周興文，楊 樂，黃肇宇，張鳳蘭，王 輝

( 1. 玉林師范學(xué)院，廣西 玉林 537000；2. 信陽農(nóng)林學(xué)院，河南 信陽 464000）

崇左金花茶花粉萌發(fā)及在不同貯藏條件下活力變化的研究

周興文1，楊 樂2，黃肇宇1，張鳳蘭1，王 輝2

( 1. 玉林師范學(xué)院，廣西 玉林 537000；2. 信陽農(nóng)林學(xué)院，河南 信陽 464000）

2015年7月，采集崇左金花茶Camellia chuangtsoensis S. Y. Liang et L. D. Huang花粉，分別置于室溫25℃，4℃，-20℃和-80℃保存。采用離體液體培養(yǎng)基法篩選出最佳崇左金花茶花粉的萌發(fā)條件，在此基礎(chǔ)上試驗不同貯藏溫度和不同貯藏時間對花粉萌發(fā)率的影響。結(jié)果表明，崇左金花茶花粉萌發(fā)的最適培養(yǎng)基為12%蔗糖+0.12% H3BO3?；ǚ?20℃條件下貯藏5個月時，花粉萌發(fā)率仍可達原來的（68.93%）25%；在-80℃條件下貯藏5個月時，花粉萌發(fā)率可達原來的32%，-80℃條件下保存的花粉其萌發(fā)率略高于-20℃。

崇左金花茶，花粉，萌發(fā)，保存 花粉活力

崇左金花茶Camellia chuangtsoensis S. Y. Liang et L. D. Huang為山茶科Theaceae山茶屬Camellia L.的常綠灌木，花期主要集中在5－12月[1-2]，花黃色且花瓣數(shù)量多，是難得的培育山茶花新品種的親本材料。在山茶花新品種培育過程中，雜交育種是培育新品種最有效、最常用的手段之一。但雜交經(jīng)常遇到時空不遇和異地授粉的問題，適宜的花粉保存技術(shù)可有效解決這個問題?；ǚ凼欠N子植物自然條件下遺傳信息交流的載體[3-4]，是開展雜交育種最基本也是最重要的材料，花粉活力的大小對育種成果影響很大，花粉活力是評價花粉保存效果的主要指標之一。因此，授粉前對花粉活力的檢測是至關(guān)重要的[5]。

本研究采用液體培養(yǎng)基萌發(fā)法，對不同保存時間和保存溫度下崇左金花茶花粉活力進行測定，旨在尋找最適合的花粉保存條件，為開展以崇左金花茶為親本的雜交育種工作奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為5年生崇左金花茶嫁接苗25株，種植于廣西玉林師范學(xué)院苗圃中，平均株高90 cm，冠幅60 cm，地栽，長勢良好。

1.2 試驗方法

1.2.1 花粉的收集與保存 2015年7月中旬晴天上午采集崇左金花茶初開花朵，帶回室內(nèi)收集花粉。將收集的新鮮花粉置于硫酸紙上于室溫25℃ ～ 26℃條件下干燥1 d后[6]，取適量花粉與變色硅膠一起分裝于若干個小離心管中密封避光分別放置于室溫25℃以及4℃，-20℃，-80℃冰箱中保存。

1.2.2 花粉活力的測定方法 參考離體萌發(fā)測定法[7-10]，采用液體培養(yǎng)基培養(yǎng)花粉。用吸管吸取培養(yǎng)液，分別滴1滴于雙凹玻片的兩個凹槽中，用毛筆蘸取少量不同溫度下貯藏的干燥花粉，均勻地撒在培養(yǎng)基上，蓋上蓋玻片，用吸水紙吸去多余的培養(yǎng)液，然后置于墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿里，在相應(yīng)溫度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h后，在低倍鏡下觀察花粉粒的萌發(fā)情況并拍照留存，統(tǒng)計參照標準為花粉管長度等于或大于花粉粒直徑者為萌發(fā)。每個處理設(shè)4個重復(fù)，每個重復(fù)在顯微鏡下隨機取4個視野，每個視野20個花粉粒以上，數(shù)取花粉?？倲?shù)及萌發(fā)數(shù)，計算平均值作為萌發(fā)率。

1.2.3 花粉萌發(fā)的培養(yǎng)條件 參考程偉等[7]研究，配置5種花粉萌發(fā)培養(yǎng)基。配方1：10%蔗糖+0.1% H3BO3；配方2：10%蔗糖+0.12% H3BO3；配方3：10%蔗糖+0.14% H3BO3；配方4：12%蔗糖+0.12% H3BO3；配方5：14%蔗糖+0.12% H3BO3（表1）。將崇左金花茶新鮮花粉分別在以上培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度分別為23℃，25℃，27℃，30℃，培養(yǎng)時間為3 h，觀察統(tǒng)計花粉萌發(fā)率，確定最佳培養(yǎng)基和最佳培養(yǎng)溫度。對保存于-20℃和-80℃冰箱中的干燥花粉，培養(yǎng)前于4℃冰箱中復(fù)溫4 h，然后根據(jù)最佳培養(yǎng)基進行花粉培養(yǎng)，測定其活力。

1.2.4 不同條件下花粉保存的時間 新采集的花粉在保存前測定一次花粉活力，干燥處理之后根據(jù)不同的保存溫度確定下一次的測定時間，直到花粉活力喪失，以確定不同溫度下花粉的最長保存時間。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS17.0進行數(shù)據(jù)方差分析，Excel 2010作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 新鮮花粉萌發(fā)最佳培養(yǎng)基和培養(yǎng)溫度

