彭亞博　林其洋　魏釗異

摘 要：憂遁草（Clinacanthus nutans CN）是東南亞地區(qū)著名的中草藥植物，含有多種植物化學(xué)成分，常被使用于治療炎癥與癌癥。該研究通過(guò)測(cè)定還原力、ABTS自由基、DPPH自由基以及羥自由基的清除能力，對(duì)憂遁草的抗氧化性進(jìn)行了全面評(píng)估，通過(guò)不同產(chǎn)地的憂遁草提取物和torlox的對(duì)比得到了海南憂遁草對(duì)DPPH自由基、ABTS自由基、以及羥自由基的IC50分別為0.895mg/mL、0.494mg/mL和0.932mg/mL，產(chǎn)自揭陽(yáng)憂遁草IC50為0.685mg/mL、0.262mg/mL、0.801mg/mL。可見(jiàn)，憂遁草具有較好的抗氧化作用，且產(chǎn)自揭陽(yáng)的憂遁草提取物的抗氧化能力優(yōu)于產(chǎn)自海南的憂遁草提取物。

關(guān)鍵字：憂遁草；抗氧化；研究進(jìn)展

中圖分類(lèi)號(hào) S567 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2017）14-0025-05

Abstract：The antioxidant potentials of the methanol extracts from CN were measured as 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH） and 2，2'-azinobis- （3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid） （ABTS） radical scavenging abilities as well as the reducing power assay.IC50 of CN extract from Hainan Province were respectively 0.895mg/mL（DPPH），0.494mg/mL（ABTS） and 0.932mg/mL（OH-），while these values of CN extract from Jieyang were 0.685mg/mL（DPPH）and 0.262mg/mL （ABTS），0.801mg/mL（OH-）.The result illustrated that the antioxidant activities of CN extract from Jieyang was stronger than that of Hainan.It suggested that CN extract could be considered as natural antioxidant sources and dietary nutritional supplements to prevent oxidation-related diseases.

Key words：Clinacanthus nutans；Antioxidant activity；Research progress

憂遁草為爵床科（Acanthaceae）鱷嘴花屬鱷嘴花Clinacanthus nutans的全草，早期歸類(lèi)于扭序花屬，其別名有鱷嘴花、扭序花、青箭、沙巴蛇草、柔刺草等，廣泛分布于馬來(lái)西亞、泰國(guó)、印度尼西亞以及我國(guó)南部至西南部如海南、廣東、廣西、云南等地區(qū)。在東南亞國(guó)家，尤其是泰國(guó)和馬來(lái)西亞，憂遁草是當(dāng)?shù)匾环N比較著名且廣泛使用的藥用植物，我國(guó)《廣西藥用植物名錄》最早記錄了該種藥用植物該植物繁殖一般利用莖切為主要繁殖方式[1-3]。近年來(lái)，憂遁草引起了全世界科研人員的目光，源于一名馬來(lái)西亞淋巴癌患者服用憂遁草而痊愈的事件，受到了許多患者的親睞，目前，國(guó)內(nèi)銷(xiāo)售的憂遁草主要來(lái)源于海南五指山地區(qū)和廣東揭陽(yáng)地區(qū)。

通過(guò)許多研究者的努力，憂遁草中的主要成分已經(jīng)被逐漸探明，憂遁草內(nèi)含有多種不同類(lèi)型的化合物，主要包括三萜類(lèi)、黃酮碳苷類(lèi)、葉綠素類(lèi)，含硫糖苷類(lèi)以及植物甾醇類(lèi)以及一些小分子化合物和生物堿。有學(xué)者在20世紀(jì)70年代發(fā)現(xiàn)了憂遁草中含有三萜類(lèi)化合物如羽扇豆醇、白樺脂醇[4，5]，其后，有學(xué)者從憂遁草中又發(fā)現(xiàn)了諸如（clinacoside A、clinacoside B、clinacoside C）的含硫糖苷類(lèi)物質(zhì)[6]。Teshima KI等[7]研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)了憂遁草中含有某些黃酮碳苷類(lèi)如牡荊草素等，徐淑芬[8]與Tu SF等[9]從憂遁草中分離純化獲得了一些含硫化合物。Ayudhya TDN[10]和SakdaratS等[11]在研究中分別分離純化得到了3種和8種葉綠素，Ayudhya TDN分離純化得到的是3種脫鎂葉綠素，而SakdaratS則得到8種葉綠素，其中有5種結(jié)構(gòu)沒(méi)有被探明，但有3種結(jié)構(gòu)與葉綠素和葉綠素類(lèi)似。憂遁草中還富含鈣、鐵、鎂等微量元素以及多種氨基酸和其他化合物。此外還含大量人體必需氨基酸、脂肪酸、礦物質(zhì)[12]。Yong YK[13]采用在分析憂遁草的抗腫瘤和抗氧化成分時(shí)，得到了多個(gè)小分子化合物。如正十五醇（n-pentadecanol）、二十烷（eicosane）、十七烷（heptadecane）、二十一烷（heneicosane）鄰苯二甲酸二丁酯（dibutyl phthalate）、山崳醇（behenic alcohol）等。

