班一云, 丁 波, 周雪平

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100193)

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湖南省番茄和牽?；ㄉ想p生病毒的分子鑒定

班一云, 丁 波*, 周雪平*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 植物病蟲(chóng)害生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京 100193)

雙生病毒是一類在全世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生的單鏈環(huán)狀DNA病毒。本文對(duì)從湖南采集到的6例(洋姜、番茄、蘿卜、賽葵、甘薯、牽牛花)疑似雙生病毒侵染的植物葉片進(jìn)行了分子鑒定。利用滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(RCA)對(duì)樣品DNA進(jìn)行擴(kuò)增,分別對(duì)其RCA產(chǎn)物進(jìn)行酶切,并將酶切得到的片段測(cè)序后進(jìn)行BLAST比對(duì),結(jié)果顯示番茄樣品中的病毒分離物與番茄黃化曲葉病毒相似性最高(99%),牽?；悠分械牟《痉蛛x物與甘薯卷葉病毒相似性最高(99%),證明這兩個(gè)分離物是單組分DNA-A雙生病毒。這是在湖南省首次發(fā)現(xiàn)并報(bào)道雙生病毒的全核酸序列。

番茄黃化曲葉病毒; 甘薯卷葉病毒; DNA-A

雙生病毒是一類具有孿生顆粒形態(tài)的植物單鏈DNA病毒,一般發(fā)生在熱帶和亞熱帶地區(qū),寄主范圍十分廣泛,在全球范圍內(nèi)造成重大損失[1]。番茄黃化曲葉病毒Tomatoyellowleafcurlvirus(TYLCV)和甘薯卷葉病毒Sweetpotatoleafcurlvirus(SPLCV)均屬于雙生病毒科Geminiviridae的菜豆金色花葉病毒屬Begomovirus,該屬病毒主要以煙粉虱傳播,危害極為嚴(yán)重[2-4]。番茄黃化曲葉病毒是侵染番茄LycopersiconesculentumMill的主要病毒之一,最早在以色列被發(fā)現(xiàn),1964年正式被命名[5]。該病毒引起植株曲葉、黃化、矮化等癥狀,常對(duì)番茄栽培地區(qū)造成毀滅性危害[6]。我國(guó)是世界上最大的甘薯IpomoeabatatasLan生產(chǎn)國(guó),而甘薯卷葉病毒主要侵染旋花科植物,其危害嚴(yán)重阻礙了甘薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[7-8]。牽?；≒harbitisnil是一種觀賞植物,并且具有藥用價(jià)值,其生長(zhǎng)適應(yīng)性強(qiáng),田間路邊隨處可見(jiàn)。研究表明,雙生病毒可經(jīng)煙粉虱在牽?；ㄅc作物之間相互傳播[9-10],因此牽牛花對(duì)雙生病毒重組、傳播及擴(kuò)散都有重要的作用,對(duì)作物生產(chǎn)構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅[11]。目前,受全球氣候變暖、國(guó)際貿(mào)易加強(qiáng)及人類活動(dòng)等影響,雙生病毒病害在我國(guó)的危害范圍不斷擴(kuò)大[12]。因此,對(duì)不同地區(qū)、不同寄主的雙生病毒進(jìn)行鑒定,進(jìn)一步明確該病害在我國(guó)的發(fā)生、分布及危害情況可為病毒病防控打下基礎(chǔ)。本研究對(duì)從湖南省采集的樣品進(jìn)行了分子鑒定,發(fā)現(xiàn)番茄樣品被TYLCV侵染,而牽?；悠繁籗PLCV侵染,TYLCV和SPLCV分離物的全基因組大小均約2.8 kb的單鏈環(huán)狀DNA分子。病毒基因組共編碼6個(gè)開(kāi)放閱讀框(open reading frame,ORF),分別為AV1、AV2、AC1、AC2、AC3和AC4[13-15],并未檢測(cè)到DNA-B和DNAβ組分。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集

2016年10月在湖南省長(zhǎng)沙市采集到疑似被雙生病毒侵染的植物葉片樣品6份,分別為洋姜、番茄(圖1a)、蘿卜、賽葵、甘薯和牽?；?圖1b)。陽(yáng)性對(duì)照為本實(shí)驗(yàn)室保存的番茄黃化曲葉病毒和甘薯卷葉病毒。

