付晶晶 肖海芳 宋元達(dá)

(山東理工大學(xué)農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院，山東 淄博 255000)

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金銀花等6種植物提取物總黃酮含量與抗氧化性相關(guān)性研究

付晶晶 肖海芳 宋元達(dá)

(山東理工大學(xué)農(nóng)業(yè)工程與食品科學(xué)學(xué)院，山東 淄博 255000)

以金銀花、核桃葉、南非醉茄、何首烏、紅景天、石榴皮6種提取物為試驗(yàn)對(duì)象，通過(guò)硝酸鋁—亞硝酸鈉比色法測(cè)定了總黃酮含量；采用ABTS、DPPH與Fenton法測(cè)定了其抗氧化能力并進(jìn)行比較；采用Pearson法進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果表明：對(duì)DPPH自由基的清除能力順序?yàn)榻疸y花>核桃葉>南非醉茄>紅景天>何首烏>石榴皮；對(duì)羥基自由基的清除能力順序?yàn)榻疸y花>核桃葉>南非醉茄>何首烏>石榴皮>紅景天；對(duì)ABTS+自由基清除能力順序?yàn)榻疸y花>核桃葉>紅景天>南非醉茄>何首烏>石榴皮?？傸S酮含量對(duì)DPPH、ABTS+與羥基自由基清除能力的相關(guān)系數(shù)分別為0.819，0.848，0.791，表明總黃酮含量與清除DPPH、ABTS+自由基能力呈顯著相關(guān)性，與清除羥基自由基能力相關(guān)性不顯著。

金銀花；何首烏；紅景天；石榴皮；南非醉茄；核桃葉；總黃酮；抗氧化活性

由于自由基與人體內(nèi)多種疾病相關(guān)，近年來(lái)，自由基與健康的相關(guān)性逐漸成為研究熱點(diǎn)[1]。自由基又稱為“游離基”，是細(xì)胞正常的代謝產(chǎn)物[2]，它是一種缺乏電子的物質(zhì)，具有很強(qiáng)的反應(yīng)性，它可以從其他化合物中獲得電子來(lái)維持穩(wěn)定[3]。眾多醫(yī)學(xué)研究表明，過(guò)量的自由基可以破壞人體內(nèi)包括DNA[4]、蛋白質(zhì)[5]、脂質(zhì)[6]等各種生物大分子的完整性，從而導(dǎo)致各種各樣疾病的發(fā)生發(fā)展?？寡趸瘎┛梢郧宄杂苫鶑亩乐棺杂苫鶎?duì)人體的各種損害[7]，BHT、BHA等是人們最常用的合成抗氧化劑，然而，這些抗氧化劑在抗氧化的同時(shí)也存在潛在的致癌作用[8]。因此，開發(fā)安全、無(wú)毒無(wú)害、健康的天然抗氧化劑具有重要的應(yīng)用價(jià)值[9]。

黃酮類化合物是植物次生代謝的產(chǎn)物，廣泛存在于天然植物中[10-11]。眾多研究表明，黃酮類化合物具有抗炎[12]、抗氧化[13]、抗菌[14]、抗腫瘤[15]等生物活性。大多數(shù)黃酮類化合物均有較強(qiáng)的抗氧化作用[16]，而黃酮類化合物的一些藥理活性也往往與其抗氧化作用相關(guān)[17]。近年來(lái)，因黃酮類其藥理作用在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域研究較為深入，加快了其化合物的開發(fā)利用[18-19]。劉昌平等[20]研究發(fā)現(xiàn)，金銀花中黃酮類化合物可以阻斷亞油酸的自氧化作用；陳紅紅等[21]研究表明核桃葉中的總黃酮對(duì)D-半乳糖導(dǎo)致的衰老小鼠具有延緩衰老的作用；龔曉武等[22]證明了紅景天黃酮類提取物對(duì)超氧陰離子、DPPH自由基、羥基自由基具有較好的清除作用；王濤等[23]證明何首烏黃酮類提取物對(duì)羥基自由基具有較好的清除能力；劉夢(mèng)星等[24]證明石榴皮總黃酮提取物對(duì)羥基自由基具有較好的清除能力；朱海升等[25]研究表明南非醉茄根提取物在抗老年癡呆方面具有重要作用。本研究從植物來(lái)源及未來(lái)開發(fā)利用等多方面考慮，對(duì)已經(jīng)報(bào)道的植物進(jìn)行篩選分析之后，以金銀花、何首烏、石榴皮、紅景天、南非醉茄、核桃葉6種植物提取物為研究對(duì)象，利用硝酸鋁—亞硝酸鈉比色法[26]測(cè)定6種物質(zhì)提取物總黃酮含量，再采用羥基自由基(·OH)清除率[27]、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)清除率[28]、ABTS+自由基清除率[29]評(píng)價(jià)6種物質(zhì)的抗氧化性，以期篩選出抗氧化性最強(qiáng)的植物，并分析其量效關(guān)系，旨在為黃酮類功能性食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

