單治國, 張春花, 滿紅平, 魏朝霞, 周紅杰, 趙 明, 段雙梅, 張乃明

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 昆明 650201; 2. 普洱學(xué)院, 普洱 665000; 3. 普洱市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測中心, 普洱 665000; 4. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)龍潤普洱茶學(xué)院, 昆明 650201; 5. 云南省土壤培肥與污染修復(fù)工程實(shí)驗(yàn)室, 昆明 650201)

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普洱茶固態(tài)發(fā)酵過程中聯(lián)苯菊酯降解規(guī)律研究

單治國1,2, 張春花2, 滿紅平3, 魏朝霞4, 周紅杰4, 趙 明4, 段雙梅4, 張乃明1,5*

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院, 昆明 650201; 2. 普洱學(xué)院, 普洱 665000; 3. 普洱市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督綜合檢測中心, 普洱 665000; 4. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)龍潤普洱茶學(xué)院, 昆明 650201; 5. 云南省土壤培肥與污染修復(fù)工程實(shí)驗(yàn)室, 昆明 650201)

為了研究微生物在普洱茶發(fā)酵中對聯(lián)苯菊酯的降解規(guī)律,以人工添加180倍液聯(lián)苯菊酯的云南大葉種曬青毛茶為材料,分別設(shè)置接種黑曲霉、釀酒酵母、產(chǎn)黃青霉以及不接菌的對照進(jìn)行普洱茶固態(tài)發(fā)酵,應(yīng)用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析方法測定茶葉中聯(lián)苯菊酯的殘留,分析比較微生物在普洱茶固態(tài)發(fā)酵中對聯(lián)苯菊酯農(nóng)藥的降解規(guī)律。結(jié)果表明,普洱茶固態(tài)發(fā)酵中聯(lián)苯菊酯殘留量降低,接種微生物能夠有效降低聯(lián)苯菊酯的含量25%左右(P<0.05),其中釀酒酵母發(fā)酵對聯(lián)苯菊酯農(nóng)藥殘留的降解效果顯著高于黑曲霉、產(chǎn)黃青霉處理(P<0.05)。聯(lián)苯菊酯在黑曲霉、釀酒酵母、產(chǎn)黃青霉以及不接菌固態(tài)發(fā)酵普洱茶過程中的降解動(dòng)態(tài)規(guī)律符合一級動(dòng)力學(xué)模型C=C0e-kt,降解曲線方程分別為:C=12.889e-0.043t,C=13.348e-0.057t,C=13.309e-0.042t,C=14.458e-0.04t。綜上,研究表明,由于優(yōu)勢微生物的作用,曬青毛茶上的聯(lián)苯菊酯在固態(tài)發(fā)酵中顯著降低,殘效期縮短。

普洱茶; 微生物; 固態(tài)發(fā)酵; 聯(lián)苯菊酯; 殘留; 降解

食品安全問題已經(jīng)引起了全球的關(guān)注[1-2],并且由農(nóng)藥殘留引起的食品污染問題也變得越來越重要[3]。如何將化學(xué)農(nóng)藥控制在對人類安全的范圍內(nèi)是目前我國農(nóng)藥應(yīng)用和解決農(nóng)藥殘留問題的重要研究課題。茶葉是我國傳統(tǒng)的經(jīng)濟(jì)作物,由于茶園病蟲害嚴(yán)重,農(nóng)藥不合理使用、超量使用、長期使用都會(huì)造成茶葉中農(nóng)藥殘留超標(biāo),影響茶葉質(zhì)量,進(jìn)而引發(fā)食品安全問題。茶葉作為直接沖泡飲用的食品,溶入茶湯的殘留農(nóng)藥會(huì)對人體健康造成危害,因此,農(nóng)藥殘留是當(dāng)前茶葉出口和內(nèi)銷中遇到的最為敏感、最大的質(zhì)量安全問題[4],加之國外“技術(shù)壁壘”,農(nóng)藥殘留已成為制約我國茶葉出口的主要難題。

