劉昌燕, 李 莉, 焦春海, 萬(wàn)正煌

(湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所, 糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430064)

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5種倉(cāng)儲(chǔ)豆象的分子鑒定和檢測(cè)

劉昌燕, 李 莉, 焦春海, 萬(wàn)正煌*

(湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院糧食作物研究所, 糧食作物種質(zhì)創(chuàng)新與遺傳改良湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430064)

本研究以在檢疫中經(jīng)常被截獲的5種豆象為研究對(duì)象,通過(guò)對(duì)GenBank中5種豆象mtDNA COⅠ序列的查詢,并進(jìn)行序列比對(duì),共設(shè)計(jì)了30對(duì)引物,通過(guò)篩選獲得5對(duì)能分別鑒定5種豆象的特異引物,并用50、25、10、5、1、0.5、0.1、0.05 ng/μL 8個(gè)不同濃度系列的豆象DNA模板來(lái)檢測(cè)靈敏度,結(jié)果表明,豌豆象和四紋豆象特異引物對(duì)的靈敏度為0.1 ng/μL,蠶豆象、菜豆象和綠豆象特異引物對(duì)的靈敏度為0.5 ng/μL。該方法可用于快速準(zhǔn)確地鑒定5種豆象,對(duì)于豆象類害蟲(chóng)的檢測(cè)監(jiān)測(cè)具有重要意義。

豆象科; mtDNA COⅠ基因; 特異引物; 分子鑒定

豆象是豆象科昆蟲(chóng)的總稱,分布于除南極之外的各大陸,尤其以亞洲的熱帶區(qū)以及中美和南美地區(qū)數(shù)量最多[1]。豆象科昆蟲(chóng)目前全世界記錄約1 400種,分屬于58個(gè)屬[2]。該科昆蟲(chóng)大約有84%的種類取食豆科植物種子,成為栽培豆科植物的一類重要害蟲(chóng)[3]。1997年浙江寧海曾發(fā)生蠶豆象大規(guī)模為害,為害率高的達(dá)到80%以上,經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重[4]。綠豆象嚴(yán)重為害綠豆、豇豆、鷹嘴豆、蠶豆和豌豆等多種豆類[5-6],主要在倉(cāng)內(nèi)蛀食儲(chǔ)藏的豆粒,造成的損失達(dá)30%以上[7]。我國(guó)共記載有18種儲(chǔ)藏物中豆象科昆蟲(chóng),其中綠豆象Callosobruchuschinensis、蠶豆象Bruchusrufimanus和豌豆象Bruchuspisorum為我國(guó)主要的儲(chǔ)藏豆類害蟲(chóng);而菜豆象Acanthoscelidesobtectus和四紋豆象Callosobruchusmaculatus為我國(guó)規(guī)定禁止入境的檢疫性害蟲(chóng)[8]。

目前口岸檢驗(yàn)檢疫部門(mén)對(duì)豆象科昆蟲(chóng)的鑒定主要以成蟲(chóng)的外部形態(tài)特征作為鑒定依據(jù),但本研究涉及的5種豆象個(gè)體微小(約2～5 mm),且寄主范圍、生活習(xí)性和種間外部形態(tài)極為相似,給種類鑒定工作帶來(lái)了極大的困難[1,9]。同時(shí),豆象能夠以卵、幼蟲(chóng)、蛹、成蟲(chóng)隨寄主果實(shí)和運(yùn)輸工具等進(jìn)行遠(yuǎn)距離人為傳播,且主要以卵、幼蟲(chóng)、蛹等非成蟲(chóng)形態(tài)為主,需將其飼養(yǎng)至成蟲(chóng)才能進(jìn)行種類鑒定,整個(gè)檢疫鑒定過(guò)程長(zhǎng)達(dá)數(shù)周,不適應(yīng)口岸快速檢驗(yàn)檢疫的要求,且容易混淆誤檢,無(wú)法適應(yīng)實(shí)際工作的需要。我國(guó)在進(jìn)口貨物上截獲的豆象不單單存在于豆類上,在玉米、小麥、棉花等貨物中也存在,極大地增加了檢疫的難度[2]。因此,尋找一種正確快速的鑒定方法對(duì)口岸檢驗(yàn)檢疫具有十分重要的指導(dǎo)意義。

