenschaft und Kultur”(TMBWK,projects:B578-06001,14.90HWP,B714-07037),and the“Carl Zeiss Stiftung”and the Federal Ministry of Education and Research,Germany(FKZ:13N10508)資助的課題.

?通信作者.E-mail:yaobl@opt.ac.cn

?2017中國物理學會Chinese Physical Society

http://wulixb.iphy.ac.cn

*Project supported by the National Natural Science Foundation of China(Grant Nos.61605150,61475187,61575154,61377008),the Fundamental Research Funds for the Central Universities,China(Grant Nos.JB160511,XJS16005,JBG160502),the‘Thüringer Ministerium für Bildung,Wissenschaft und Kultur’(TMBWK,projects:B578-06001,14.90 HWP,B714-07037),and the‘Carl Zeiss Stiftung’and the Federal Ministry of Education and Research,Germany(FKZ:13N10508).

?Corresponding author.E-mail:yaobl@opt.ac.cn