聯(lián)苯菊酯(bifenthrin),是茶園中常用農(nóng)藥,具有殺蟲譜廣、低毒、用量少、殘留期短的特點(diǎn)[5]。吳光遠(yuǎn)等[6]研究表明聯(lián)苯菊酯主要通過觸殺和胃毒作用殺蟲,能有效防治鱗翅目幼蟲、小綠葉蟬、茶蚜、茶葉螨等茶園害蟲。由于聯(lián)苯菊酯使用廣泛[7],在茶葉出口中檢出率高。目前中國、日本、歐盟規(guī)定聯(lián)苯菊酯的殘留限量分別是5、25、5 mg/kg[8]。目前,就茶葉生產(chǎn)中應(yīng)用量較大的聯(lián)苯菊酯的研究主要集中在茶園管理[6,9-12]、茶葉加工[13-16]、茶葉儲(chǔ)藏、茶葉沖泡[15,17]中的降解動(dòng)態(tài)和降解途徑。隨著消費(fèi)者對于農(nóng)產(chǎn)品安全問題的日益關(guān)注,保障茶葉產(chǎn)量的同時(shí),在生產(chǎn)、消費(fèi)各個(gè)環(huán)節(jié)盡可能減少茶葉中農(nóng)藥含量,提高茶葉的安全品質(zhì)顯得極為重要。而加工過程的不同對茶葉中農(nóng)藥的殘留會(huì)有不同程度的影響,大部分加工過程可以降低殘留農(nóng)藥濃度,也有些加工過程會(huì)導(dǎo)致殘留升高,甚至代謝為毒性更強(qiáng)的產(chǎn)物。目前,國外已經(jīng)對加工過程降低農(nóng)殘進(jìn)行了系統(tǒng)的研究,并將研究數(shù)據(jù)用于食品安全風(fēng)險(xiǎn)評估和風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警上,而我國在這方面的研究相對較少且缺乏系統(tǒng)性[18]。

與其他茶葉不同,普洱茶加工的關(guān)鍵工序是固態(tài)發(fā)酵,該過程中存在多種微生物作用,有可能對農(nóng)藥殘留具有降解作用,但聯(lián)苯菊酯在普洱茶固態(tài)發(fā)酵中的消解動(dòng)態(tài)未見研究報(bào)道,因此,本研究分析不同微生物固態(tài)發(fā)酵對普洱茶中聯(lián)苯菊酯殘留量的影響,以比較其消解差異,從而進(jìn)一步明確微生物固態(tài)發(fā)酵過程對農(nóng)藥殘留變化起關(guān)鍵作用以及農(nóng)藥降解對普洱茶理化性質(zhì)的影響,并在此基礎(chǔ)上,探索普洱茶發(fā)酵過程對農(nóng)藥降解的機(jī)制與方法,以期為普洱茶的安全生產(chǎn)提供理論和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試茶葉發(fā)酵原料為普洱市茶樹良種場采摘的生態(tài)有機(jī)鮮葉加工而成的曬青毛茶。

供試菌種包括黑曲霉Aspergillusniger2005-10010941.4,2005、釀酒酵母Saccharomycescerevisiae200510010940.X,2005、產(chǎn)黃青霉Penicilliumchrysogenum,是由云南農(nóng)業(yè)大學(xué)普洱茶加工技術(shù)研究實(shí)驗(yàn)室從普洱茶固態(tài)發(fā)酵體系中所分離、純化、鑒定、保存、篩選、擴(kuò)繁而得的優(yōu)勢有益菌。

聯(lián)苯菊酯標(biāo)準(zhǔn)品(純度為99.7%),中國計(jì)量科學(xué)院化學(xué)所提供;2.5%聯(lián)苯菊酯乳油(江蘇富美實(shí))，弗羅里硅土(農(nóng)殘分析級,150～250 μm,美國Sigma公司),經(jīng)140℃活化2 h后使用;氯化鈉、石油醚、正己烷、乙酸乙酯等所用試劑均為分析純;試驗(yàn)用水均為去離子水。

氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀:HP 5890/5971,美國安捷倫公司;色譜柱為30 m×0.32 mm×0.25 μm規(guī)格的毛細(xì)管柱;旋渦混合器,上海琪特分析儀器有限公司;數(shù)控超聲波清洗儀,昆山市超聲儀器有限公司;氮?dú)鉂饪s干燥儀:HGC-12A,上海禾工科學(xué)儀器有限公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:IKA RV10,德國IKA公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用2.5%聯(lián)苯菊酯乳油180倍液處理,取50 mL藥液,兌水9 L(用藥量按實(shí)際每重復(fù)噴施重量折算,按照曬青毛茶固態(tài)發(fā)酵潮水量為30%,即每30 kg曬青毛茶葉用水量9 L),用背負(fù)式手動(dòng)噴霧器均勻噴霧于準(zhǔn)備用于固態(tài)發(fā)酵的曬青毛茶(30 kg)上,使大葉種曬青毛茶含有一定濃度的農(nóng)藥殘留,進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵降解試驗(yàn)。藥后2 h采樣,室內(nèi)自然晾干,至茶樣含水量為10%,-30℃保存,以測定聯(lián)苯菊酯含量。