分子標(biāo)記是實(shí)現(xiàn)分子鑒定的重要技術(shù)手段,目前已應(yīng)用于昆蟲(chóng)近緣種、地理種群的鑒別。細(xì)胞色素C氧化酶含有13個(gè)亞基,其中細(xì)胞色素氧化酶亞基Ⅰ(COⅠ)是細(xì)胞色素氧化酶的重要組成部分,編碼該亞基的基因片段不同位置的進(jìn)化速率有所不同,通過(guò)選取該基因的適宜基因片段進(jìn)行測(cè)序和序列分析,進(jìn)而在DNA水平上對(duì)物種進(jìn)行正確地識(shí)別鑒定,已成為生物分類學(xué)研究的發(fā)展方向[10-11]。相比于其他分子標(biāo)記技術(shù),由于其具有統(tǒng)一性和標(biāo)準(zhǔn)性而成為生物分類學(xué)研究中應(yīng)用最為廣泛的分子手段之一[12-13]。目前,COⅠ基因已用于鱗翅目、膜翅目、半翅目等物種鑒定,并對(duì)基于形態(tài)學(xué)的物種分類進(jìn)行了驗(yàn)證或修正[14-15]。

本研究以在檢疫中經(jīng)常被截獲的5種豆象為研究對(duì)象,設(shè)計(jì)了以COⅠ為目標(biāo)基因的特異性引物并對(duì)其特異性進(jìn)行驗(yàn)證,旨在建立豆象類害蟲(chóng)快速分子鑒定技術(shù),為有效截阻豆象類害蟲(chóng)的傳入及進(jìn)一步擴(kuò)散,保障我國(guó)豆類安全生產(chǎn)提供技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 供試蟲(chóng)源

本研究所用的昆蟲(chóng)樣品、來(lái)源和寄主見(jiàn)表1。所有蟲(chóng)源樣品均用體式顯微鏡進(jìn)行鑒定,以確定種類。用于分子生物學(xué)試驗(yàn)的豆象標(biāo)本用100%乙醇浸泡并保存于-20℃冰箱。

表1 5種豆象來(lái)源及寄主

Table 1 Sources and hosts of five bean weevils

昆蟲(chóng)樣品Sample來(lái)源Source寄主Host綠豆象Callosobruchuschinensis北京門(mén)頭溝綠豆Vignaradiata豌豆象Bruchuspisorum湖北武漢豌豆Pisumsativum蠶豆象Bruchusrufimanus湖北武漢蠶豆Viciafaba四紋豆象Callosobruchusmaculatus重慶永川綠豆Vignaradiata菜豆象Acanthoscelidesobtectus云南曲靖菜豆Phaseolusvulgaris

1.2 主要試劑

TaqDNA聚合酶、蛋白酶K、DL1000 DNA Marker、Tris、EDTA、SDS均購(gòu)自TaKaRa公司。膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司,其他生化試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 基因組DNA的提取

豆象基因組DNA的提取參照Sunnuck等[16]的鹽析法并稍作改進(jìn)。將單頭豆象于1.5 mL離心管中研磨粉碎,加入300 μL TENS (50 mmol/L Tris, pH 7.5, 400 mmol/L NaCl, 20 mmol/L EDTA, 0.5% SDS)和100 μg/mL蛋白酶K,于37℃水浴4 h,加入85 μL 5 mol/L NaCl劇烈振蕩15 s;14 000 r/min離心5 min, 取上清液,加入等體積無(wú)水乙醇沉淀DNA,12 000 r/min離心5 min, 用70%乙醇洗滌沉淀2次,沉淀充分干燥后,加入30 μL蒸餾水溶解DNA,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 特異引物對(duì)的設(shè)計(jì)