新鮮核桃葉：采自淄博市博山區(qū)；

金銀花、何首烏、紅景天、石榴皮、南非醉茄提取物：陜西信瑞生物科技有限公司；

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、DPPH、ABTS：純度≥98%，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

無(wú)水乙醇：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

其他試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠；

循環(huán)水式真空泵：SHZ-D型，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；

超聲清洗器：KQ-700E型，昆山超聲儀器有限公司；

電熱鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9140A型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

高速萬(wàn)能粉碎機(jī)：FW100型，天津市泰斯特儀器有限公司；

分光光度計(jì)：UV-2600 型，日本島津(中國(guó))有限公司；

電子天平：LE303E/02 型，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品液的制備 準(zhǔn)確稱取0.1 mg金銀花、石榴皮、核桃葉、南非醉茄、何首烏、紅景天提取物于10 mL容量瓶中用蒸餾水定容至刻度，得到10 mg/mL的樣品液。

1.2.2 總黃酮含量的測(cè)定

(1) 標(biāo)準(zhǔn)液的配置：準(zhǔn)確稱取10 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，置于100 mL容量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，得濃度為0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)液。

(2) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：準(zhǔn)確吸取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液0.00，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 mL置于 10 mL 的試管中，加入30%的乙醇至5 mL，加入5%亞硝酸鈉溶液 0.3 mL，混勻；放置 6 min 后加入10%硝酸鋁溶液 0.3 mL，搖勻；放置6 min后加入10%氫氧化鈉溶液 4 mL，搖勻；最后用60%的乙醇定容至10 mL，搖勻，15 min后于510 nm處測(cè)定吸光值，根據(jù)所得數(shù)據(jù)，以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1)，得線性回歸方程為：y=11.04x-0.007 6，R2=0.995 2。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

(3) 樣品液總黃酮含量的測(cè)定：分別準(zhǔn)確吸取1 mL各樣品液于10 mL容量瓶按1.2.2(2)的方法加入顯色劑，加60%的乙醇至刻度，搖勻，10 min后，于510 nm處測(cè)吸光度。以未加樣品液的為空白，每個(gè)樣品重復(fù)3次?？傸S酮含量按式(1)計(jì)算：

(1)

式中：

F——黃酮類物質(zhì)含量，mg/g；

C——提取液中總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；

d——稀釋倍數(shù)；

V——提取液定容體積，mL；

M——樣品質(zhì)量，g。

1.2.3 DPPH自由基的清除作用 精密稱取7.88 g DPPH，用無(wú)水乙醇溶解并定容于100 mL容量瓶中，得到濃度為2×10-4mol/L的DPPH溶液，4 ℃保存，現(xiàn)配現(xiàn)用。避光取2 mL樣品液于10 mL容量瓶中，用70%乙醇定容至刻度。取3組標(biāo)號(hào)為1、2、3、4、5的5支5 mL離心管加樣，混勻后室溫避光靜置30 min，在波長(zhǎng)為517 nm條件下測(cè)定吸光值，按式(2)計(jì)算DPPH清除率并計(jì)算IC50(當(dāng)抑制率到達(dá)50%時(shí)所需抗氧化劑的量)。每個(gè)樣品做3次平行。

(2)

式中：

D——DPPH自由基清除率，%；

Ai——2 mL樣品液與2 mL DPPH混合后的吸光度；

Aj——2 mL樣品液與2 mL 70%乙醇混合后的吸光度；

Ac——2 mL DPPH與2 mL 70%乙醇混合后的吸光度。

1.2.4 羥基自由基的清除作用 分別量取0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 mL樣品液于10 mL容量瓶中，并用70%乙醇定容至刻度。取3組標(biāo)號(hào)為1、2、3、4、5的5支5 mL離心管加樣，第一組分別加入1 mL 0.75 mmol/L的鄰二氮菲與5種不同濃度梯度的樣品1 mL，后加入0.75 mmol/L的硫酸亞鐵1 mL，最后加入60 mmol/L H2O21 mL，混勻后水浴60 min，在波長(zhǎng)536 nm條件下測(cè)定吸光值得As；第二組、第三組分別用蒸餾水替代60 mmol/L H2O2得Ab、用蒸餾水代替樣品溶液得Ap，按式(3)計(jì)算羥基自由基清除率并計(jì)算IC50。每個(gè)樣品做3次平行。

(3)