試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)處理:施藥2 h并采樣后,分別接種釀酒酵母、黑曲霉、產(chǎn)黃青霉進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵和傳統(tǒng)發(fā)酵(不接菌種,其他條件同接菌固態(tài)發(fā)酵)。用小型噴霧器將3種有益菌種按液茶比為1∶10的比例均勻?yàn)⒃跁袂嗝枭线M(jìn)行普洱茶固態(tài)發(fā)酵,每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù),每個(gè)重復(fù)30 kg茶葉,控制發(fā)酵茶堆溫度40～60℃,濕度35%,發(fā)酵環(huán)境溫度25℃,環(huán)境濕度為80%,翻堆6次,分別于發(fā)酵后的7、14、21、28、35、42 d翻堆,并按五點(diǎn)取樣法分別采集固態(tài)發(fā)酵的5個(gè)點(diǎn)(固態(tài)發(fā)酵中心點(diǎn)和距離中心點(diǎn)1 m處的4個(gè)點(diǎn)),合并為一個(gè)混合待測樣品,設(shè)3個(gè)重復(fù),各1 kg,室內(nèi)自然晾干,含水量為10%,以測定聯(lián)苯菊酯在普洱茶各翻堆樣中的殘留量。

1.3 分析方法

1.3.1 樣品制備

樣品提取:茶葉樣品磨碎、過20目篩備用,稱取2.50 g于50 mL具塞錐形瓶中,加入10 mL正己烷/丙酮混合提取液(97.5∶2.5,V/V),置于溫度為40～45℃的搖床中振蕩40 min。

樣品凈化:玻璃層析柱(5 mm×70 mm)內(nèi)裝約300 mg的弗羅里硅土,柱頭加約15 mg的活性炭,用5.0 mL石油醚/乙酸乙酯(9∶1,V/V)洗脫液預(yù)淋洗柱子,吸取1.0 mL樣品提取液注入層析柱,用25.0 mL的石油醚/乙酸乙酯(9∶1,V/V)混合液洗脫,收集全部淋洗液;然后用高純氮?dú)獯祾邼饪s近干,加2.0 mL正己烷溶解,待氣相色譜測定。

1.3.2 色譜條件

采用HP5890/5971型氣相色譜儀進(jìn)行檢測。色譜柱:石英毛細(xì)管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)。操作條件如下:流動(dòng)相流速1.0 mL/min;檢測波長254 nm;進(jìn)樣口及溫度:毛細(xì)管進(jìn)樣口,250℃;分流模式:不分流;進(jìn)樣量1.0 μL;檢測器溫度300℃,柱前壓55 kPa;柱升溫程序:起始溫度75℃,恒溫2 min后,以25℃/min的速率升溫至200℃,恒溫2 min后,再以6℃/min的速率升溫至260℃,繼續(xù)恒溫15 min;載氣:高純氮?dú)?>99.999%)1.2 mL/min,恒流;尾吹:高純氮?dú)?0.0 mL/min。

1.3.3 聯(lián)苯菊酯農(nóng)藥的消解率

消解率計(jì)算公式:D(%)=(C0-Ct)/C0×100,其中D為農(nóng)藥固態(tài)發(fā)酵加工后的消解率(mg/kg);C0為固態(tài)發(fā)酵處理前聯(lián)苯菊酯的原始附著量(mg/kg);Ct為固態(tài)發(fā)酵處理后聯(lián)苯菊酯殘留量(mg/kg)。

1.3.4 聯(lián)苯菊酯在茶葉中半衰期的計(jì)算

一級動(dòng)力學(xué)方程Ct=C0e-kt是當(dāng)前闡述農(nóng)藥在田間消解規(guī)律最為常用的數(shù)學(xué)模型,具有良好的擬合性[19-24]。當(dāng)農(nóng)藥殘留量降低至原始附著量的一半時(shí)所需時(shí)間稱為該藥的半衰期,通常用t1/2表示。半衰期的長短與農(nóng)藥消解速率呈顯著的負(fù)相關(guān)。在Ct=C0e-kt中,Ct為施藥后t時(shí)刻聯(lián)苯菊酯在茶葉中的殘留量(mg/kg);C0為施藥后2 h的原始?xì)埩袅?mg/kg);t為施藥后天數(shù)(d),k為消解速率;再由半衰期公式t1/2=ln2/k計(jì)算聯(lián)苯菊酯在茶葉中的半衰期(d)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)由SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因素ANOVA分析。用最小顯著性差異檢驗(yàn)(LSD test)檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的差異性。所有數(shù)值均以3個(gè)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(means±SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 聯(lián)苯菊酯在普洱茶發(fā)酵過程中的降解動(dòng)態(tài)