憂遁草是東南亞國(guó)家及泰國(guó)地區(qū)著名的中草藥植物，常被用于治療各種疾病，許多藥效學(xué)研究已證明憂遁草在抗單純皰疹病毒方面有其獨(dú)特的效用[14，15]。臨床上將憂遁草用于治療生殖器皰疹及帶狀皰疹均也取得了較為良好的效果，臨床效果表現(xiàn)良好[16]。憂遁草在抗病毒方面已有的研究主要包括以下幾個(gè)方面：Kongkaew C等[17，18]研究憂遁草的提取物對(duì)HSV-1F的抑制作用，Vachirayon-stien T 等[19]指出在被病毒感染前，憂遁草提取物對(duì)HSV-2具有較為顯著的抑制作用，其作用機(jī)制可能為憂遁草與病毒表面的某些分子相互作用而成。與此同時(shí)，Thawaranantha D等[20]采用 DNA 雜交技術(shù)研究，證明了憂遁草在抗人乳頭瘤病毒（HPV）方面具有良好的抑制作用。有學(xué)者研究憂遁草莖葉部分4個(gè)不同萃取部位對(duì)免疫功能的效果評(píng)估，結(jié)果表明乙醇萃取物具有良好的免疫調(diào)節(jié)活性。有研究表明憂遁草莖的乙醇提取物對(duì)離體大鼠膀胱的抑制收縮作用優(yōu)于葉的提取物[21]。在泰國(guó)及馬來(lái)西亞等地，憂遁草還被用于治療蛇咬傷。毒理學(xué)的相關(guān)研究亞急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明目前沒(méi)有憂遁草甲醇提取物并對(duì)大鼠造成死亡及任何不利影響[22-24]。可見(jiàn)，憂遁草用作藥物治療疾病是無(wú)毒副作用或毒副作用較小。王瑤等[25]的研究結(jié)果表明憂遁草對(duì)小鼠急性肝損傷具有一定的保護(hù)作用。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)憂遁草中不少成分具有抗氧化和清除自由基的功能并進(jìn)行了一系列的實(shí)驗(yàn)。Pannangpetch P等[26]研究憂遁草的乙醇提取物抗氧化活性以及其對(duì)大鼠紅細(xì)胞氧化性溶血的保護(hù)作用，結(jié)果表明憂遁草提取物在清除DPPH自由基具有良好的效果，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)憂遁草提取物具有抗溶血的作用。Yong YK[27]等對(duì)DPPH自由基、NO自由基清除力，以及過(guò)氧化氫自由基的清除各個(gè)方面的抗氧化差異研究對(duì)比了憂遁草提取物的抗氧化能力強(qiáng)弱。Shiuan J等[28]研究結(jié)果表明憂遁草清除SOD活性較差，Ghasemzadeh A等[29]研究發(fā)現(xiàn)特定生長(zhǎng)期憂遁草抗氧化活性明顯高于其他生長(zhǎng)期。

本文通過(guò)不同抗氧化實(shí)驗(yàn)方法評(píng)估產(chǎn)自揭陽(yáng)和海南的憂遁草甲醇提取物的還原力，清除羥自由基的能力，以及清除二苯代苦味酰基自由基（DPPH）能力和ABTS法來(lái)評(píng)價(jià)二者的體外抗氧化活性差異，并采用標(biāo)準(zhǔn)品水溶性維生素E（torlox）作為對(duì)照，揭示了憂遁草提取物的抗氧化活性，為憂遁草進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供了參考資料。