圖1 從湖南省采集的番茄和牽?；悠返母胁“Y狀Fig.1 Symptoms of tomato and morning glory samples collected from Hunan Province

1.1.2 試劑及儀器

FastDigest內(nèi)切酶,購(gòu)自Thermo Scientific公司;pLB零背景快速克隆試劑盒,購(gòu)自天根生化科技公司;2×EasyTaqPCR Super Mix,購(gòu)自全式金生物技術(shù)公司;KOD-Plus-Neo高保真酶試劑盒,購(gòu)自Toyobo公司;E.Z.N.A.Gel Extraction Kit,購(gòu)自O(shè)mega Bio-Tek公司;TempliPhi Amplification Kit,購(gòu)自GE公司;Centrifuge 5424離心機(jī),購(gòu)自Eppendorf公司;Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng),T100 Thermal Cycler PCR儀,購(gòu)自Bio-Rad公司;Tissuelyser-48全自動(dòng)快速樣品研磨儀,購(gòu)自上海凈信科技公司。

1.2 方法

1.2.1 葉片總DNA提取

采用CTAB法提取樣品葉片總DNA。分別取0.1 g葉片組織放入預(yù)先加入一枚鋼珠的2 mL離心管中,液氮速凍后利用全自動(dòng)快速樣品研磨儀將樣品研磨至粉狀,加入500 μL 65℃水浴預(yù)熱的2% CTAB抽提緩沖液,65℃水浴保溫1 h后加入等體積的24∶1的氯仿/異戊醇振蕩混勻,12 000 r/min離心10 min,轉(zhuǎn)移上清至新的1.5 mL離心管中。然后加入1/10體積醋酸鈉(pH=5.2)和2倍體積的-20℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇,混勻后于-20℃放置1 h,12 000 r/min離心10 min以沉淀DNA,棄上清后用1 mL 75%乙醇將沉淀清洗1次,12 000 r/min離心10 min棄上清后干燥,最后加入適量去離子水溶解DNA,置于-20℃保存。

1.2.2 病毒基因組的滾環(huán)擴(kuò)增及酶切鑒定

利用TempliPhi Amplification Kit對(duì)樣品總DNA進(jìn)行滾環(huán)擴(kuò)增。將1 μL DNA(約10～20 ng)加入到5 μL樣品緩沖液中,95℃變性3 min后立即置于冰上10 min,然后加入5 μL反應(yīng)緩沖液和0.2 μL DNA聚合酶,混勻后置于30℃反應(yīng)18～20 h,最后65℃加熱10 min以終止反應(yīng)。選取多種雙生病毒含有的酶切位點(diǎn),采用相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶分別對(duì)6個(gè)樣品的RCA產(chǎn)物進(jìn)行酶切以獲得特異性片段。

1.2.3 病毒基因組的克隆測(cè)序及全長(zhǎng)序列獲取

將酶切得到的片段連接至pLB載體,由北京擎科生物公司進(jìn)行測(cè)序,在NCBI網(wǎng)站對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST比對(duì),結(jié)果表明番茄樣品分離物與TYLCV的相似性最高,牽牛花樣品分離物與SPLCV的相似性最高。根據(jù)測(cè)得的部分序列設(shè)計(jì)特異引物對(duì)：NdeI-F(5′-AAGTATGAGAATCATACTGAAAA-CGCC-3′)/NdeI-R(5′-GGCTGCCTCCTGATGATTATAAGTT-3′)和NcoI-F(5′-CAGATCGAATCA-CTTTCACCCCA-3′)/NcoI-R(5′-TTCGGTGAGACCAGATCGAAGA-3′)分別擴(kuò)增番茄樣品和牽牛花樣品分離物的DNA-A全長(zhǎng)。同時(shí)分別利用DNA-B組分的通用引物CR01/CR02[2]和DNA-β的通用引物beta01/beta02[16]對(duì)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以期獲得DNA-B和DNA-β序列。

1.2.4 病毒基因組序列比對(duì)及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

利用DNAMAN 5.2.2軟件對(duì)篩選的陽(yáng)性克隆序列進(jìn)行比對(duì),最終確定病毒分離物的基因組全序列。在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST相似性比對(duì)分析,并從中選取已報(bào)道的TYLCV和SPLCV的代表性同源序列,在MEGA 6.0[17]中采用鄰接法(Neighbor-joining)構(gòu)建全基因組序列進(jìn)化樹(shù),系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中bootstrap參數(shù)值設(shè)置為1 000。