采用2.5%聯(lián)苯菊酯乳油180倍液處理,取50 mL,兌水9 L直接噴施于30 kg曬青毛茶上,進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵。結(jié)果表明,在普洱茶固態(tài)發(fā)酵過程中聯(lián)苯菊酯殘留量隨固態(tài)發(fā)酵時(shí)間的延長呈指數(shù)型曲線下降(見表1、圖1)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,在固態(tài)發(fā)酵過程中受到潮水量、微生物、pH、自身分解和稀釋等影響,隨著時(shí)間的推移,普洱茶中聯(lián)苯菊酯殘留量逐漸降低,前期消解速率快,中期消解速率慢,后期消解速率較快。從表1和圖1可知,接種微生物固態(tài)發(fā)酵能夠有效降低聯(lián)苯菊酯的含量。

施藥后采用傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵,發(fā)酵第7天,聯(lián)苯菊酯降解幅度較大,消解率為9.19%;發(fā)酵第7、14、21天,聯(lián)苯菊酯殘留量隨時(shí)間增長而不同程度增加,分別是12.14、12.76、12.84 mg/kg;可能由于隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,農(nóng)藥被轉(zhuǎn)移到茶葉上,至發(fā)酵第42天,消解率為21.83%。隨著藥后取樣時(shí)間的延長,普洱茶固態(tài)發(fā)酵中聯(lián)苯菊酯殘留量呈逐漸下降趨勢。

施藥后接種釀酒酵母菌進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵,發(fā)酵第7天,聯(lián)苯菊酯消解幅度較大,消解率為18.02%;發(fā)酵后第14、21天,聯(lián)苯菊酯的殘留量隨時(shí)間的增長而微量增加,分別是10.57、11.38 mg/kg;發(fā)酵后42 d,下降為8.45 mg/kg,消解率為36.79%。

施藥后接種黑曲霉進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵,發(fā)酵第7天,聯(lián)苯菊酯消解幅度較大,消解率為19.97%;發(fā)酵后第14、21天,聯(lián)苯菊酯的殘留量隨時(shí)間的增長而微量增加,分別為11.40和12.06 mg/kg;發(fā)酵后42 d,消解率為26.47%。

表1 不同固態(tài)發(fā)酵過程下普洱茶中聯(lián)苯菊酯的消解動(dòng)態(tài)1)

Table 1 Degradation dynamics of bifenthrin in different processes of solid-state fermentation of Pu-erh tea

取樣間隔時(shí)間Samplinginterval傳統(tǒng)發(fā)酵Traditionallyfermented殘留量/mg·kg-1Residualquality消解率/%Degradationrate釀酒酵母Saccharomycescerevisiae殘留量/mg·kg-1Residualquality消解率/%Degradationrate黑曲霉Aspergillusniger殘留量/mg·kg-1Residualquality消解率/%Degradationrate產(chǎn)黃青霉Penicilliumchrysogenum殘留量/mg·kg-1Residualquality消解率/%Degradationrate2h13.37±0.170.00 13.37±0.160.00 13.37±0.110.00 13.37±0.140.00 7d12.14±0.049.19dD10.96±0.1718.02cC10.70±0.1519.97bB10.66±0.1720.26aA14d12.76±0.234.56dD10.57±0.1020.94aA11.40±0.1914.73bB12.46±0.246.80cC21d12.84±0.113.96dD11.38±0.2714.88aA12.06±0.229.79bB12.47±0.326.73cC28d12.00±0.3410.24dD10.25±0.0723.33aA10.45±0.1721.83bB10.69±0.1020.04cC35d10.73±0.0919.74cC9.91±0.3425.87aA10.72±0.2619.82cC10.27±0.2323.18bB42d10.45±0.1321.83dD8.45±0.1136.79aA9.83±0.0926.47bB9.92±0.1125.80cC消解方程DegradationequationC=14.458e-0.04tC=13.348e-0.057tC=12.889e-0.043tC=13.309e-0.042t相關(guān)系數(shù)CorrelationcoefficientR2=0.7567R2=0.7889R2=0.574R2=0.5622半衰期/dHalflife17.3212.1516.1116.50