崇左金花茶花粉在不同配方的培養(yǎng)基上和不同溫度下的萌發(fā)率見表1。從表1上可以看出，崇左金花茶在配方1即10%蔗糖+0.1%H3BO3的培養(yǎng)基上，23℃溫度下萌發(fā)率最低；在配方4即12%蔗糖+0.12% H3BO3的培養(yǎng)基上，27℃溫度下萌發(fā)率最高；30℃度條件下萌發(fā)率也較高。因此，花粉萌發(fā)率測定的條件采用配方4，27℃培養(yǎng)3 h。在23℃，25℃，30℃條件下，各組配方之間均差異顯著（P＜0.05），在27℃條件下，配方1和配方2之間差異不顯著，但與其他各組之間均差異顯著（P ＜0.05）。

表1 不同培養(yǎng)基與不同培養(yǎng)溫度下新鮮花粉萌發(fā)率Table 1 Germination rate of pollens in different medium and under different temperature

2.2不同保存溫度對花粉活力的影響

崇左金花茶花粉在不同保存溫度和不同保存時間下的萌發(fā)率見圖1。由圖1可知，5 d內(nèi)保存的花粉在4種溫度下活力相差不大?；ǚ墼?5℃條件下保存至2周時，其活力約為原來（68.93%）一半，其他3種溫度下花粉活力基本接近。當(dāng)花粉在25℃條件下保存至60 d時，花粉已沒有活力；4℃和-20℃條件下保存60 d的花粉，其活力開始呈現(xiàn)出急劇下降的趨勢，-80℃條件下保存的花粉則至第90d時其活力開始急劇下降。長期保存時，4℃條件下花粉活力明顯低于-20℃和-80℃的花粉活力，而-20℃和-80℃條件下保存的花粉其活力相差不大。

圖 1 不同保存溫度下崇左金花茶花粉萌發(fā)率Figure 1 Germination rate of pollens stored at different temperatures

圖 2 花粉在培養(yǎng)基上萌發(fā)Figure 2 Pollens germinated in medium

3 結(jié)論與討論

植物花粉的離體萌發(fā)需要一定濃度的糖、硼酸等物質(zhì)，不同物種對這些物質(zhì)的濃度要求不同[3]。本試驗表明，崇左金花茶花粉萌發(fā)所需的糖、硼酸最佳質(zhì)量分數(shù)分別為12%，0.12%，與其他山茶科植物花粉萌發(fā)所需濃度比較接近[11-13]?；ǚ勖劝l(fā)培養(yǎng)時間與物種、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)基等條件有密切關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，崇左金花茶花粉在液體培養(yǎng)基中經(jīng)過27℃培養(yǎng)3 h之后，大多數(shù)花粉管的長度已經(jīng)達到花粉粒直徑的4倍以上（圖2），完全可以滿足統(tǒng)計分析的需求；與固體培養(yǎng)基萌發(fā)法[3]相比，可以節(jié)省培養(yǎng)時間，且操作相對比較簡便。

花粉活力保持時間的長短受遺傳基因和環(huán)境因素的影響[14]?；ǚ鄢Ｒ姷谋４鏈囟扔?5℃，4℃，-20℃，-80℃，具體選用哪種溫度條件保存取決于所用物種和研究目的。如短期保存，室溫與4℃均可，長期保存的則大多數(shù)選用-20℃條件。但無論哪種條件，都要對花粉活力進行檢測，以確定最佳保存溫度。本試驗表明，崇左金花茶花粉在-80℃條件下保存5個月時其萌發(fā)率約為32%。因此，這兩種溫度均可用于保存崇左金花茶花粉，但是，從經(jīng)濟方面考慮，-20℃條件更適合崇左金花茶的長期保存。

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Pollen Germination of Camellia chuangtsoensis and Their Viability under Different Storage Conditions

ZHOU Xing-wen1，YANG Le2，HUANG Zhao-yu1，ZHANG Feng-lan1，WANG Hui2
（1.Yulin Normal University of Guangxi Zhuang Autonomous Region, Yulin 537000, China; 2. Xinyang College of Agriculture and Forestry of Henan, Xinyang 464000, China）

Pollens of Camellia chuangtsoensis were collected in July 2015, and stored under 25℃, 4℃ and -80℃. Germination conditions for fresh C. chuangtsoensis pollen were tested by fluid medium in vitro. Experiments were conducted on germination rate of pollens stored under different temperature and duration. The result demonstrated that the best medium for fresh pollen germination 12% sucrose + 0.12% H3BO3. Germination rate of pollens stored at -20℃ 5 months later was 25% of that of the fresh ones, and that stored at -80℃ 5 months later was 32%.

Camellia chuangtsoensis; pollen; germination; storage; pollen viability

S 571.1

：A

：1001-3776（2017）03-0028-04

10.3969/j.issn.1001-3776.2017.03.005

2017-01-23 ；

2017-04-11

國家自然科學(xué)基金項目（31360197）；玉林師范學(xué)院高層次人才科研啟動基金(G20120027)；河南省高等學(xué)校重點科研項目（17B220002）

周興文，副教授；從事園林植物栽培育種研究；E-mail：xingwenzhou2003@163.com。通信作者：王輝，副教授，從事植物造景與養(yǎng)護研究；E-mail：tdhp2006@126.com。