1 試驗(yàn)材料

1.1 儀器與試劑

1.1.1 主要試劑 詳見(jiàn)表1。

1.1.2 主要儀器 詳見(jiàn)表2。

2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容與方法

2.1 憂遁草粗提物的提取 將憂遁草鮮葉置于80℃的烘箱中烘干8h，待其質(zhì)量不再變化時(shí)，用中藥粉碎機(jī)將其粉碎，用甲醇以1∶15的比例在55℃下萃取3h，共萃取3次，將萃取液置于55℃的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸發(fā)，直至得到質(zhì)量不再變化的浸膏。將浸膏移至50mL離心管中，用錫箔紙避光，4℃保存，備用。

2.2 還原力的測(cè)定 抗氧化物質(zhì)能將Fe3+還原成Fe2+，F(xiàn)e2+與鐵氰化鉀反應(yīng)生成可溶性藍(lán)色配合物K4Fe[Fe（CN）6]，該配合物的最大吸收波長(zhǎng)在于700nm處。如果該物質(zhì)的還原力越強(qiáng)，生成的K4Fe[Fe（CN）6]越多，其吸光度將越大。本實(shí)驗(yàn)中采用磷酸緩沖液（0.2mol/L pH6.6）和K3Fe[Fe（CN）6]（1%）各250μL，加入待測(cè)液200μL搖勻后，于50℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)30min，其后加入三氯乙酸（10%）250μL，4000r/min離心10min后，取上清液250μL，與蒸餾水250μL和Fecl3（0.1%w/v）50ul混合后，以磷酸緩沖液做參比，于700nm處測(cè)量吸光值。吸光值越大，則代表該物質(zhì)的還原力越大[30]。

2.3 清除ABTS自由基能力的測(cè)定 準(zhǔn)確稱(chēng)量19.2mgABTS和6.7mg的K2SO8分別溶于5mL的超純水中配置成7.4mmol/L的ABTS的儲(chǔ)備液以及2.6mmol/LK2SO8儲(chǔ)備液的，完全溶解后，用錫箔紙避光反應(yīng)12h，其后用無(wú)水乙醇將其吸光值調(diào)至0.7±0.02備用[31]。于96孔板中加入190μL的ABTS，其后往孔中添加10μL不同濃度的樣品液，靜置6min后，在734nm下測(cè)量其吸光值。

清除率（%）=[1-（AX-AX0）/A0]×100

式中：A0—空白對(duì)照的吸光度，AX—加入提取物吸光度，AX0—不加ABTS的本底吸光度。

2.4 清除DPPH自由基能力的測(cè)定 1，1-二苯基-2-苦基肼基自由基分子在519nm有最大的吸光值，當(dāng)DPPH自由基被清除，其最大吸收波長(zhǎng)吸光度A值會(huì)與之減小。DPPH方法由于其溶液配置和使用方法均較為簡(jiǎn)單，因而被廣泛的應(yīng)用于各類(lèi)抗氧化實(shí)驗(yàn)中。準(zhǔn)確稱(chēng)量DPPH 8mg溶于50mL的乙醇中，配制濃度為0.4mmol/L的DPPH工作液體，在96孔板中加入90μLDPPH反應(yīng)液，其次向孔板中加入不同濃度的樣品10μL，將其避光反應(yīng)30min后，于519nm處測(cè)量其吸光值[32]。

清除率（%）=[1-（AX-AX0）/A0]×100

式中：A0—空白對(duì)照的吸光度，AX—加入提取物吸光度，AX0—不加DPPH的本底吸光度。

2.5 清除羥自由基能力的測(cè)定 本實(shí)驗(yàn)采用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基，選擇過(guò)氧化氫作為氧化劑，在Fe2+催化下產(chǎn)生OH·，反應(yīng)機(jī)理為：Fe2+ + H2O2—Fe3+ + OH- +OH·。在96孔板中，依次加入9mmol/LFeSO4溶液，9mmol/L水楊酸-乙醇溶液，不同濃度提取液和8.8mmol/L的H2O2各50μL。將其用錫箔紙避光置于37℃水浴鍋中反應(yīng)30min，使用蒸餾水做空白對(duì)照，于510nm處測(cè)定吸光值[33]。

