朱常成 尹子麗

1.昆藥集團(tuán)股份有限公司，云南 昆明 650100；2.云南中醫(yī)學(xué)院民族醫(yī)藥學(xué)院，云南 昆明 650500

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HPLC法測(cè)定骨碎補(bǔ)及其習(xí)用品中柚皮苷的含量

朱常成1尹子麗2*

1.昆藥集團(tuán)股份有限公司，云南 昆明 650100；2.云南中醫(yī)學(xué)院民族醫(yī)藥學(xué)院，云南 昆明 650500

目的：采用HPLC方法以柚皮苷為指標(biāo)，對(duì)骨碎補(bǔ)及其習(xí)用品進(jìn)行柚皮苷含量測(cè)定。方法：色譜柱C18(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.088%甲酸水溶液(23.3∶76.7)；流速：0.9mL/min；溫度：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)283nm。結(jié)果：柚皮苷線性關(guān)系良好，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性的RSD都低于2%；骨碎補(bǔ)及其習(xí)用品的柚皮苷含量差異較大，最高可達(dá)6.114mg/g，最低為0.464mg/g，少數(shù)習(xí)用品中不含柚皮苷。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好，可作為骨碎補(bǔ)及其習(xí)用品藥材質(zhì)量控制的進(jìn)一步補(bǔ)充。

骨碎補(bǔ)及其習(xí)用品；HPL法；含量測(cè)定；柚皮苷

骨碎補(bǔ)(RhizomaDrynariae)為我國(guó)常用中藥，入藥歷史久遠(yuǎn)，具有補(bǔ)腎強(qiáng)骨、續(xù)傷止痛等功效，臨床用于腎虛腰痛、耳鳴耳聾、筋骨傷折等癥的治療，主要分布于云南、四川、廣西、福建和浙江等地[1-2]。2015年版《中國(guó)藥典》收載骨碎補(bǔ)為水龍骨科槲蕨Drynariafortune(Kunze) J.Sm. 的干燥根莖，而歷代本草和文獻(xiàn)記載骨碎補(bǔ)習(xí)用品有來(lái)源于3個(gè)科6個(gè)屬的10余種藥用植物。柚皮苷是骨碎補(bǔ)的主要活性成分，筆者通過(guò)測(cè)定骨碎補(bǔ)及其習(xí)用品中柚皮苷含量，旨在為骨碎補(bǔ)藥材的資源合理開(kāi)發(fā)與利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 LC-2010AHT高效液相色譜儀(日本島津)；AL204電子天平(梅特勒一托利多儀器(上海)有限公司)；WFZ-UV-2450型紫外分光光度計(jì)(日本島津)；超聲儀(上海冠特超聲儀器有限公司)。

1.2 材料 甲醇為色譜純，水為雙重蒸餾水，其他試劑均為分析純。柚皮苷對(duì)照品購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院(純度≥98%)；骨碎補(bǔ)及其習(xí)用品的樣品主要采自云南省各個(gè)分布區(qū)，材料均由經(jīng)云南大學(xué)陸樹(shù)剛教授鑒定。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Kromat Universil C18(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相為乙腈-0.088%甲酸水溶液(23.3∶76.7)；流速：0.9mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為最大吸收波長(zhǎng)283nm；溫度：30 ℃。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取柚皮苷照品適量，加甲醇溶解制成每mL含柚皮苷0.301mg對(duì)照品溶液。2.3 骨碎補(bǔ)類藥材供試品的制備 分別取骨碎補(bǔ)及其習(xí)用品藥材，粉碎，取約2g精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇 20mL，密塞，稱定重量，超聲處理(功率250W，頻率33kHz) 30min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)濾，濾液水浴揮發(fā)濃縮至約1mL，用甲醇定容至2mL，搖勻，用0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液。

2.4 方法學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 取柚皮苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶解并定量稀釋制成每1mL含0.6mg的溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液，分別精密移取對(duì)照品儲(chǔ)備液2.5、4、5、6、7.5mL置10 mL量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為線性溶液。精密量取各線性溶液10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。由濃度C對(duì)峰面積A進(jìn)行線性回歸，結(jié)果線性方程為：y=0.1681x-2.33，R2=0.9993。結(jié)果表明，柚皮苷在1.53μg～4.59μg內(nèi)線性良好。