通過(guò)GenBank中登錄的豌豆象(EF570097)、四紋豆象(AY625417)、蠶豆象(AY997313)、菜豆象(KF157281)和綠豆象(AY625416)的mtDNA CO Ⅰ序列,用DNAMAN軟件對(duì)目標(biāo)種的mtDNA CO Ⅰ序列進(jìn)行比對(duì)分析,根據(jù)分析結(jié)果,針對(duì)目的基因序列人工設(shè)計(jì)特異引物,并用Primer 5對(duì)引物進(jìn)行評(píng)估,檢查引物Tm值、GC%、錯(cuò)配、二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)等,并用GenBank中的BLAST程序檢查同源序列[17]。本研究共設(shè)計(jì)了30對(duì)引物,通過(guò)篩選獲得能分別特異鑒定5種豆象的特異引物5對(duì)(表2),引物篩選的原則是所有引物在所設(shè)計(jì)的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件下能特異地鑒定出某一種豆象。引物由武漢擎科生物技術(shù)有限公司合成。

1.5 PCR擴(kuò)增

分別以單頭豆象的基因組DNA為模板,用表2的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以水作陰性對(duì)照。PCR反應(yīng)體系(25 μL):10×buffer(含Mg2+)2.5 μL、2.5 mmol/L dNTPs 2.5 μL、10 μmol/L引物(上、下游引物)各1.0 μL、2.5 U/μLTaq酶 0.2 μL、基因組DNA 1 μL,ddH2O 16.8 μL。PCR反應(yīng)條件:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s、54℃退火30 s、72℃延伸1 min,35個(gè)循環(huán);72℃ 10 min;4℃保存。取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),溴化乙錠(EB)染色,在凝膠成像系統(tǒng)中觀察并成像分析。

表2 引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物

Table 2 Primer sequences and amplification products

引物 Primer豆象種類 Species序列5'-3' Sequence目標(biāo)片段長(zhǎng)度/bp LengthBp1Bp2Cm1Cm2Br1Br2Ao1Ao2Cc1Cc2豌豆象Bruchuspisorum四紋豆象Callosobruchusmaculatus蠶豆象Bruchusrufimanus菜豆象Acanthoscelidesobtectus綠豆象CallosobruchuschinensisAGTTGGGGGTTTAACTGGTGTATGTTAAACCTGTAAATAATGGGGGTCCCTACTGGAATTAAAGTAAAAGTAACTCCGGTAAAAAGGAGTGGGAGGATTGACTGGTGTTAGTTAATCCTGTAAATAATGAACATGATAGCTATCGGATTAACCTAAAAATATAGTAATAAATTGGGAGTACCAACCGGAATCAAAGTAAGTGACACCAGTAAAAAGAGGA166276167432274

1.6 PCR產(chǎn)物回收測(cè)序

PCR產(chǎn)物采用天根瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行切膠回收純化,回收純化后的PCR產(chǎn)物由武漢擎科生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.7 特異引物對(duì)的靈敏度檢測(cè)

供試豆象的基因組DNA用蒸餾水進(jìn)行系列稀釋,得到基因組DNA濃度分別為:50、25、10、5、1、0.5、0.1、0.05 ng/μL。分別取每種稀釋液1 μL為模板(水為陰性對(duì)照),用上述5對(duì)特異性引物分別對(duì)5種豆象的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,PCR產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠電泳上檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物特異性驗(yàn)證