式中：

O——羥基自由基清除率，%。

1.2.5 ABTS+自由基的清除作用 分別量取0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 mL樣品液于10 mL容量瓶中，并用70%的乙醇定容至刻度。取2組標(biāo)號(hào)為1、2、3、4、5的5支5 mL離心管加樣，將經(jīng)暗處理24 h的體積比為1∶1的混合液(7 mmol/L的ABTS和2.5 mmol/L的K2S2O8)稀釋40～50倍，使其在734 nm處吸光度為0.7±0.02，制成ABTS+工作液。第一組中分別取0.8 mL ABTS+與0.2 mL無(wú)水乙醇混合均勻，測(cè)得吸光值為A；第二組中分別取0.8 mL ABTS+與各濃度梯度的提取液0.2 mL混合均勻，測(cè)得吸光值為A0。樣品混勻后室溫避光靜置6 min，再在734 nm條件下測(cè)定吸光值。按式(4)計(jì)算ABTS+自由基清除率并計(jì)算IC50。每個(gè)樣品做3次平行。

(4)

式中：

A——ABTS+自由基清除率，%。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析 采用Spss v19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，Pearson法進(jìn)行相關(guān)性分析，Duncan法進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 6種總黃酮類提取物的含量

由圖2可知，6種物質(zhì)的總黃酮含量順序?yàn)椋航疸y花>核桃葉>南非醉茄>紅景天>何首烏>石榴皮。其中，金銀花、核桃葉、南非醉茄總黃酮含量分別是石榴皮的4.6，2.5，2.4倍。

2.2 6種提取物的抗氧化活性

2.2.1 DPPH自由基的清除能力 DPPH作為一種穩(wěn)定的自由基，而被廣泛應(yīng)用于自由基清除試驗(yàn)中。由圖3可知，6種不同濃度的黃酮類提取物對(duì)DPPH自由基均有清除作用，且隨濃度升高清除作用增強(qiáng)，但6種物質(zhì)清除DPPH自由基的增幅不明顯。

研究表明黃酮類物質(zhì)含量與抗氧化性具有相關(guān)性[30]，DPPH清除率達(dá)到50%時(shí)的組分濃度(IC50)與清除能力呈反比，IC50越大，其清除DPPH自由基的能力就越小[31]。圖4結(jié)果顯示6種提取物IC50范圍為0.096～0.374 mg/mL，其中金銀花提取物的IC50最小為0.096 mg/mL，石榴皮提取物的IC50最大為0.374 mg/mL。6種提取物清除DPPH自由基的順序?yàn)椋航疸y花>核桃葉>南非醉茄>紅景天>何首烏>石榴皮。

圖2 6種提取物的總黃酮含量

圖3 6種提取物對(duì)DPPH自由基的清除能力

圖4 清除DPPH自由基的IC50值

2.2.2 羥基自由基的清除能力 羥基自由基被公認(rèn)為是最具活性的活性氧，能導(dǎo)致生物體內(nèi)DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)氧化損傷。目前關(guān)于羥基自由基的產(chǎn)生機(jī)理，最被廣泛接受的是過(guò)渡金屬離子催化的Fenton反應(yīng)[32]。H2O2/Fe2+體系可以通過(guò)Fenton反應(yīng)產(chǎn)生羥基自由基，鄰二氮菲-Fe2+水溶液被羥基自由基氧化為鄰二氮菲-Fe3+后，其在536 nm處的最大吸收峰消失，A536值降低。當(dāng)反應(yīng)體系中加入羥基自由基清除劑時(shí)，此過(guò)程受到抑制。試驗(yàn)結(jié)果表明(見圖5)核桃葉、金銀花、南非醉茄、紅景天、何首烏、石榴皮均對(duì)羥基自由基具有清除作用，并且在濃度為0.08～0.16 mg/mL時(shí)，清除能力變動(dòng)幅度較大，0.16 mg/mL后變動(dòng)幅度趨于平穩(wěn)。整體看6種提取物對(duì)羥基自由基清除能力均隨濃度升高而增高，因此6種提取物對(duì)羥基自由基清除能力表現(xiàn)出一定的量效關(guān)系。

6種植物提取物IC50范圍為0.045～0.316 mg/mL(見圖6)，金銀花提取物IC50為0.045 mg/mL，明顯低于其它5種物質(zhì)，紅景天提取物IC50最大(為0.316 mg/mL)，6種提取物清除羥基自由基的順序?yàn)椋航疸y花>核桃葉>南非醉茄>何首烏>石榴皮>紅景天。