1) 表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3);根據(jù)多重比較檢驗(yàn),相同取樣時(shí)間不同處理所得的消解率后標(biāo)不同小寫和大寫字母分別表示在P<0.05和P<0.01水平上差異顯著。 Data are mean±SD (n=3); data followed by different letters in the same sampling time are significantly different at 5% and 1% levels between different treatment.

圖1 聯(lián)苯菊酯在不同處理普洱茶固態(tài)發(fā)酵過程中的消解曲線Fig.1 The degradation curve of bifenthrin in SSF of Pu-erh tea

施藥后接種產(chǎn)黃青霉進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵:發(fā)酵后第7天,聯(lián)苯菊酯消解幅度較大,消解率為20.26%;發(fā)酵后第7、14、21天,聯(lián)苯菊酯的殘留量隨時(shí)間的增長而微量增加,分別是10.66、12.46、12.47 mg/kg;發(fā)酵后第42天,消解率為25.80%。

與傳統(tǒng)發(fā)酵方法相比,接種釀酒酵母、黑曲霉、產(chǎn)黃青霉固態(tài)發(fā)酵普洱茶中的聯(lián)苯菊酯殘留量降低,消解速率提高,這可能與酵母菌、黑曲霉、青霉所分泌的胞外酶有關(guān),化學(xué)農(nóng)藥可以作為營養(yǎng)源被微生物分解利用,生成無機(jī)物、二氧化碳和水。在普洱茶發(fā)酵體系中接種優(yōu)勢微生物,發(fā)酵過程中優(yōu)勢微生物分泌胞外酶的數(shù)量和活力與發(fā)酵體系的pH、溫度、濕度密切相關(guān),在適宜的pH、溫度、濕度下,聯(lián)苯菊酯的消解速度加快。在用于發(fā)酵的優(yōu)勢微生物中,釀酒酵母相對于黑曲霉和產(chǎn)黃青霉而言,其分泌的胞外酶對聯(lián)苯菊酯降解的專一性可能較強(qiáng),故而接種酵母菌、黑曲霉和青霉的降解效果顯著高于傳統(tǒng)發(fā)酵，其中接種酵母菌降解效果最顯著。

將試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析表明,傳統(tǒng)發(fā)酵方法、釀酒酵母、黑曲霉、產(chǎn)黃青霉固態(tài)發(fā)酵普洱茶中聯(lián)苯菊酯的消解曲線方程分別為:C=14.458e-0.04t、C=13.348e-0.057t、C=12.889e-0.043t、C=13.309e-0.042t。消解符合一級動(dòng)力學(xué)公式C=C0e-kt。相關(guān)系數(shù)R2分別為0.756 7、0.788 9、0.574、0.562 2,根據(jù)半衰期t1/2=ln2/k計(jì)算可得對照(傳統(tǒng)發(fā)酵)、接種釀酒酵母、黑曲霉、產(chǎn)黃青霉普洱茶固態(tài)發(fā)酵中聯(lián)苯菊酯殘留的半衰期分別為17.32、12.15、16.11、16.50 d。

2.2 微生物固態(tài)發(fā)酵對普洱茶中聯(lián)苯菊酯消解動(dòng)態(tài)的影響

微生物固態(tài)發(fā)酵對普洱茶中聯(lián)苯菊酯消解動(dòng)態(tài)的影響如表2所示。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,普洱茶中聯(lián)苯菊酯的殘留量呈逐漸下降趨勢。接種不同微生物進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵對普洱茶中殘留的聯(lián)苯菊酯具有明顯的消解作用,由表2數(shù)據(jù)可知,發(fā)酵過程對普洱茶中聯(lián)苯菊酯消解率的影響并不是很大。其中釀酒酵母處理的聯(lián)苯菊酯殘留消解率最高,為36.79%,顯著高于傳統(tǒng)發(fā)酵、黑曲霉、產(chǎn)黃青霉處理(P<0.05),與傳統(tǒng)發(fā)酵和黑曲霉、青霉處理的差值分別為14.96%、10.32%、10.99%;黑曲霉、青霉處理的聯(lián)苯菊酯殘留消解率與傳統(tǒng)發(fā)酵處理的差值分別為4.64%、3.97%;殘留的含量差異不大,各處理之間差異顯著(P<0.01),這與微生物種類密切相關(guān)。

