孫志高 盛 冉 郝靜梅 龍 勇 于奉生 方 明

(1. 西南大學柑桔研究所，重慶 400712；2. 西南大學食品科學學院，重慶 400715)

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QuEChERS—高效液相色譜法檢測柑桔中毒死蜱、吡蟲啉和殘殺威農(nóng)殘

孫志高1,2盛 冉1郝靜梅1龍 勇1于奉生1方 明1

(1. 西南大學柑桔研究所，重慶 400712；2. 西南大學食品科學學院，重慶 400715)

將改進的QuEChERS方法與GB/T 24691—2009中農(nóng)藥提取方法進行比較，通過高效液相色譜法檢測2種方法對柑桔農(nóng)殘的分離效果。結果顯示：改進的QuEChERS方法檢測毒死蜱、吡蟲啉和殘殺威時出峰時間分別約為5.1，3.8，11.5 min；當空白加標水平分別為0.8～80.0，0.5～40.0，0.8～80.0 μg/mL時，檢出限分別為0.89，0.55，0.39 μg/mL；當空白加標水平分別為1～20，1～20，5～30 μg/mL時，回收率分別為68%～109%，94%～108%，109%～125%，相對標準偏差分別為2.48%～5.03%，7.79%～10.92%，2.32%～6.77%。采用GB/T 24691—2009提取毒死蜱、吡蟲啉和殘殺威時，出峰時間與改進的QuEChERS方法基本相同；當與改進的QuEChERS方法采用相同的空白加標水平，檢出限分別為0.80，0.78，0.54 μg/mL，回收率分別為107%～195%，25%～87%，53%～93%，相對標準偏差分別為5.61%～7.73%，6.89%～9.42%，5.44%～10.45%。因此，QuEChERS—高效液相色譜法檢測毒死蜱、吡蟲啉和殘殺威農(nóng)殘時優(yōu)于GB/T 24691—2009方法。

QuEChERS；高效液相色譜；毒死蜱；吡蟲啉；殘殺威

柑桔作為世界第一大類水果，種植面積和產(chǎn)量都逐年穩(wěn)步增長，且種植面積和產(chǎn)量中國都穩(wěn)居第一，2014年中國柑桔種植面積為240.40×104hm2、產(chǎn)量為3 546.93×104t[1]。同時，柑桔也是世界第三大貿(mào)易農(nóng)產(chǎn)品，鮮果出口為其主要方式，但中國柑桔的質量安全、貿(mào)易出口形勢卻不容樂觀，突出表現(xiàn)為農(nóng)藥殘留率偏高[2]。因此，開發(fā)快速、高效、簡便、靈敏的農(nóng)殘檢測方法刻不容緩，對柑桔產(chǎn)業(yè)發(fā)展有著重要的意義。

果蔬農(nóng)藥殘留檢測方法較多，其中分子印跡[3]、光譜無損檢測[4]、QuEChERS聯(lián)用液相或氣相[5-7]等方法發(fā)展迅速。但在眾多方法之中，QuEChERS聯(lián)用液相或氣相對農(nóng)藥檢測更具有廣泛性、穩(wěn)定性和準確性。該方法以乙腈作為提取劑，利用氯化鈉鹽析以促進農(nóng)藥提取，采用無水硫酸鎂對水、PSA(乙二胺基-N-丙基)等基質雜物進行吸取凈化處理，進而實現(xiàn)農(nóng)藥的簡單高效提取[7-10]。QuEChERS技術經(jīng)過10多年的發(fā)展，國外已經(jīng)將其作為標準方法應用，如英國BS EN 15662:2008標準已將QuEChERS法作為植物來源食物中農(nóng)藥殘留的檢測方法，并在原方法的基礎上改進和發(fā)展了多種相似的方法，根據(jù)檢測樣品、農(nóng)藥種類不同，采用具有緩沖或酸性物質的乙腈溶液，取代了原始單一乙腈提取劑[8,11-13]；將具鹽析功能的氯化鈉、吸水功能的無水硫酸鎂、純化吸附各種基質雜質功能的PSA等也替換成了其它物質[14-17]。

雖然中國GB/T 24691—2009已實施，但該標準方法在提取農(nóng)殘時存在有機溶劑消耗量大、耗時長、準確度不高等缺陷。本試驗擬對改良QuEChERS法與GB/T 24691—2009中農(nóng)藥提取試驗方法進行對比研究，旨在探討改良QuEChERS法在果蔬洗滌劑國標中應用的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

