黃懷冬, 肖姬玲, 張 屹, 阮萬輝, 魏 林, 梁志懷*

(1. 中南大學(xué)研究生院隆平分院, 長沙 410125; 2. 湖南省西瓜甜瓜研究所, 長沙 410125; 3. 湖南省植物保護(hù)研究所, 長沙 410125)

?

一種改進(jìn)的尖孢鐮刀菌的實時熒光定量PCR檢測方法

黃懷冬1,2, 肖姬玲2, 張 屹2, 阮萬輝2, 魏 林3, 梁志懷1,2*

(1. 中南大學(xué)研究生院隆平分院, 長沙 410125; 2. 湖南省西瓜甜瓜研究所, 長沙 410125; 3. 湖南省植物保護(hù)研究所, 長沙 410125)

為實現(xiàn)熒光定量PCR對土壤病原真菌數(shù)量更為高效、靈敏的檢測,本研究將液體培養(yǎng)的孢子懸浮液和長年耕作的水稻土制作成孢子濃度為4×101～4×106spore/g的帶菌土,采用MoBio PowerSoil@DNA Isolation Kit提取模擬帶菌土壤總DNA,引入常規(guī)PCR預(yù)擴(kuò)增包含qPCR目標(biāo)序列的1 446 bp片段,以預(yù)PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行qPCR，構(gòu)建熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。研究結(jié)果表明:以試劑盒提取的帶菌土壤總DNA為模板繪制的qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)r為0.985,檢測下限為4×103spore/g土;引入預(yù)PCR后,qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)r為0.974,檢測下限為4×102spore/g土,較未引入時提高了10倍,結(jié)合不同土壤病原真菌的特異性引物,該檢測方法可為土壤病原真菌的有效定量檢測提供技術(shù)支撐。

實時熒光定量PCR; 土壤病原真菌; 尖孢鐮刀菌; 檢測下限

土壤是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的基本資料,土壤供給和協(xié)調(diào)農(nóng)作物生長發(fā)育所需要的水分、養(yǎng)分、空氣、熱量、扎根條件等。但是土壤中同樣存在危害農(nóng)作物生長的土傳病原菌,這些病原菌在條件適宜時從作物根部或莖部侵入作物而引起病害,且具有傳播途徑多樣,暴發(fā)迅速和應(yīng)急防治難的特點,給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成重大經(jīng)濟(jì)損失[1]。若能快速及時地鑒定土壤中病原菌的種類和數(shù)量,在病菌侵染和暴發(fā)初期采取有效的防治措施可最大限度地避免經(jīng)濟(jì)損失。隨著對病害研究的深入,對病原菌的研究和檢測進(jìn)入到?；秃蜕硇》N的層次。以往對土壤病原菌的診斷主要依靠病原菌的分離培養(yǎng),采用特異性的分離培養(yǎng)基能有效定量土壤中活體菌株的數(shù)量,但因分離培養(yǎng)基的局限性要實現(xiàn)對土壤中病原菌各?；图案魃硇》N的分離定量較為困難,加之分離培養(yǎng)耗時相對較長,不能確定有效防治時期。因此,建立一種快速、準(zhǔn)確、定量檢測土壤病原菌的技術(shù),對于病害的診斷和防治具有重要意義。

實時熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR)技術(shù)是一種新型核酸定量技術(shù)[2]。與普通PCR相比,具有自動化程度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確等特點,目前在動物醫(yī)學(xué)病理和分子生物學(xué)研究領(lǐng)域應(yīng)用十分廣泛[3]。近年來,隨著新一代基因測序技術(shù)的發(fā)展,測序成本大大降低,越來越多的植物病原菌的DNA測序工作完成,隨之開發(fā)的不同病原菌的特異分子標(biāo)記為實時熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)用于植物病原菌的檢測開啟了大門[4-7]。