表2 不同發(fā)酵處理對聯(lián)苯菊酯殘留消解率的影響

Table 2 Effects of different fermentation treatments on reduction rates of bifenthrin residues in Pu-erh tea

處理Treatment發(fā)酵前殘留量/mg·kg-1Residualcontentbeforefermentation發(fā)酵后殘留量/mg·kg-1Residualcontentafterfermentation消解率/%Degradationrate傳統(tǒng)發(fā)酵Traditionalfermention13.37±0.1710.45±0.1321.83dD釀酒酵母Saccharomycescerevisiae13.37±0.168.45±0.1136.79aA黑曲霉Aspergillusniger13.37±0.119.83±0.0926.47bB產(chǎn)黃青霉Penicilliumchrysogenum13.30±0.149.92±0.1125.80cC

3 討論

孔志強(qiáng)[25]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵微生物或某些發(fā)酵代謝產(chǎn)物會(huì)促進(jìn)農(nóng)藥的消解,因此發(fā)酵加工處理對農(nóng)殘有一定的去除效果,發(fā)酵過程中,發(fā)酵微生物會(huì)吸收一部分殘留農(nóng)藥而將其代謝,其代謝產(chǎn)物如乳酸等也會(huì)促進(jìn)某些農(nóng)藥的分解[26]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)普洱茶的傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵對聯(lián)苯菊酯農(nóng)藥的降低有一定的作用,但是降低水平有限,這與前人[27-29]的研究結(jié)果類似;而接種微生物固態(tài)發(fā)酵對聯(lián)苯菊酯的消解效果優(yōu)于傳統(tǒng)發(fā)酵。人工合成的擬除蟲菊酯殺蟲劑光學(xué)穩(wěn)定性很好,在環(huán)境中殘留期較長。聯(lián)苯菊酯在農(nóng)田和河流沉積中半衰期分別為36 d和163 d[30];本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)茶葉經(jīng)過傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵、接種釀酒酵母、黑曲霉、產(chǎn)黃青霉固態(tài)發(fā)酵后,聯(lián)苯菊酯半衰期分別為17.32,12.15、16.11、16.50 d,進(jìn)一步證明固態(tài)發(fā)酵對聯(lián)苯菊酯農(nóng)藥含量的降低有一定的作用,接種微生物固態(tài)發(fā)酵對聯(lián)苯菊酯消解效果優(yōu)于傳統(tǒng)發(fā)酵。

微生物降解農(nóng)藥是一種高效、經(jīng)濟(jì)的治理農(nóng)藥污染途徑。農(nóng)藥的微生物降解是通過環(huán)境中包括真菌、藻類和細(xì)菌在內(nèi)的微生物把農(nóng)藥分子作為其生存所需要碳源、氮源等營養(yǎng)物質(zhì)來消化吸收而實(shí)現(xiàn)降解。因此,農(nóng)藥的微生物降解速度取決于微生物對環(huán)境的適應(yīng)情況,當(dāng)微生物在適合的溫度和濕度條件下,微生物表現(xiàn)出較強(qiáng)的代謝能力,其消費(fèi)農(nóng)藥的速度就快,農(nóng)藥降解速率就高[26,31]。