2 結(jié)果與分析

2.1 RCA產(chǎn)物酶切檢測(cè)

以提取的植物基因組總DNA為模板分別進(jìn)行RCA擴(kuò)增,通過(guò)酶切樣品的RCA產(chǎn)物,從番茄和牽?；悠分芯玫搅?.5～3.0 kb左右的條帶(圖2),割膠純化后克隆測(cè)序,序列BLAST比對(duì)結(jié)果顯示，番茄樣品的分離物與GenBank中番茄黃化曲葉病毒(KX034547)的相似性最高(99%),命名為TYLCV-HN(KY783940);牽?；悠分械姆蛛x物與甘薯卷葉病毒(FJ176701)的相似性最高(99%),命名為SPLCV-HN(KY783941)。利用通用引物CR01/CR02[2]和beta01/beta02[16]對(duì)樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果均未檢測(cè)到DNA-B或DNA-β組分,推測(cè)TYLCV-HN和SPLCV-HN均為僅含有DNA-A組分的單組分雙生病毒。

圖2 湖南省采集樣品的RCA產(chǎn)物的酶切鑒定Fig.2 Enzyme digestion on the RCA products of samples from Hunan Province

2.2 病毒基因組的序列測(cè)定和分析

通過(guò)酶切RCA產(chǎn)物得到番茄和牽牛花樣品分離物的基因組片段,分別設(shè)計(jì)特異引物擴(kuò)增DNA-A全長(zhǎng)(圖3),每個(gè)分離物均檢測(cè)3個(gè)陽(yáng)性克隆,測(cè)序結(jié)果表明各分離物病毒基因組序列之間無(wú)任何差異。其中,TYLCV-HN全長(zhǎng)為2 781 bp,為單鏈閉合環(huán)狀DNA,共編碼6個(gè)ORF,其中病毒鏈編碼2個(gè)ORF：AV1(308-1084)和AV2(148-498),互補(bǔ)鏈編碼4個(gè)ORF：AC1(1542-2615)、AC2(1226-1633)、AC3(1081-1485)和AC4(2171-2464)。SPLCV-HN全長(zhǎng)為2 827 bp,為單鏈閉合環(huán)狀DNA,共編碼6個(gè)ORF,其中病毒鏈編碼2個(gè)ORF：AV1(301-1065)和AV2(132-476),互補(bǔ)鏈編碼4個(gè)ORF：AC1(1587-2681)、AC2(1232-1678)、AC3(1081-1515)和AC4(2267-2524)。

圖3 利用特異引物擴(kuò)增番茄樣品和牽?；悠分须p生病毒分離物基因組全長(zhǎng)Fig.3 PCR amplification of the full genome of the geminiviruses on tomato and morning glory with specific primers

2.3 TYLCV-HN及SPLCV-HN的序列分析

從NCBI中選取有代表性的同源序列和TYLCV-HN和SPLCV-HN序列進(jìn)行序列比對(duì),采用鄰接法(neighbor-joining)分別對(duì)TYLCV和SPLCV構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)(圖4)。從進(jìn)化樹(shù)圖中可以看出,TYLCV-HN與云南分離物的親緣關(guān)系最近(圖4a),SPLCV-HN與江蘇、安徽等地分離物的親緣關(guān)系最近(圖4b)。

3 討論

本研究通過(guò)對(duì)從湖南省采集的6例樣品進(jìn)行檢測(cè)及鑒定,證明雙生病毒的危害進(jìn)一步擴(kuò)大到了湖南省,為進(jìn)一步研究我國(guó)雙生病毒的分布情況及分子變異情況提供了一定的科學(xué)依據(jù)。根據(jù)雙生病毒科病毒的命名規(guī)則,全基因組核酸序列的相似性大于89%被命名為同種病毒的不同株系,小于89%則被命名為不同種的病毒[18],因此將TYLCV-HN確定為TYLCV的一個(gè)分離物,SPLCV-HN為SPLCV的一個(gè)分離物。這是首次在湖南省發(fā)現(xiàn)并報(bào)道雙生病毒。