由于土壤環(huán)境中含有大量腐殖質(zhì)酸、酚類化合物等化學(xué)特性與DNA十分相近的有機(jī)質(zhì)[8],高效獲取高質(zhì)量的土壤總DNA較為困難,而總DNA的提取效率和質(zhì)量與熒光定量PCR檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性密切相關(guān)[9]。以往土壤病原菌數(shù)量檢測體系的建立多采用帶目標(biāo)擴(kuò)增片段的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板,或是采用帶菌基質(zhì)模擬帶菌自然土壤建立標(biāo)準(zhǔn)曲線[10],標(biāo)準(zhǔn)曲線建立的背景與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的土壤背景出入太大,且由于模板濃度的限制和腐殖質(zhì)的干擾,土壤含菌量的定量檢測下限較高[11],因此已建好的檢測體系難以應(yīng)用于實際生產(chǎn)。鑒于此,本研究采用南方廣泛用于西瓜種植的水稻土壤模擬含菌量4×101～4×106spore/g土6個濃度梯度的帶菌土壤,使用MoBio PowerSoil@DNA Isolation Kit提取模擬帶菌土壤總DNA,引入一輪預(yù)PCR擴(kuò)增包含qPCR目標(biāo)序列的1 446 bp片段,以預(yù)PCR產(chǎn)物為模板進(jìn)行qPCR構(gòu)建熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線,成功實現(xiàn)4×102～4×106spore/g土的尖孢鐮刀菌檢測。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

菌株與土壤:西瓜枯萎病菌尖孢鐮刀菌西瓜?；虵usariumoxysporumf.sp.niveum1號生理小種來自湖南省西瓜甜瓜研究所;土壤取自湖南省水稻研究所多年連作水稻的水稻試驗田。

1.2 儀器與試劑

IQ5多重實時熒光定量PCR儀，美國Bio-Rad生產(chǎn);Μltrospec 3300pro紫外分光光度計，美國Amersham生產(chǎn);TransStart?Tip green qPCR SuperMix和MoBio PowerSoil@DNA Isolation Kit購自全式金生物技術(shù)公司;其他化學(xué)試劑為Sigma公司產(chǎn)品或國產(chǎn)AR級試劑。

引物由上海生工生物有限公司合成。Fonq-2F: CTTCCAAGTACCCTTTAGCCTAC;Fonq-2R: CTGGTCTTCAGACCGTCCATCT;Fon-4R:TTGCA-GTGCTCGGTCATACATC。Fonq-2F/Fonq-2R擴(kuò)增片段大小為244 bp;Fonq-2F/Fon-4R擴(kuò)增片段大小1 446 bp。

1.3 方法

1.3.1 帶菌土壤的制備

滅菌土壤樣品制備:從湖南省水稻研究所連作多年的水稻試驗田中取稻田土，高壓蒸汽滅菌2 h，80℃烘干至重量無變化后過200目篩，過篩土壤用于制備不同孢子濃度的帶菌土。孢子懸浮液的制備:利用PD培養(yǎng)液對尖孢鐮刀菌1號生理小種進(jìn)行搖培，5 d后用4層紗布過濾去除菌絲，得到孢子懸浮液。帶菌土壤的制備:將孢子懸浮液離心濃縮，利用顯微鏡和血球計數(shù)板測定孢子濃度，并進(jìn)行10倍梯度稀釋。準(zhǔn)確稱取0.4 g滅菌水稻土6份，分別置于2 mL離心管中加入100 μL各濃度孢子懸浮液，配制成含水量約為20%，孢子濃度為4×101～4×106spore/g標(biāo)準(zhǔn)含菌土。

1.3.2 帶菌土壤DNA提取

采用MoBio PowerSoil@DNA Isolation Kit提取帶菌土壤DNA。真菌細(xì)胞壁的破除是影響土壤DNA提取效果的重要因素，所以本研究在采用該試劑盒提取時增加了20次反復(fù)凍融操作，具體過程為:取6個離心管，分別加入0.4 g不同孢子濃度帶菌土，加入60 μL Solution C1充分搖勻，先70℃水浴2 min再液氮冷凍1 min，反復(fù)凍融20次;再70℃水浴10 min后于室溫下10 000 r/min離心30 s，取上清于干凈的2 mL離心管中，加入250 μL Solution C2，搖勻，4℃ 靜置5 min，室溫下10 000 r/min離心1 min，取600 μL上清液至新的離心管中，加入200 μL Solution C3，充分混勻，4℃靜置10 min，室溫下10 000 r/min離心1 min，取750 μL上清液，加入1.2 mL Solution C4，振蕩5 s后轉(zhuǎn)移到吸附柱中，室溫10 000 r/min離心1 min，加入500 μL Solution C5，室溫10 000 r/min離心30 s，將吸附柱至于新的2 mL離心管，加入100 μL Solution C6溶液至白色網(wǎng)膜中心，室溫10 000 r/min離心30 s，置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