不同的微生物類群降解農(nóng)藥的機(jī)理、途徑和過程不同,微生物的種類、代謝活性、適應(yīng)性等都直接影響到對農(nóng)藥的降解與轉(zhuǎn)化[32-33]。首先,本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)接種釀酒酵母處理的聯(lián)苯菊酯殘留降解率最高,為36.79%,顯著優(yōu)于傳統(tǒng)發(fā)酵、黑曲霉、產(chǎn)黃青霉處理(P<0.05),4種處理之間的差異顯著,分別是:酵母菌>黑曲霉>青霉>傳統(tǒng)發(fā)酵,說明微生物在聯(lián)苯菊酯的降解過程中起著關(guān)鍵作用[34-36]。毛雪飛等[18]通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),酵母發(fā)酵對農(nóng)藥殘留的降解效果優(yōu)于曲霉發(fā)酵，本試驗(yàn)結(jié)果與其相似。其次,本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)普洱茶固態(tài)發(fā)酵中的聯(lián)苯菊酯殘留量隨施藥后固態(tài)發(fā)酵時(shí)間的延長呈指數(shù)型曲線下降,隨著時(shí)間的推移,殘留量降低,前期消解速率快,中期消解速率慢,后期消解速率快,降解動(dòng)態(tài)規(guī)律符合一級動(dòng)力學(xué)模型。究其原因:微生物參與的生物降解起了很大作用,聯(lián)苯菊酯可能作為有機(jī)碳源被微生物利用[37]。反過來微生物的代謝作用對其進(jìn)行降解或生物修復(fù)[38],可能因固態(tài)發(fā)酵過程中微生物的呼吸作用導(dǎo)致堆溫的升高使水分損失,可能導(dǎo)致聯(lián)苯菊酯農(nóng)藥殘留升高,或者母體農(nóng)藥分解成一些毒性更高的化合物;也可能固態(tài)發(fā)酵過程的高溫作用,可使農(nóng)藥分子揮發(fā)或分解;也可能因發(fā)酵中活性酶,如磷酸酶、水解酶等,裂解P-O鍵、C-P鍵、P-S鍵等形式促進(jìn)農(nóng)藥分子的降解[39],酶的活性越高,與農(nóng)藥分子的接觸越密切,降解越快。最后,因聯(lián)苯菊酯是茶園中廣泛使用的農(nóng)藥,檢出率高,3次沖泡后有4.4%進(jìn)入茶湯[15],嚴(yán)重影響普洱茶的品質(zhì)和安全性,若被人體少量攝入,對人體健康有著潛在的風(fēng)險(xiǎn)。因此,本研究發(fā)現(xiàn)在普洱茶發(fā)酵初期接入按液茶比為1∶10的比例的有益微生物釀酒酵母、黑曲霉、產(chǎn)黃青霉,特別是酵母菌可以有效降低普洱茶中聯(lián)苯菊酯的含量。初步建立了控制聯(lián)苯菊酯含量的方法,為利用微生物及其降解酶降低普洱茶中菊酯類農(nóng)藥含量提供了良好的應(yīng)用前景,具有一定的實(shí)踐性指導(dǎo)意義,同時(shí)，提升了普洱茶的品質(zhì)和安全性,降低了農(nóng)藥殘留對人體健康的危害,對于保障食品安全有重大意義。接種微生物降解與傳統(tǒng)的物理、化學(xué)方法相比較,具有投入低、治理效果明顯、不易產(chǎn)生副作用的特點(diǎn)。

微生物降解農(nóng)藥研究已經(jīng)較多,其降解機(jī)制有：直接作用于農(nóng)藥,通過一系列酶促反應(yīng)(水解、氧化、還原、脫氧、合成)來降解農(nóng)藥,或者通過微生物的活動(dòng)改變化學(xué)(共代謝作用)或物理環(huán)境(生物濃縮、礦化作用或累積作用)而發(fā)生間接作用來降解農(nóng)藥,如氯氰菊酯在微球菌Micrococcussp.作用下酯鍵斷裂生成 3-苯氧基苯甲酸,進(jìn)一步二苯醚鍵斷裂生成苯酚和原兒茶酸[40]，米曲霉Aspergillusoryzae通過關(guān)鍵磷酸酯酶對 P-O烷基和 P-O 芳基鍵的水解作用將久效磷降解為二氧化碳、可溶性無機(jī)磷酸鹽和氨[41],呋喃丹在微生物作用下快速水解為呋喃酚,經(jīng)氧化生成2-羥基-呋喃酚,然后慢速開環(huán)反應(yīng),完全降解生成CO2和H2O[42]。本文發(fā)現(xiàn)酵母菌、黑曲霉、青霉這3種菌可降解聯(lián)苯菊酯。Cabras等[43]發(fā)現(xiàn)能夠降解擬除蟲菊酯和硫代磷酸鹽類(甲基毒死蜱,殺螟硫磷,對硫磷和喹硫磷)農(nóng)藥;Fatichenti等[44-45]發(fā)現(xiàn),高活性釀酒酵母可以使溴氰菊酯、氰戊菊酯和氯菊酯在發(fā)酵中被完全降解;特種微生物可以有效地降解部分有機(jī)磷、有機(jī)氯和菊酯類農(nóng)藥殘留[46]。目前關(guān)于3種微生物降解聯(lián)苯菊酯農(nóng)藥未見相關(guān)研究,其機(jī)理還不清楚,本文尚未做深入研究,關(guān)于聯(lián)苯菊酯是否在真菌作用下通過菊酯酯鍵斷裂作用完成降解,本研究后續(xù)將進(jìn)一步深化,總結(jié)以往的相關(guān)科研成果,有針對性地對聯(lián)苯菊酯的降解機(jī)理開展進(jìn)一步研究,研究真菌及其酶活性與作用機(jī)制,提高酶的降解譜和降解活性,從而為普洱茶安全生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