用設(shè)計(jì)的特異性引物對(duì)所有供試豆象的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,其中Bp1/Bp2僅在豌豆象基因組DNA擴(kuò)增出166 bp特異性條帶(圖1);Cm1/Cm2僅在四紋豆象基因組DNA中擴(kuò)增出276 bp特異性條帶(圖2);Br1/Br2僅在蠶豆象基因組DNA中擴(kuò)增出167 bp特異性條帶(圖3);Ao1/Ao2僅在菜豆象中擴(kuò)增出432 bp特異性條帶(圖4);Cc1/Cc2僅在綠豆象中擴(kuò)增出274 bp特異性條帶(圖5),其他豆象基因組DNA及水對(duì)照均無(wú)擴(kuò)增片段。表明設(shè)計(jì)的引物在供試豆象范圍內(nèi)具有特異性。

圖1 5種豆象的特異性檢測(cè)Fig.1 Detection of five bean weevils with specific primers

2.2 PCR產(chǎn)物測(cè)序驗(yàn)證

分別對(duì)擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序和序列分析,對(duì)產(chǎn)物的特異性進(jìn)行進(jìn)一步確認(rèn)。經(jīng)測(cè)序表明,豌豆象特異引物對(duì)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物與原序列有5個(gè)堿基的差異,四紋豆象特異引物對(duì)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物序列與原序列有4個(gè)堿基的差異,蠶豆象特異引物對(duì)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物與原序列有9個(gè)堿基的差異,菜豆象特異引物對(duì)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物與原序列有6個(gè)堿基的差異,綠豆象特異引物對(duì)擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物與原序列沒(méi)有堿基的差異,造成這些差異的原因可能是測(cè)序的差異或者不同地理種群間序列存在差異。

2.3 特異引物靈敏度檢測(cè)

PCR方法的檢測(cè)靈敏度分別用50、25、10、5、1、0.5、0.1、0.05 ng/μL等8種不同濃度的豆象DNA為模板來(lái)確定。由圖2可知,當(dāng)模板濃度為0.05 ng/μL時(shí),豌豆象和四紋豆象特異引物對(duì)均沒(méi)有擴(kuò)增出特異性條帶,當(dāng)模板濃度為0.1 ng/μL及以上時(shí),均產(chǎn)生特異性條帶,而水對(duì)照即CK無(wú)擴(kuò)增片段(圖2)。由此可知,應(yīng)用本試驗(yàn)的PCR鑒定方法可以檢測(cè)到濃度為0.1 ng/μL的豌豆象和四紋豆象基因組DNA,靈敏度非常高。從圖8～10可以看出,蠶豆象、菜豆象和綠豆象特異引物對(duì)的靈敏度為0.5 ng/μL。

圖2 特異引物的靈敏度檢測(cè)Fig.2 Sensitivity detection of specific primers for five bean weevils