1.3.3.1 以帶菌土壤DNA為模板繪制熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

例如這一屆評選出的兩組紀(jì)實片，雖然看似離人像可能遠(yuǎn)一點，但是很有體溫，能聞到泥土的芳香，能看到沙漠，能看到童真，有溫暖，有品味。以及入選的名人肖像，并不是因為拍攝的是名人，而是因為拍攝手法很簡單，摒除了一切裝飾，人物本身精氣神突出來了。

按照TransStart?Tip green qPCR SuperMix說明書推薦的20 μL體系，退火溫度以58.0℃為基礎(chǔ)，設(shè)定51.0、51.9、53.3、55.2、58.1、60.1、61.4和62.0℃ 8個溫度梯度進(jìn)行退火溫度優(yōu)化，根據(jù)擴(kuò)增曲線和熔解曲線圖以最高突光值(ARn)、最小Ct值且在熔解曲線分析中不產(chǎn)生非特異性峰為標(biāo)準(zhǔn)選擇最優(yōu)退火溫度。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系為:TransStart?Tip green qPCR SuperMix 10 μL，模板DNA 1.0 μL，引物Fonq-2F (10 μmol/L)和Fonq-2R(10 μmol/L)各0.5 μL，dd H2O 8 μL。擴(kuò)增條件為:95℃ 10 min;95℃ 15 s，60℃ 30 s，45個循環(huán)。熔解反應(yīng):95℃ 1 min，55℃ 30 s(每次循環(huán)溫度變化0.5℃;結(jié)束溫度95℃)，共81個循環(huán)。

以濃度為4×101～4×106spore/g的6個帶菌土壤DNA為模板，按優(yōu)化的最佳退火溫度60℃進(jìn)行實時熒光定量PCR擴(kuò)增，用儀器自帶軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以土壤含菌量的對數(shù)值(x)和對應(yīng)的Ct值(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3.2 以常規(guī)PCR預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物為模板繪制熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

常規(guī)PCR預(yù)擴(kuò)增:以4×101～4×106spore/g的6個梯度帶菌土壤DNA為模板，進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增。采用20 μL反應(yīng)體系:模板DNA 1 μL，10 μmol/L Fonq-2F和10 μmol/L Fon-4R各0.5 μL，dNTPs 2 μL，10×Buffer (Mg2+)2 μL，ddH2O 14 μL，EasyTaqⅠ0.5 μL。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性4 min;94℃ 40 s，60℃ 40 s，72℃ 70 s，18個循環(huán);72℃ 10 min。

標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建:以1.0 μL PCR預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，按1.3.3.1的反應(yīng)體系和擴(kuò)增程序進(jìn)行實時熒光定量PCR，以土壤含菌量的對數(shù)值(x)和對應(yīng)的Ct值(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 稀釋平板法驗證

本研究采用的菌株為尖孢鐮刀菌西瓜專化型1號生理小種，而能夠從土壤中特異性篩選分離尖孢鐮刀菌西瓜?；偷倪x擇培養(yǎng)基目前還未見報道。因此，驗證試驗采用不含尖孢鐮刀菌西瓜專化型的連作水稻田土，經(jīng)過高溫滅菌后按照1.3.1中的方法制備成孢子濃度為1.9×101～1.9×106spore/g 6個模擬帶菌土壤樣品，分別采用改良qPCR法和稀釋平板法檢測同一濃度帶菌土壤中病原菌數(shù)量，以此對改良的qPCR檢測方法進(jìn)行綜合評價。平板驗證試驗所用的選擇培養(yǎng)基參照韓寶坤等[12]的方法配制。取去皮馬鈴薯塊200 g加適量水熬煮20 min，取濾液加瓊脂18～20 g煮熔，涼至45～50℃時加入95%乙醇17 mL、95%敵克松(fenaminosulf)結(jié)晶粉1.0 g、硫酸鏈霉素(streptomycin sulfate) 0.5～1.0 g，加水補(bǔ)足1 000 mL，攪拌均勻后倒平板。