清除率由以下公式計(jì)算得出：

清除率（%）=[1-（AX-AX0）/A0]×100

式中：A0—對(duì)照組的吸光度；AX—加入憂遁草提取物吸光度；AX0—不加H2O2的本底吸光度。

2.6 數(shù)據(jù)分析 本實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)均使用Excel和SPSS處理分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 憂遁草提取物提取效率 本實(shí)驗(yàn)中憂遁草的采用的萃取溶劑為甲醇，經(jīng)過(guò)測(cè)量可得，海南憂遁草的提取率為6.42%，揭陽(yáng)憂遁草的提取率為7.73%。Yong YK等研究表明，在不同的烘干溫度下，烘干溫度高的提取率大于低溫，不同溫度下黃酮的提取率為80℃>60℃>50℃>40℃，在不同的萃取溶劑中，僅有冷水的萃取效率大于甲醇[34]。故本實(shí)驗(yàn)選取的烘干溫度，以及萃取溶劑較為合理，達(dá)到較為理想的提取效果。

3.2 憂遁草提取物的還原力 還原力的大小代表一個(gè)抗氧化劑的電子供應(yīng)能力的強(qiáng)弱。還原力較強(qiáng)的抗氧化劑不僅可以供應(yīng)電子使Fe3+還原為Fe2+，同時(shí)也可以參與自由基的反應(yīng)。樣品在700nm處的吸光值的大小則代表了該物質(zhì)還原力的強(qiáng)弱。本實(shí)驗(yàn)以torlox為標(biāo)品，對(duì)比比較不同產(chǎn)地憂遁草提取物的還原能力的大小。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，產(chǎn)自海南的憂遁草的還原力略低于產(chǎn)自揭陽(yáng)憂遁草還原力，如圖1、2可知，提取物的還原吸光值力隨濃度升高而慢慢提高，呈現(xiàn)了較好的量效關(guān)系，在樣品濃度為1mg/mL的時(shí)，兩者吸光值并未達(dá)到1，在濃度為2mg/mL時(shí)，產(chǎn)自海南的憂遁草提取物還原力為0.87，產(chǎn)自海南的憂遁草還原力為1.069，標(biāo)準(zhǔn)品torlox在濃度為0.25mg/mL時(shí)，其吸光值超過(guò)1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明憂遁草具有一定的還原力，但相比于標(biāo)準(zhǔn)品，其還原能力較弱。

3.3 憂遁草提取物清除ABTS自由基能力 ABTS法是一種常見(jiàn)的檢測(cè)物質(zhì)抗氧化的方法，以其檢測(cè)方法簡(jiǎn)單，檢測(cè)結(jié)果靈敏而被大量應(yīng)用于抗氧化能力測(cè)試實(shí)驗(yàn)中，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示：海南憂遁草提取物達(dá)到50%清除率的濃度為0.485mg/mL，略高于產(chǎn)自揭陽(yáng)的憂遁草提取物0.262mg/mL，而對(duì)照組中的torlox則在0.107mg/mL時(shí)對(duì)ABTS自由基的清除率即可達(dá)到50%。2種憂遁草提取物的對(duì)ABTS自由基的最高清除率均小于torlox，torlox的最大清除率可以達(dá)到95%，而2種憂遁草的最大清除率90%，比標(biāo)準(zhǔn)品略低5個(gè)百分點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明兩地的憂遁草提取物對(duì)ABTS自由基的清除效果較好。

3.4 憂遁草提取物清除DPPH自由基能力 由圖4可知，產(chǎn)地不不同的憂遁草對(duì)DPPH自由基的清除能力有一定的差異，產(chǎn)自海南的憂遁草提取物的清除能力稍弱與產(chǎn)自揭陽(yáng)的憂遁草提取物，且兩種提取物的對(duì)DPPH自由基的清除能力均小于torlox，經(jīng)過(guò)SPSS計(jì)算得知，產(chǎn)自海南的憂遁草提取物的IC50為0.893mg/mL，而產(chǎn)自揭陽(yáng)的憂遁草IC50為0.685mg/mL，此時(shí)對(duì)照組torlox的IC50為0.278mg/mL。各個(gè)樣品與清除率間體現(xiàn)了較好的量效關(guān)系，即隨著提取物的濃度增強(qiáng)，其清除率也不斷的增強(qiáng)，在提取物濃度為2mg/mL時(shí)，兩種提取物的清除率均達(dá)到最大，最大清除率約為86%。