3 討論

現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)尤其是分子標(biāo)記技術(shù)為研究生物之間的進(jìn)化關(guān)系開(kāi)辟了新手段。PCR的廣泛應(yīng)用以及基因測(cè)序的精確和簡(jiǎn)便使分子系統(tǒng)分析達(dá)到空前的水平。許多研究者利用RFLP或RAPD標(biāo)記分析物種或地理種群的遺傳多態(tài)性,并據(jù)此推導(dǎo)其親緣關(guān)系。如顧耕等[18]采用RAPD技術(shù)對(duì)生活在辣椒、番茄和煙草上的棉鈴蟲(chóng)進(jìn)行了寄主種群遺傳分化的研究。魏曉棠等[19]利用AFLP技術(shù)對(duì)我國(guó)4個(gè)地理種群的棉褐帶卷蛾進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析,為不同地理種群的棉褐帶卷蛾的分類鑒定和遺傳變異分析提供參考依據(jù)。但RFLP需要篩選大量的限制酶,而RAPD需要篩選大量隨機(jī)引物。以核酸序列測(cè)定為基礎(chǔ),擴(kuò)增單一的穩(wěn)定條帶,實(shí)現(xiàn)豆象的分子鑒定具有方便、穩(wěn)定和可靠的優(yōu)點(diǎn)。顧杰等[20-21]結(jié)合PCR和酶切技術(shù),從分子水平對(duì)鷹嘴豆象和四紋豆象進(jìn)行了快速檢測(cè),鑒定靈敏度達(dá)10 ng/μL,并檢測(cè)了四紋豆象4個(gè)地理種群的Cytb和COⅠ基因序列,對(duì)不同地理種群間遺傳結(jié)構(gòu)多態(tài)性進(jìn)行了研究。本研究通過(guò)序列搜索比對(duì),并對(duì)設(shè)計(jì)的相關(guān)引物進(jìn)行篩選鑒定,獲得5對(duì)能特異鑒定5種豆象的特異性引物,靈敏度達(dá)0.5 ng/μL以上,且該方法具有不受豆象發(fā)育階段和環(huán)境條件的影響,對(duì)于非成蟲(chóng)態(tài)的樣品及形態(tài)結(jié)構(gòu)不完整的成蟲(chóng)樣品,均能從基因序列上獲得準(zhǔn)確、可靠的鑒定信息等優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)操作簡(jiǎn)便快捷,縮短了檢測(cè)時(shí)間,提高了工作效率。因此,該技術(shù)可以用于豆象的檢測(cè)鑒定工作,并在檢疫性害蟲(chóng)的檢疫檢驗(yàn)與檢測(cè)監(jiān)測(cè)中具有重要應(yīng)用價(jià)值。

[1] 張生芳, 劉永平, 武增強(qiáng). 中國(guó)儲(chǔ)藏物甲蟲(chóng)[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 1998.

[2] 喻梅, 謝令德, 徐廣文. 六種檢疫性儲(chǔ)糧豆象防治研究進(jìn)展[J]. 糧食儲(chǔ)藏, 2006(6): 9-12.

[3] Johnson C D.Biosystematics of the Arizona, California, and Oregon species of the seed beetle genusAcanthoscelidesSchilsky (Coleoptera: Bruchidae)[M]. University of California Publications in Entomology, 1970, 59: 1-116.

[4] 葉秀亦, 錢(qián)永謙, 謝時(shí)秀, 等. 寧海地區(qū)蠶豆象發(fā)生危害及其防治[J]. 植物保護(hù), 1997, 23(5): 31-32.

[5] 劉昌燕, 李莉, 陳宏偉, 等. 綠豆象在不同豆類上的生長(zhǎng)發(fā)育研究[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2015, 54(22): 5610-5617.

[6] 劉昌燕, 萬(wàn)正煌, 仲建鋒, 等. 綠豆象的輻照致死效應(yīng)研究[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 53(9): 4607-4610.

[7] 仲建鋒, 萬(wàn)正煌, 李莉, 等. 低溫和高溫對(duì)倉(cāng)儲(chǔ)綠豆象的防治效果[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 46(1): 54-59.

[8] 劉昌燕, 焦春海, 仲建鋒, 等. 食用豆蟲(chóng)害研究進(jìn)展[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 53(24): 5908-5912.

[9] 陳新, 魏春艷, 任炳忠, 等. 豆象屬昆蟲(chóng)檢疫重要性概述[J]. 植物檢疫, 2013, 27(1): 63-67.

[10]Hebert P D N, Cywinska A, Ball S L, et al. Biological identifications through DNA barcodes [J]. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences, 2003, 270(1512): 313-321.

[11]Floyd R, Lima J, deWaard J, et al. Common goals: policy implications of DNA barcoding as a protocol for identification of arthropod pests [J]. Biological Invasions, 2010, 12(9): 2947-2954.

[12]Shufran K A, Puterka G J. DNA barcoding to identify all life stages of holocyclic cereal aphids (Hemiptera: Aphididae) on wheat and other Poaceae [J]. Annals of the Entomological Society of America, 2011, 104(1): 39-42.