圖4 TYLCV和SPLCV不同分離物的核苷酸序列進(jìn)化樹(shù)Fig.4 Phylogenetic tree based on nucleotide sequences of different isolates of TYLCV and SPLCV

番茄在湖南省的生產(chǎn)生活中占有重要地位,它不僅是人們?nèi)粘Ｊ秤玫闹饕卟?番茄產(chǎn)業(yè)也為當(dāng)?shù)氐霓r(nóng)民增加了收入。然而,番茄黃化曲葉病毒病是一種發(fā)生于番茄上的毀滅性病害[19],它嚴(yán)重制約了番茄產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。目前,該病害在我國(guó)傳播呈現(xiàn)出由南向北的發(fā)展趨勢(shì),并且逐年加重[20]。從進(jìn)化樹(shù)關(guān)系圖中可以看出,TYLCV-HN和云南等省市的分離物的序列親緣關(guān)系最近,并且其保守性也很高,所以我們推測(cè)從湖南省檢測(cè)到的雙生病毒很可能是從周邊省份傳入。湖北省與湖南省相鄰,并且在2015年已有雙生病毒發(fā)生的報(bào)道[21],但是兩地分離物的親緣關(guān)系卻不是最近(圖4a),可見(jiàn)分離物親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近并不與地域呈正相關(guān)。

由于TYLCV可隨種苗等傳播,所以有必要在調(diào)種前進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)也建議加強(qiáng)田間管理工作,及時(shí)清除病苗和適時(shí)施肥等[22];而積極培育選擇抗病品種也會(huì)在很大程度上減少經(jīng)濟(jì)損失。

甘薯卷葉病毒主要侵染旋花科植物,在中國(guó)從南到北均有發(fā)生,不但危害了甘薯產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,還嚴(yán)重影響了牽牛花的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[7-8]。作為一種主要的觀賞植物,牽?；ㄔ谔镩g路邊隨處可見(jiàn)。研究表明,雙生病毒可經(jīng)煙粉虱在牽?；ㄅc作物之間互傳,作為雙生病毒的中間寄主,牽?；▽?duì)其重組、傳播及擴(kuò)散都有重要的作用[9]。因此,在平時(shí)作物生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)加強(qiáng)檢疫,使用無(wú)毒種苗,發(fā)現(xiàn)病株后及時(shí)拔除。

RCA是一種新近發(fā)展起來(lái)的恒溫核酸擴(kuò)增方法,可以直接從樣品總DNA擴(kuò)增目的DNA,實(shí)現(xiàn)對(duì)靶病毒的信號(hào)放大,在生物大分子檢測(cè)方面有重要的應(yīng)用價(jià)值,同時(shí)也提高了雙生病毒的檢出率[23-24]。本研究通過(guò)酶切樣品的RCA產(chǎn)物快速準(zhǔn)確地檢測(cè)到番茄和牽?；悠分械碾p生病毒序列,進(jìn)一步明確了該病害在我國(guó)的發(fā)生及分布情況,為雙生病毒病害的防控提供了參考。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

Molecular identification of geminiviruses on tomato and morning glory in Hunan Province

Ban Yiyun, Ding Bo, Zhou Xueping

(StateKeyLaboratoryforBiologyofPlantDiseasesandInsectPests,InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China)

Geminiviruses including a group of single-stranded circular DNA viruses occurred worldwide. Six plant samples collected from Hunan Province with symptoms of suspicious geminivirus infection were examined in this study. After conducting rolling circle amplification (RCA), the RCA products were digested by restriction endonuclease. Sequencing analysis revealed that virus isolates from tomato and morning glory shared 99% of homology withTomatoyellowleafcurlvirus(TYLCV) andSweetpotatoleafcurlvirus(SPLCV), respectively. These results indicated that tomato and morning glory plants were infected by monopartite geminivirus, and this is the first report of geminivirus infection in Hunan Province.

Tomatoyellowleafcurlvirus;Sweetpotatoleafcurlvirus; DNA-A

研究簡(jiǎn)報(bào)ResearchNotes

2017-03-25

2017-04-27

國(guó)家自然科學(xué)基金重大項(xiàng)目(31390422)

S 436

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.04.025

* 通信作者 E-mail:bding@ippcaas.cn;zzhou@zju.edu.cn