3.5 憂遁草提取物清除羥自由基能力 本方法采用Feton反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基，然后在體系中加入水楊酸以捕捉羥自由基使其反應(yīng)產(chǎn)生有色物質(zhì)，其后加入憂遁草提取物和torlox，與水楊酸競(jìng)爭(zhēng)，使有色產(chǎn)物生成量減少，根據(jù)顏色的不同，即可在酶標(biāo)儀下檢測(cè)出其吸光值的變化，進(jìn)而評(píng)價(jià)該提取物的抗氧化能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，torlox和提取物均有清除羥自由基的能力，結(jié)果如圖5所示，加入憂遁草提取液溶液后，能夠有效地清除羥自由基，加入的提取物物濃度不同，清除羥自由基的能力不同；實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，揭陽(yáng)憂遁草提取物的IC50為0.801mg/mL低于而海南憂遁草提取物的0.932mg/mL，證明了前者對(duì)自由基的清除能力大于后者，同時(shí)，torlox的IC50為0.362mg/mL。從圖中的曲線可以看出，不同濃度的憂遁草均具有一定的清除自由基的能力。且清除能力與樣品的濃度呈量效關(guān)系，憂遁草提取物在2mg/mL時(shí)的最大清除率僅為70%，而torlox在1mg/mL的清除率為89%。

4 討論與結(jié)論

4.1 討論 由于不同的抗氧化方法之間的原理存在一定的差異性，因此，物質(zhì)的抗氧化能力不僅會(huì)受不同的反應(yīng)原理的影響，也會(huì)因?yàn)橥环N方法采用的不同濃度以及配比方式的不同而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異，在不同的抗氧化結(jié)果中，許多研究者采用了不同標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照，也使得抗氧化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間難以比較[34]。采用不同的方法評(píng)估同一種物質(zhì)的抗氧性是非常必要的，因?yàn)閱我坏目寡趸瘷z測(cè)方法難以體現(xiàn)某種抗氧化物質(zhì)的抗氧化活性[35]。在本實(shí)驗(yàn)中，實(shí)驗(yàn)者采取了多種實(shí)驗(yàn)方法評(píng)估不同產(chǎn)地憂遁草的抗氧化活性，并采用torlox作為參照，對(duì)比評(píng)估不同產(chǎn)地憂遁草的抗氧化活性。本實(shí)驗(yàn)中，為了準(zhǔn)確的評(píng)估和對(duì)比來(lái)自不同產(chǎn)地的憂遁草提取物的抗氧化能力，采用4個(gè)方法評(píng)估其抗氧化能力，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2種憂遁草的提取物均有較好的抗氧性，產(chǎn)自揭陽(yáng)的憂遁草提取物較之于產(chǎn)自海南的憂遁草提取物總體上顯示出了更好的抗氧化結(jié)果，在4個(gè)評(píng)價(jià)方法中，2種提取物對(duì)ABTS與DPPH自由基的清除能力更強(qiáng)，而在羥自由基與還原力的方法測(cè)評(píng)上表現(xiàn)稍差，實(shí)驗(yàn)結(jié)果較為全面地體現(xiàn)了憂遁草的抗氧化能力，表明憂遁草具有較好的抗氧化能力。

4.2 結(jié)論 還原力的測(cè)定結(jié)果顯示產(chǎn)自海南的憂遁草的還原力略低于產(chǎn)自揭陽(yáng)憂遁草還原力。在濃度為2mg/mL時(shí)，產(chǎn)自海南的憂遁草提取物700nm處吸光度為0.87，產(chǎn)自揭陽(yáng)的憂遁草的吸光度為1.069。ABTS自由基清除能力的測(cè)定中，海南憂遁草的IC50為0.494mg/mL，揭陽(yáng)憂遁草IC50為0.262mg/mL，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，2種憂遁草對(duì)ABTS自由基清除效果好，該方法測(cè)試靈敏度較高。在DPPH自由基清除能力的測(cè)定結(jié)果顯示，產(chǎn)自海南的憂遁草提取物IC50分別為0.895mg/mL，產(chǎn)自揭陽(yáng)憂遁草提取物IC50為0.685mg/mL，該結(jié)果能夠較好的評(píng)價(jià)其抗氧化性。本實(shí)驗(yàn)中還采用了羥自由基的清除能力對(duì)憂遁草的抗氧化性進(jìn)行評(píng)價(jià)，通過(guò)將2種不同產(chǎn)地的憂遁草提取物和torlox的清除率對(duì)比發(fā)現(xiàn)，該方法檢測(cè)靈敏度效果不明顯，海南憂遁草的IC50為0.932mg/mL，揭陽(yáng)憂遁草IC50為0.801mg/mL，標(biāo)準(zhǔn)品torlox IC50為0.362mg/mL。

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（責(zé)編：張宏民）