圖5 6種提取物對(duì)羥基自由基的清除作用

圖6 清除羥基自由基的IC50值

2.2.3 ABTS+自由基清除能力 ABTS自由基經(jīng)活性氧氧化產(chǎn)生穩(wěn)定的藍(lán)綠色自由基ABTS+，在734 nm處有最大吸收峰，在抗氧化物質(zhì)的作用下反應(yīng)體系褪色，因而依據(jù)吸光值的變化可以衡量待測(cè)物對(duì)ABTS+自由基清除能力。本試驗(yàn)利用該法測(cè)定6種提取液的抗氧化能力，結(jié)果表明(見圖7)，6種提取物對(duì)ABTS+自由基均有清除作用。其中金銀花提取物在濃度為0.24 mg/mL時(shí)增幅較大，其它5種提取物增幅趨于平穩(wěn)，隨提取物黃酮濃度的增加6中提取物對(duì)ABTS+自由基清除能力均增加。說(shuō)明6種提取物對(duì)ABTS+自由基的清除能力存在一定的量效關(guān)系。

提取物IC50的變動(dòng)范圍為0.067～0.415 mg/mL(見圖8)，其中金銀花提取物IC50最小為0.067 mg/mL，所以其抗氧化性最強(qiáng)，其他5種提取物中石榴皮的IC50最大，其抗氧化性最弱。6種提取物ABTS+自由基清除能力順序?yàn)椋航疸y花>核桃葉>紅景天>南非醉茄>何首烏>石榴皮。

圖7 6種提取物對(duì)ABTS+自由基的清除作用

圖8 清除ABTS+自由基的IC50值

2.2.4 6提取物總黃酮含量與抗氧化性相關(guān)性分析 對(duì)6種總黃酮提取物抗氧化性進(jìn)行了Pearson法相關(guān)性分析(結(jié)果見表1)，表明總黃酮含量與清除DPPH自由基、ABTS+自由基能力呈顯著相關(guān)性，與清除羥基自由基能力相關(guān)性不顯著。由此總黃酮在抗氧化過(guò)程中起著較為重要的作用。

表1 6種提取物總黃酮含量與抗氧化性相關(guān)性分析?

? *顯著相關(guān)(P<0.05)。

3 結(jié)論

供試的6種植物提取物的總黃酮含量及對(duì)自由基清除能力表現(xiàn)出一定的差異性。并且隨著總黃酮含量的增加抗氧化能力隨之增加。可能是黃酮類物質(zhì)的多樣性及各個(gè)樣品中具有抗氧化的種類及其中具有抗氧化的有效黃酮種類和含量不同。黃酮類物質(zhì)種類繁多，但并不是所有的黃酮類化合物都具有相同的抗氧化能力，而是與每種化合物的結(jié)構(gòu)有關(guān)。

據(jù)以往研究[33]表明黃酮類化合物只是衡量物質(zhì)抗氧化的一個(gè)主要指標(biāo)，所以不同物質(zhì)表現(xiàn)出不同的清除能力可能與其主導(dǎo)的抗氧化性物質(zhì)種類有關(guān)。至于能不能將黃酮類物質(zhì)含量作為唯一衡量抗氧化的指標(biāo)，值得進(jìn)一步研究。

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Acomparative study of contents of total flavonoids and their antioxidant activities in six plants

FU Jing-jing XIAO Hai-fang SONG Yuan-da

(School of Agricultural Engineering and Food Science, Shandong University of Technology, Zibo, Shandong 255000, China)

In the present study, six total flavonoids extracts were prepared from Honey suckle, Walnut leaves,WithaniaSomnifera,Rhodiolarosea, Pomegranate bark, andPolygonummultiflorum. The total flavonoids content of six plant extracts were measured by aluminium nitrate-sodium nitrite colorimetry. The antioxidant activities of six extracts were compared by the detection methods of DPPH, ABTS and Fenton, and then the correlation of total flavonoids content was analyzed by Pearson. The results showed that the DPPH scavenging order was Honey suckle>Walnut leaves>W.Somnifera>R.rosea>P.multiflorum>Pomegranate bark. The hydroxyl radical scavenging order was Honey suckle>Walnut leaves>W.Somnifera>P.multiflorum>Pomegranate bark>Rhodiola rosea. The results showed that the ABTS+scavenging order was Honey suckle>Walnut leaves>R.rosea>W.Somnifera>P.multiflorum>Pomegranate bark. The free radical scavenging ability and flavonoids content of six kinds of extracts showed quantitative relationship. The correlation that the total flavonoid content and DPPH, ABTS+was significantly positive, while with hydroxyl radical was not the same. The correlation coefficients above were 0.819, 0.848 and 0.791, respectively.

Honey suckle; Walnut leaves;WithaniaSomnifera;Rhodiolarosea; Pomegranate bark;Polygonummultiflorum; total flavonoids; antioxidant activity

山東省自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(編號(hào)：ZR2014CQ002)

付晶晶，女，山東理工大學(xué)在讀碩士研究生。

肖海芳(1980—)，女，山東理工大學(xué)講師，博士。 E-mail:xiaohaifang@sdut.edu.cn

2017—02—25

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.06.032