分別取1.9×101～1.9×106spore/g的帶菌土壤0.5 g按照1.3.3.2改良的qPCR法進(jìn)行病原菌數(shù)量的定量檢測;同時分別稱取各濃度帶菌土壤1 g，加9.9 mL無菌水，用干凈的玻璃棒攪拌均勻后用移液槍吸取100 μL溶液于平板中，涂布均勻，置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)5 d后統(tǒng)計計數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1.1 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

以孢子濃度為4×101～4×106spore/g的6個帶菌土壤的DNA及空白對照為模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，以土壤含菌量的對數(shù)值(x)和對應(yīng)的Ct值(y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。熔解曲線(圖1)峰單一無雜峰，擴(kuò)增產(chǎn)物Tm值均一，為(86.5±0.5)℃，表明本試驗所采用的西瓜枯萎病菌特異性引物專一性好，無非特異性擴(kuò)增。帶菌土壤中孢子含量在4×104～4×106spore/g時土壤含菌量的對數(shù)值與Ct值具有良好的線性關(guān)系(圖2)，相關(guān)系數(shù)r為0.985，擴(kuò)增效率E為132.5%，斜率為-2.755 7，截距為43.285，從而得出土壤含菌量的對數(shù)值(x)與Ct值(y)之間的線性關(guān)系式為:y=-2.755 7x+43.285。

圖1 熒光定量PCR熔解曲線Fig.1 Quantitative PCR melting curve

圖2 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Fluorescence quantitative PCR standard curve

2.1.2 重復(fù)性和再現(xiàn)性評價

通過SPSS軟件對前后3次重復(fù)試驗的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析表明，各個濃度梯度的土壤樣品在3次重復(fù)試驗中的檢測結(jié)果變化不大，組間變異系數(shù)為0.4%～1.59%(表1)，證明建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線具有較好的重復(fù)性。采用Duncan氏法對各濃度樣品的Ct均值進(jìn)行多重比較表明，孢子濃度為4×101spore/g帶菌土壤的Ct值和空白對照差異不顯著，4×102spore/g和4×103spore/g帶菌土壤的Ct值差異不顯著(表1)，表明直接以提取的帶菌土壤DNA為模板繪制熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，病原菌的檢測下限為4×103spore/g。

2.2 以常規(guī)PCR預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物為模板繪制熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.1 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

為了提高qPCR的檢測靈敏度，降低qPCR檢測下限，本試驗采用MoBio PowerSoil@DNA Isolation Kit提取含不同孢子濃度的土壤樣品總DNA，以總DNA為模板先進(jìn)行1次常規(guī)PCR預(yù)擴(kuò)增，然后以預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行qPCR，以土壤含菌量的對數(shù)值(x)和對應(yīng)的Ct值(y)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，帶菌土壤含菌量的對數(shù)值與Ct值在含菌量為4×102～4×106spore/g之間具有良好的線性關(guān)系(圖3)，相關(guān)系數(shù)r為0.974，擴(kuò)增效率E為91.4%，斜率為-3.528，截距為36.434，從而得出土壤含菌量的對數(shù)值(x)與Ct值的線性關(guān)系式為:y=-3.5283x+36.434，有效檢測下限為4×102spore/g，較未引入常規(guī)PCR方法前的qPCR檢測靈敏度提高了10倍。

表1 重復(fù)性和再現(xiàn)性評價結(jié)果1)

Table 1 Evaluation of repeatability and reproducibility

樣品濃度/spore·g-1Sampleconcentration組間變異Inter-assayvariations平均Ct值Mean標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)SD變異系數(shù)/%CV4×10622.13e0.1680.764×10525.40d0.1800.714×10428.81c0.1860.644×10330.18b0.1190.404×10229.85b0.1270.424×10130.66a0.3511.14030.81a0.4911.59

1) 統(tǒng)計分析用SPSS軟件,采用Duncan’s方法進(jìn)行多重比較,不同處理平均Ct值后標(biāo)不同字母表示處理間有顯著差異(P<0.05),標(biāo)相同字母表示處理間無顯著差異,下同。 Statistical analysis was conducted by SPSS software, multiple comparisons were made by Duncan’s method. The different letters indicated there was significant difference between the treatments (P<0.05) and the same letters indicated that there was no significant difference between the treatments.The same as below.