2.4.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取柚皮苷對(duì)照品按上述相同條件測(cè)定，分別在0、1、2、4、8、12、24h進(jìn)樣10 μL，測(cè)定柚皮苷峰面積，RSD為0.56%，表明柚皮苷24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.3 精密度實(shí)驗(yàn) 取線性關(guān)系項(xiàng)下柚皮苷對(duì)照品溶液，按上述相同測(cè)定條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣體積為10μL，測(cè)定結(jié)果RSD為0.57%，表明儀器精密度良好。

2.4.4 重復(fù)性 取同一批骨碎補(bǔ)習(xí)用品圓蓋陰石蕨藥材6份，按供試品制備方法制備，測(cè)定含量，測(cè)得重復(fù)性6份RSD值為1.34%，小于2%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5 中間精密度 另一名實(shí)驗(yàn)人員，在不同日期，采用不同儀器及色譜柱對(duì)同一批次骨碎補(bǔ)進(jìn)行含量測(cè)定，2人12次測(cè)定結(jié)果的RSD值為1.14%，小于2%，表明本法精密度良好。

2.5 加樣回收率 精密稱取已知含量的樣品約1g(稱取9份)，分別按柚皮苷含量的50%、100%、150%的量加入各柚皮苷對(duì)照品(每一濃度平行制備3份)，按供試品溶液制備方法制備加樣回收率樣品。分別精密量取10μL進(jìn)樣，計(jì)算測(cè)得量和回收率。要求回收率在95.0%～105.0%之間，以證實(shí)方法具有良好的準(zhǔn)確度。9份回收率均在95%～105%之間。RSD值小于2%，符合要求，本法準(zhǔn)確度良好。見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6 耐用性 為考察色譜條件發(fā)生微小變動(dòng)時(shí)，對(duì)柚皮苷含量測(cè)定的影響。通過(guò)改變流動(dòng)相流速、柱溫、流動(dòng)相比例及甲酸濃度的微小變化，來(lái)考察測(cè)定結(jié)果不受影響的程度。當(dāng)色譜條件發(fā)生微小變動(dòng)時(shí)，對(duì)含量測(cè)定無(wú)影響，說(shuō)明本法精密度好、準(zhǔn)確度高，可用于骨碎補(bǔ)中柚皮苷的含量測(cè)定。見(jiàn)表2

表2 耐用性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.7 樣品含量測(cè)定 取骨碎補(bǔ)及其習(xí)用品不同樣品，按確定的供試品溶液制備方法依法制備，分別精密吸取供試品及對(duì)照品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定柚皮苷的含量。表明所測(cè)定的10種樣品中，柚皮苷含量差異較大。見(jiàn)表3。

3 討論

研究采用高效液相色譜法測(cè)定骨碎補(bǔ)及其習(xí)用品藥材中柚皮苷的含量，對(duì)10個(gè)不同地區(qū)骨碎補(bǔ)及其習(xí)用品進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果表明：柚皮苷含量差異很大，最高是川滇槲蕨為6.114mg/g，最低是膜葉星蕨為0.464mg/g，其中光亮瘤蕨、中華槲蕨、大葉骨碎補(bǔ)及硬葉槲蕨4個(gè)習(xí)用品藥材中中不含柚皮苷。骨碎補(bǔ)習(xí)用品種較多，化學(xué)成分種類較多。目前認(rèn)為柚皮苷為骨碎補(bǔ)主要的活血化瘀成分，但是否為唯一有效成分，能否代表骨碎補(bǔ)入藥，富含柚皮苷的蕓香科植物是否有此藥用功效，由此否定骨碎補(bǔ)習(xí)用品入藥是否合理值得進(jìn)一步從成分與藥效結(jié)合研究后再作評(píng)價(jià)。

表3 骨碎補(bǔ)及其習(xí)用品中柚皮苷含量測(cè)定結(jié)果

[1]明·李時(shí)珍．本草綱目草部第二十卷-骨碎補(bǔ)(校點(diǎn)本，上冊(cè))[M]．北京：人民衛(wèi)生出版社，1982：1384.

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：256.

朱常成(1981-)，男，漢族，工程師，研究方向?yàn)樾滤幯邪l(fā)。E-mail:chng810915@sina.com

尹子麗(1982-)，女，白族，實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)橹兴庂Y源開(kāi)發(fā)與利用。E-mail:zccyzl197974@126.com

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2017-05-13 編輯：陶希睿)