柑桔樣品：北碚447，采于重慶市北碚區(qū)歇馬鎮(zhèn)衛(wèi)星村；

毒死蜱農(nóng)藥：有效成分14.8%，中國農(nóng)業(yè)科學院植保所廊坊農(nóng)藥中試廠；

吡蟲啉農(nóng)藥：有效成份10%，江蘇克勝集團股份有限公司；

殘殺威農(nóng)藥：有效成份12%，江蘇揚農(nóng)化工股份有限公司；

吡蟲啉[Imidacloprid，1-(6-氯吡啶-3-吡啶基甲基)-N-硝基亞咪唑烷-2-基胺，cas:138261-41-3]標準品(純度98.4%)、毒死蜱[Chorpyrifos，O,O-二乙基-O-(3,5,6-三氯-2-吡啶基)硫代磷酸，cas:2921-88-2]標準品(純度99.4%)、殘殺威[Propoxur，2-(1-甲基乙氧基)苯基氨基甲酸甲酯，cas:114-26-1]標準品(純度98.1%)、PSA(乙二胺基-N-丙基)：上海哈靈生物科技有限公司；

乙腈：色譜純，美國Sigma公司；

其它試劑未作特殊說明均為分析純。

1.1.2 儀器與設備

高效液相色譜(HPLC)：UltiMateTM 3000型，美國DIONEX公司；

臺式低速大容量離心機：L-550型，長沙湘儀離心儀器有限公司；

臺式高速冷凍離心機：UnicenMR型，德國Germany Herolab公司；

漩渦振蕩器：XW-80A型，上海青浦滬西儀器廠；

組織搗碎機：JJ-2B型，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；

電子天平：YP10K-1型，上海舜宇恒平科學儀器有限公司；

電子天平：FA2004B型，賽多利斯科學儀器；

水浴鍋：LKTC-B1-T型，上海雙舜實業(yè)發(fā)展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：博納艾杰爾C18(4.6 mm × 250 mm，5 μm)；柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長：230(毒死蜱)，269(吡蟲啉)，210(殘殺威) nm；進樣量：20 μL；流動相為乙腈/水(毒死蜱、吡蟲啉、殘殺威對應的乙腈與水體積比分別為95∶5，55∶45，80∶20)。

1.2.2 標準溶液制備 分別準確稱取毒死蜱標準品、吡蟲啉標準品、殘殺威標準品0.04，0.02，0.04 g，乙腈溶解，制成質量濃度分別為200，100，200 μg/mL的標準品原溶液。準備適量原溶液，將3種標品分別配置成0.8，1.0，2.0，3.0，4.0，20.0，80.0 μg/mL(毒死蜱)；0.5，1.0，2.0，3.0，10.0，40.0 μg/mL(吡蟲啉)；0.8，1.0，2.0，3.0，4.0，20.0，80.0 μg/mL(殘殺威)系列濃度的標準溶液，備用。

1.2.3 試樣處理

(1) 標準硬水：稱取MgSO4·7H2O 24.7 g和CaCl216.7 g，配制成10 L，即濃度為2 500 mg/kg。在使用時，將1 L再稀釋成10 L，即濃度為250 mg/kg。

(2) 農(nóng)藥乳液制備：稱取適量毒死蜱、吡蟲啉和殘殺威等農(nóng)藥分別溶于500 g無水乙醇溶液中攪拌均勻，再用標準硬水定量至5 000 g，攪拌均勻備用。3種農(nóng)藥乳液濃度分別為>1 000(毒死蜱)，>500(吡蟲啉)，>1 000(殘殺威) mg/kg。

(3) 含農(nóng)藥柑桔樣本制備：選取無損傷、腐爛且大小均勻的柑桔作為試驗樣本。將樣品浸于農(nóng)藥乳液中，30 min后取出放置于通風櫥晾干24 h。將制備好的柑桔樣品分成若干組，每組2份平行樣品，每份重量為(400±40) g。

1.2.4 樣品檢測

(1) 改良QuEChERS方法：稱取樣品10 g加乙腈15 mL、無水MgSO44 g、NaCl 1 g漩渦振蕩3 min，并在4 200 r/min離心5 min，取2 mL離心上清液于加有150 mg/mL無水MgSO4、20 mg/mL PSA的10 mL離心管中漩渦振蕩，再在10 000 r/min離心5 min，并用0.22 μm有機膜過濾備用。