圖3 熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Fluorescence quantitative PCR standard curve

2.2.2 重復(fù)性和再現(xiàn)性評價

由表2可知,前后3次重復(fù)試驗中各濃度梯度土壤樣品的檢測結(jié)果變化不大,組間變異系數(shù)0.45%～1.63%,證明建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線具有較好的重復(fù)性。采用Duncan氏法對各濃度樣品的Ct均值進(jìn)行多重比較表明,4×101spore/g樣品與空白對照的Ct值差異不顯著,而4×102～4×106spore/g之間各濃度樣品的Ct值具有顯著差異,表明經(jīng)過一輪預(yù)PCR擴(kuò)增,然后以預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物為模板繪制熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線可實現(xiàn)4×102spore/g土的病原菌檢測下限。

表2 重復(fù)性和再現(xiàn)性評價結(jié)果

Table 2 Evaluation of repeatability and reproducibility

樣品濃度/spore·g-1Sampleconcentration組間變異Inter-assayvariations平均Ct值Mean標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)SD變異系數(shù)/%CV4×10613.61f0.1000.454×10517.69e0.1070.534×10419.49d0.1420.794×10322.24c0.1600.804×10228.98b0.1750.904×10130.43a0.3431.13030.45a0.4731.63

2.3 稀釋平板法驗證

本次檢測試驗除空白對照外共設(shè)置了1.9×101～1.9×106spore/g 6個濃度梯度的模擬帶菌土樣，每個樣品3個重復(fù)。結(jié)果(表3)表明，采用改進(jìn)的尖孢鐮刀菌熒光定量PCR法檢測的3個重復(fù)樣品的變異系數(shù)為0.68%～1.68%，表明該方法具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性;而采用稀釋平板法檢測的變異系數(shù)為9.35%～18.90%，變異系數(shù)較大，表明稀釋平板法各重復(fù)間的結(jié)果差異較大。

相比于樣品初始濃度，稀釋平板法的檢出率為70.18%～85.96%，存在20%～30%的丟失率。改進(jìn)的熒光定量PCR法對1.9×104、1.9×105、1.9×106spore/g 3個高濃度樣品的檢出率為94.85%～108%，準(zhǔn)確率較高，檢測結(jié)果與初始濃度差異較大的是含菌量為1.9×102spore/g的土壤樣品，檢出率為155.24%?？傮w而言，兩種方法的檢測結(jié)果與樣品初始濃度在數(shù)量級上都呈現(xiàn)絕對的一致性，稀釋平板法普遍存在20%～30%的丟失率，可能是樣品中存在一定比例的失活孢子等原因所致，而改進(jìn)的熒光定量PCR法的檢測結(jié)果雖與樣品初始濃度非常接近，但多有不同程度的偏高，可能與原孢子懸浮液中存在未降解的失活的病原菌有關(guān)。采用稀釋平板法進(jìn)行對比驗證表明，經(jīng)改進(jìn)的尖孢鐮刀菌熒光定量PCR檢測方法能快速、有效地對土壤中尖孢鐮刀菌進(jìn)行定量檢測。

表3 稀釋平板法驗證結(jié)果分析

Table 3 Validation analysis by dilution plate method

樣品濃度/spore·g-1Sampleconcentration熒光定量PCR法 Improvedreal-timefluorescencequantitative含菌量平均值/spore·g-1Mean標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)SD變異系數(shù)/%CV檢出率/%Detectionrate稀釋平板法 Dilutionplatemethod含菌量平均值/spore·g-1Mean標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)SD變異系數(shù)/%CV檢出率/%Detectionrate1.9×101----00001.9×102 294.9470.4161.50155.241.63×1021.539.3585.961.9×1032568.9930.4101.68135.211.40×1032.6518.9073.681.9×10419467.8420.2741.29102.461.33×1041.5311.4670.181.9×105180214.1580.1550.8794.851.53×1051.539.9680.701.9×1062060155.4430.0960.68108.431.46×1062.0814.1977.190----0000