[13]Mehrdad H, Daniel H J, John M B, et al. DNA barcodes distinguish species of tropical Lepidoptera [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2006, 103(4): 968-971.

[14]劉慎思, 張桂芬, 萬(wàn)方浩. 基于mtDNA COⅠ基因的離腹寡毛實(shí)蠅屬常見(jiàn)種DNA條形碼識(shí)別和系統(tǒng)發(fā)育分析[J]. 昆蟲(chóng)學(xué)報(bào), 2014, 57(3): 343-355.

[15]Acs Z, Challis R J, Bihari P, et al.Phylogeny and DNA barcoding of inquiline oak gallwasps (Hymenoptera: Cynipidae) of the Western Palaearctic [J]. Molecular Phylogenetics and Evolution, 2010, 55(1): 210-225.

[16]Sunnuck P, Hales D F.Numerous transposed sequences of mitochondrial cytochrome oxidase I-II in aphids of the genusSitobion(Hemiptera: Aphididae)[J]. Molecular Biology and Evolution, 1996, 13(3): 510-524.

[17]Muraji M, Nakahara S.Discrimination among pest species ofBactrocera(Diptera: Tephritidae) based on PCR-RFLP of the mitochondrial DNA[J]. Applied Entomology and Zoology, 2002, 37(3): 437-446.

[18]顧耕, 張迎春, 王思芳. 棉鈴蟲(chóng)不同寄主種群遺傳分化的RAPD分析[J]. 華東昆蟲(chóng)學(xué)報(bào), 2002, 11(2): 30-34.

[19]魏曉棠, 張成標(biāo), 張京宣, 等. 基于AFLP方法對(duì)不同地理種群棉褐帶卷蛾遺傳分化的研究[J]. 應(yīng)用昆蟲(chóng)學(xué)報(bào), 2015, 50(3): 686-692.

[20]顧杰, 王莉萍, 毛雅琴, 等. 鷹嘴豆象與四紋豆象的分子檢測(cè)技術(shù)[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào), 2010, 37(3): 211-216.

[21]顧杰, 毛雅琴, 王莉萍, 等. 四紋豆象不同地理種群的遺傳分化[J]. 昆蟲(chóng)學(xué)報(bào), 2009, 52(12): 1349-1355.

(責(zé)任編輯：楊明麗)

Molecular identification and detection of five bean weevils

Liu Changyan, Li Li, Jiao Chunhai, Wan Zhenghuang

(InstituteofFoodCrops,HubeiAcademyofAgriculturalSciences,HubeiKeyLaboratoryofFoodCropGermplasmandGeneticImprovement,Wuhan430064,China)

Molecular identification of five bean weevils that were frequently intercepted from customs was studied in this paper. Based on the mtDNA COⅠ gene sequences ofCallosobruchuschinensis,Bruchusrufimanus,B.pisorum,AcanthoscelidesobtectusandC.maculatusfrom GenBank, 30 pairs of primers were designed, and the five bean weevils can be specifically identified by PCR amplification with five pairs of specific primers. Moreover, the sensitivity of PCR was detected at 50,25,10,5,1,0.5,0.1 and 0.05 ng/μL genomic DNA ofC.chinensis,B.rufimanus,B.pisorum,A.obtectusandC.maculatus,respectively.The results showed that the sensitivity forB.pisorumandC.maculatuswas 0.1 ng/μL, while 0.5 ng/μL for the other three. The method provides a rapid and reliable tool for identification of the five bean weevils, which could be applied in detecting and monitoring of bean weevil pests.

Bruchidae; mtDNA COⅠ gene; specific primers; molecular identification

2016-09-30

2017-01-10

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)(CARS-09); 科技部國(guó)際合作重點(diǎn)項(xiàng)目(2011DFB31620); 湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心資助項(xiàng)目(2016-620-000-001-006)

S 379

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.04.022

* 通信作者 E-mail: zhwan168@163.com