(2) 國標法(GB/T 24691—2009)：取60 g搗碎均勻的柑桔樣品、加入100 mL 0.1%冰乙酸乙腈溶液、6 g 無水乙酸鈉和18 g無水MgSO4，攪勻并置于50 Hz的超聲器中處理3 min后，取上清萃取液于燒杯中，且按此方法重復2次。將重復萃取3次后的樣品殘渣放入50 mL離心管，于4 000 r/min離心4 min，將離心之后的上清液與前面得到的萃取液混合，并置于(80±2) ℃水浴中濃縮至5～8 mL(濃縮耗時約3～4 h)，最后濃縮液定容至50 mL備用。

2 結果與分析

2.1 色譜條件選擇

在190～400 nm波長范圍，分別對毒死蜱、吡蟲啉、殘殺威標準溶液進行全波段掃描，分別在230，269，210 nm處能夠獲得較好吸收值。為了避免因出峰時間太早受到溶劑峰干擾、出峰時間太晚耗時太長，以及受樣品基質等因素的影響，本研究通過優(yōu)化檢測條件，確定的最佳流動相為乙腈(A)和水(B)，且3種農(nóng)藥(毒死蜱、吡蟲啉、殘殺威)檢測流動相A與B的體積比分別為95∶5，55∶45，80∶20；所檢測的標品色譜圖見圖1。

2.2 樣品測定

由表1可知，在提取柑桔樣品農(nóng)藥殘留過程中，標準法與改良QuEChERS法相比，不論是提取時間還是溶劑消耗量，改良QuEChERS法都遠遠少于國標法，因此改良QuEChERS法極具實際應用意義。

由圖2和圖3可知，毒死蜱和殘殺威在2種提取方法下其保留時間(毒死蜱約5.1 min、殘殺威約11.5 min)、峰形與標品一致、峰形對稱且受其它基質影響較小。但吡蟲啉由QuEChERS法處理后其色譜圖中基質對目標峰影響較小，與標品對比保留時間均在3.8 min附近，色譜圖更優(yōu)于國標提取法，且改良QuEChERS法峰形更加對稱、保留時間附近無雜質干擾，能夠更好地實現(xiàn)農(nóng)殘檢出，因此改良QuEChERS法對樣品中基質清除效果優(yōu)于標準法。

圖1 毒死蜱、吡蟲啉、殘殺威標品HPLC圖

2.3 線性方程和檢出限

以空白基質加標的方式確定2種方法對毒死蜱、吡蟲啉、殘殺威3種農(nóng)藥的線性方程和檢出限。根據(jù)選擇的HPLC條件對標準溶液檢測，以峰值為y、標準溶液濃度為x繪制標準曲線，得出毒死蜱、吡蟲啉和殘殺威3種農(nóng)藥的線性方程分別為y=0.690 5x-0.137 1、y=1.802 4x+0.093、y=0.805 5x-0.219 9，相關系數(shù)R2分別達0.999 9，1.000 0，0.999 8。由表2可知，毒死蜱、吡蟲啉和殘殺威3種農(nóng)藥空白加標水平分別為0.8～80.0，0.5～40.0，0.8～80.0 μg/mL時，改良后的QuEChERS法對吡蟲啉和殘殺威的檢出限分別為0.55，0.39 μg/mL均低于國標法的0.78，0.54 μg/mL，雖改良后的QuEChERS法對毒死蜱的檢出限為0.89 μg/mL稍高于國標法的0.80 μg/mL，但相差不大。整體而言，改良后的QuEChERS法優(yōu)于國標法。

圖2 國標法提取柑桔樣品中毒死蜱、吡蟲啉、殘殺威殘留HPLC圖

Figure 2 The national standard method extraction of Citrus samples of chlorpyrifos, imidacloprid and propox-ur residues HPLC

表1 改良QuEChERS法與國標法比較

圖3 改良QuEChERS法提取柑桔樣品中毒死蜱、吡蟲啉、殘殺威殘留HPLC圖

Figure 3 The modified QuEChERS method (right) extra-ction of Citrus samples of chlorpyrifos, imidacloprid and propoxur residues HPLC

表2 HPLC測定范圍及檢出限

2.4 精密度與加標回收率試驗

采用空白柑桔樣品加標，其中1～20 μg/mg毒死蜱、1～20 μg/mg吡蟲啉和5～30 μg/mg殘殺威，采用改良的QuEChERS法，回收率可分別控制在68%～109%，94%～108%，109%～125%，相對標準偏差分別為2.48%～5.03%，7.79%～10.92%，2.32%～6.77%。而國標法回收率僅能分別控制在107%～195%，25%～87%，53%～93%，相對標準偏差分別在5.44%～10.45%，6.89%～9.42%，5.61%～7.73%。由表3～5可知，采用改良的QuEChERS法，3種農(nóng)藥的回收率都遠遠高于國標法，且加標回收率及相對標準偏差能夠滿足NY/T 788—2004《農(nóng)藥殘留試驗準則》要求，僅部分指標與《農(nóng)藥殘留試驗準則》推薦標準稍有偏差，因此改良的QuEChERS法優(yōu)于標準法。