研究顯示接種釀酒酵母、黑曲霉、產(chǎn)黃青霉進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵,可以有效降低普洱茶中聯(lián)苯菊酯的殘留量,為控制茶葉產(chǎn)品農(nóng)藥殘留提供了新的技術(shù)思路。因此,普洱茶固態(tài)發(fā)酵過程中利用微生物來降解聯(lián)苯菊酯農(nóng)藥殘留,對提高普洱茶品質(zhì)和安全性,降低消費(fèi)者的健康風(fēng)險(xiǎn)具有重要的理論意義和現(xiàn)實(shí)意義,為今后進(jìn)一步研究微生物對于聯(lián)苯菊酯農(nóng)藥的降解機(jī)理研究提供參考,為安全健康的無公害食品提供科學(xué)技術(shù)保障。

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(責(zé)任編輯：田 喆)

The residues and degradation of bifenthrin in solid-state fermentation of Pu-erh tea

Shan Zhiguo1,2, Zhang Chunhua2, Man Hongping3, Wei Zhaoxia4, Zhou Hongjie4, Zhao Ming4, Duan Shuangmei4, Zhang Naiming1,5

(1.CollegeofPlantProtection,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming650201,China; 2.PuerUnivercity,Puer665000,China; 3.PuerComprehensiveTechnicalTestingCenter,Yunnan665000,China; 4.CollegeofLongrunPu-erhTea,YunnanAgriculturalUniversity,Kunming650201,China; 5.YunnanSoilFertilizerandPollutionRepairEngineeringLaboratory,Kunming650201,China)

In order to study the degradation of bifenthrin in solid-state fermentation of Pu-erh tea, the sun-dried leaves of the large-leaf tea speciesCamelliasinensis(Linn.) var.assamica(Masters) Kitamura in Yunnan Province were added with 180 times of bifenthrin and used as raw materials. Three solid-state fermentations (SSF) of Pu-erh tea inoculated withAspergillusniger,SaccharomycescerevisiaeandPenicilliumchrysogenum, and a traditional SSF with no-inoculation were developed, respectively. Then the residues of bifenthrin in tea leaves were measured by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The degradation of bifenthrin by microorganisms in solid-state fermentation of Pu-erh tea was analyzed. The results showed that the residues of bifenthrin were decreased during SSF of the Pu-erh tea. Inoculation of fungi could effectively reduce the content of bifenthrin in the SSF of Pu-erh tea. The degradation effect of bifenthrin in theSaccharomycescerevisiaefermentation was significantly higher than that inAspergillusnigerandPenicilliumsp. (P<0.05). The degrading dynamics of bifenthrin was the first-order kinetic model:C=C0e-kt. The degradation curve equation wereC=12.889e-0.043t,C=13.348e-0.057t,C=13.309e-0.042t,C=14.458e-0.04t, respectively of three solid-state fermentations (SSF) of Pu-erh tea inoculated withAspergillusniger,SaccharomycescerevisiaeandPenicilliumchrysogenum, and traditional SSF with no-inoculation. In conclusion, the content of bifenthrin was significantly decreased in SSF of Pu-erh tea, due to the degradation by microorganisms. It is worth to further study the degradation effect of SSF in Pu-erh tea on other pesticides.

Pu-erh tea; microorganism; solid-state fermentation; bifenthrin; pesticide residue; degradation

2016-08-26

2016-12-12

科技創(chuàng)新人才計(jì)劃(2015HC018);對外科技合作計(jì)劃-院士專家工作站(2015IC022);云南省科技創(chuàng)新強(qiáng)省計(jì)劃(2014AE014);普洱學(xué)院高層次人才科研啟動(dòng)項(xiàng)目(K2015032);農(nóng)學(xué)專業(yè)普洱茶實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)實(shí)訓(xùn)基地與加工技術(shù)創(chuàng)新服務(wù)中心(A03047-16)

S 481.8

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.04.017

* 通信作者 E-mail:zhangnaiming@sina.com