3 討論

土壤中存在的腐殖酸是土壤中固有組成成分之一,不同類型土壤中腐殖酸的含量不盡相同。熒光定量PCR測定的土壤病原菌數(shù)量是以提取的土壤總DNA為基礎(chǔ),土壤總DNA中的腐殖酸對PCR反應(yīng)中的DNA聚合酶有抑制作用,去除腐殖酸提高DNA純度可以避免其對PCR反應(yīng)中DNA聚合酶的影響,但去除腐殖酸,純化DNA的過程不可避免地導(dǎo)致DNA濃度的降低,這就是土壤DNA提取中濃度和純度不可兼得的問題。

實時熒光定量PCR檢測技術(shù)是一種非常靈敏、高效的分子檢測方法,獲得高純度的土壤DNA是qPCR相關(guān)性強(qiáng),重復(fù)性好的必然要求,模板DNA的濃度是影響熒光定量PCR檢測下限的重要因素。本研究在進(jìn)行qPCR擴(kuò)增前利用耐腐殖質(zhì)干擾的普通DNA擴(kuò)增酶對土壤總DNA進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增,此步驟不僅等梯度提高了各樣品底物模板DNA的濃度,而且也降低了DNA中腐殖酸的相對含量,排除了腐殖酸對后續(xù)qPCR的干擾。預(yù)擴(kuò)增獲得的產(chǎn)物是濃度等梯度提高的各樣品底物模板DNA,因而預(yù)擴(kuò)增后產(chǎn)物與各土壤原始含菌量有著一一對應(yīng)關(guān)系,這也是本研究引入常規(guī)PCR預(yù)擴(kuò)增,以模擬帶菌土壤含菌量的對數(shù)為橫坐標(biāo),以預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行qPCR的Ct值為縱坐標(biāo)構(gòu)建土壤病原真菌熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線,實現(xiàn)4×102spore/g的土壤病原真菌qPCR檢測下限的理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究通過引入常規(guī)預(yù)PCR擴(kuò)增包含qPCR目的序列的片段,提高模板DNA濃度并降低模板中腐殖酸等雜質(zhì)的相對含量,成功地以帶菌土壤DNA為模板構(gòu)建了qPCR標(biāo)準(zhǔn)曲線,較未引入預(yù)PCR擴(kuò)增前提高檢測下限10倍,實現(xiàn)熒光定量PCR對土壤病原菌數(shù)量為4×102～4×106spore/g的有效定量檢測,結(jié)合不同土壤病原真菌的特異性引物,該檢測方法可為土壤病原真菌的有效定量檢測提供理論支撐。

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(責(zé)任編輯：楊明麗)

An improved real-time fluorescence quantitative PCR method for detectingFusarium

Huang Huaidong1,2, Xiao Jiling2, Zhang Yi2, Ruan Wanhui2, Wei Lin3, Liang Zhihuai1,2

(1.LongpingBranchofGraduateSchool,CentralSouthUniversity,Changsha410125,China; 2.HunanWatermelonandMuskmelonInstitute,Changsha410125,China; 3.HunanInstituteofPlantProtection,Changsha410125,China)

The aim of this study is to develop a more efficient and sensitive method for quantitative detection of soil pathogens by real-time PCR. The soil samples containing 4×101-4×106spore/g were prepared by mixing the cultured spore suspension and long-term cultivated paddy soil. The total DNA was extracted from the prepared soil samples using MoBio PowerSoil@DNA Isolation Kit. A 1 446 bp DNA fragment containing the qPCR target sequence was amplified from soil DNA by conventional PCR, then the PCR products were used as templates to construct the standard curve of the fluorescence quantitative PCR. The results indicated that the correlation coefficient of qPCR standard curve was 0.985, and the lower limit of detection was 4×103spore/g when the soil DNA was used as PCR templates. When the pre-amplified PCR products were used as template, the correlation coefficient of qPCR standard curve was 0.974, and the lower limit of detection was 4×102spore/g, that is the sensitivity of the method increased by 10-fold. These results showed that when combined with the specific primers of different soil pathogenic fungi, this method can provide technical support for effective quantitative detection of soil pathogens.

real-time PCR; soil pathogenic fungi;Fusarium; detection limit

2016-10-16

2017-01-07

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(201503110-03)

S 436.68， S 154.3

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.04.024

* 通信作者 E-mail: liangzhihuainky@163.com