3 結論

對柑桔樣品中1～20 μg/mg毒死蜱、1～20 μg/mg吡蟲啉和5～30 μg/mg殘殺威采用改良的QuEChERS提取，HPLC圖譜目標峰較對稱、檢出限較低分別為0.89，0.55，0.39 μg/mL，回收率分別達到94%～108%，68%～109%，109%～125%，相對標準偏差分別為7.79%～10.92%，2.48%～5.03%，2.32%～6.77%，基本可滿足《農(nóng)藥殘留試驗準則》中所要的范圍；采用GB/T 24691—2009的方法目標峰也較為對稱，檢出限分別為0.8，0.78，0.54 μg/mL，回收率低分別為25%～87%，107%～195%，53%～93%，相對標準偏差高分別為6.89%～9.42%，5.61%～7.73%，5.44%～10.45%；2種方法出峰時間都分別在5.1，3.8，11.5 min左右。表明改良的QuEChERS法在檢測柑桔農(nóng)殘毒死蜱、吡蟲啉和殘殺威時，優(yōu)于GB/T 24691—2009的方法。

表3 HPLC加標回收率及變異系數(shù)

表4 《農(nóng)藥殘留試驗準則》中不同添加濃度要求的回收率

表5 《農(nóng)藥殘留試驗準則》中不同添加濃度回收率試驗要求的相對標準偏差

本試驗采用簡單、快捷、高效的改良-QuEChERS法，將其運用到農(nóng)殘檢測領域，具有替代GB/T 24691—2009中檢測毒死蜱、吡蟲啉和殘殺威3種農(nóng)殘的潛質。同時，本試驗對儀器和試驗條件要求不高，適合大多數(shù)實驗室開展農(nóng)殘分析。但基質效應是農(nóng)殘檢測定量分析中影響準確性的重要因素[18-20]，本試驗中基質效應雖低于國標，但還需從中尋找更優(yōu)的方法,以降低基質效應或建立有效的基質效應補償措施。

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Detected chlorpyrifos, imidacloprid, and propoxur residues in citrus by QuEChERS-high performance liquid chromatography method

SUN Zhi-gao1,2SHENG Ran1HAO Jing-mei1LONG Yong1YU Feng-sheng1FANG Ming1

(1. College of Food Science Southwest University, Chongqing 400715, China;2. Southwest University, Citrus Research Institute, Chongqing 400712, China)

QuEChERS is a simple and efficient extraction method, widely used in the pesticide of residue detection. The purpose of this paper was to compare the extraction methods of pesticides between the improved QuEChERS method and the GB/T 24691—2009 (fruit and vegetable detergent). The extraction of pesticide residue from citrus samples were detected by HPLC. The results showed that when the chlorpyrifos, imidacloprid and propoxur were detected by the improved QuEChERS method, the peak time was about 5.1, 3.8, 11.5 min, respectively. When the spiked blank levels were 0.8～80, 0.5～40, 0.8～80 μg/mL, the detection limits were 0.89, 0.55, and 0.39 μg/mL. While the spiked blank levels respectively were in 1～20, 1～20, 5～30 μg/mL, the recovery rate was 68%～109%, 94%～108%, 109%～125% and the relative standard deviation was 2.48%～5.03%, 7.79%～10.92%, 2.32%～6.77% respectively. When the fruit and vegetable detergent extracted from GB/T 24691—2009, the peak time of chlorpyrifos, imidacloprid and propoxur was basically the same as the modified QuEChERS method. Moreover, when the same spiked blank level was applied to the improved QuEChERS method, the detection limits were 0.80, 0.78, and 0.54 μg/mL, respectively, The recoveries were 107%～195%, 25%～87% and 53%～93%, and the relative standard deviations were 5.61%～7.73%, 6.89%～9.42% and 5.44%～10.45%, respectively. Thus, it indicated that the improved QuEChERS-HPLC was better than GB/T 24691—2009 (fruit and vegetable detergent).

QuEChERS; high performance liquid chromatography; chlorpyrifos;imidacloprid; propoxur

四川省科技計劃項目(編號：2014NZ0062)

孫志高(1964—)，男，西南大學副研究員，碩士生導師。 E-mail: cpro@cric.cn

2017—03—20

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.06.014