趙大群 丁 祥 劉 露 錢 葉 許 婷 茍凡鋮 宋 波 侯萬(wàn)儒 侯怡鈴

(1. 西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 南充 637009；2. 西南野生動(dòng)植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 南充 637009)

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香乳菇多糖對(duì)Hela細(xì)胞凋亡及對(duì)RAW264.7細(xì)胞免疫活性的影響

趙大群 丁 祥 劉 露 錢 葉 許 婷 茍凡鋮 宋 波 侯萬(wàn)儒 侯怡鈴

(1. 西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川 南充 637009；2. 西南野生動(dòng)植物資源保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 南充 637009)

為研究香乳菇多糖(LC-1)的抗腫瘤和免疫調(diào)控活性，將人的宮頸癌Hela細(xì)胞和小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7體外培養(yǎng)，分別通過CCK-8法、流式細(xì)胞術(shù)和ELISA技術(shù)檢測(cè)不同濃度LC-1對(duì)Hela細(xì)胞增殖和凋亡周期的影響，對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖、吞噬的影響,及對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌NO、IL-6和TNF-α的影響。結(jié)果表明：香乳菇多糖對(duì)體外培養(yǎng)的Hela細(xì)胞有明顯的抑制作用，且影響Hela細(xì)胞的形態(tài)及凋亡周期，當(dāng)LC-1濃度為10 μg/mL時(shí)，Sub峰含量可達(dá)19.4%；同時(shí)，LC-1能調(diào)控巨噬細(xì)胞的免疫活性，當(dāng)LC-1濃度為10 μg/mL時(shí)，巨噬細(xì)胞增值率和吞噬活性分別為67.48%和87.09%，亦能促進(jìn)巨噬細(xì)胞從G0/G1期向G2期和S期轉(zhuǎn)化，同時(shí)刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-6和TNF-α，且呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性，但對(duì)NO生成沒有明顯的促進(jìn)作用。綜上，在體外試驗(yàn)中，香乳菇多糖LC-1能抑制宮頸癌Hela細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞增殖和吞噬活性，刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生免疫因子。

香乳菇多糖；Hela細(xì)胞；凋亡；巨噬細(xì)胞RAW264.7；增殖作用；吞噬作用

近年來(lái)，掀起了開發(fā)新型有效、低毒性的抗腫瘤藥物的熱潮。其中，真菌多糖引起越來(lái)越多科學(xué)家的關(guān)注[1-2]。由于多糖分離純化困難及其本身結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，能夠純化得到多糖純品并闡明其結(jié)構(gòu)的并不多，且大部分真菌多糖免疫調(diào)節(jié)活性的研究都集中在多糖粗提物的生物學(xué)活性方面[3-4]，而其混合物或復(fù)合物中具體是哪些成分起作用或者是起主要作用，尚不明確，導(dǎo)致其活性及相關(guān)分子生物學(xué)機(jī)制不清晰。

香乳菇[Lactariuscamphoratum(Bull.) Fr.] 屬傘菌目紅菇科乳菇屬的珍稀型食用真菌。因氣香味美，常將干品研磨成粉作為調(diào)味品?？拱┰囼?yàn)[5-6]顯示，其提取物對(duì)肉瘤S-180 和艾氏腹水癌抑制率可達(dá)70%以上。

在筆者[7]前期的研究中，從香乳菇子實(shí)體中純化得到了水溶性的香乳菇多糖(LC-1)。該多糖是由兩種單糖組成的雜多糖，是一種結(jié)構(gòu)新穎的真菌多糖，具有顯著的抗氧化作用。本試驗(yàn)擬探討香乳菇多糖(LC-1)對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡及對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7免疫活性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

香乳菇：采自四川省小金縣的野生真菌，由四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室西華師范大學(xué)丁祥教授鑒定；

小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7、人類宮頸癌Hela細(xì)胞株：北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)有限公司；

RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清、5%胰酶和雙抗：美國(guó)Gibco公司；

LPS(脂多糖)：美國(guó)Sigma公司；

Griess檢測(cè)試劑盒：南京建成生物工程研究所；

CCK-8試劑盒：日本同仁化學(xué)研究所；

細(xì)胞周期與凋亡試劑盒、細(xì)胞凋亡與壞死檢測(cè)試劑盒：碧云天公司；

TNF-α ELISA試劑盒、IL-6 ELISA試劑盒：武漢博士德公司；

其它化學(xué)藥品和試劑均為分析級(jí)。

1.1.2 主要儀器

細(xì)胞培養(yǎng)箱：311(氣套式)型，美國(guó)Thermo公司；

酶標(biāo)儀：Multiskan GO型，美國(guó)Thermo公司；

流式細(xì)胞：BD Accuri C6型，美國(guó)BD公司；

倒置熒光顯微鏡：DM3000型，德國(guó)萊卡公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 多糖提取 按王芳等[7]提供的方法，將香乳菇子實(shí)體烘干，粉碎，獲得的子實(shí)體粉末于95 ℃水浴5 h，上清液濃縮，95%乙醇與濃縮液以體積比3∶1醇沉，收集沉淀烘干，獲得粗多糖。粗多糖溶液經(jīng)葡聚糖凝膠柱G-200純化后，收集過柱液濃縮烘干，-4 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 LC-1對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 將Hela細(xì)胞加入96孔板中培養(yǎng)24 h，分別用100 μL不同濃度LC-1的細(xì)胞培養(yǎng)液(2，4，6，8，10 μg/mL，試驗(yàn)組)和LPS(2 μg/mL，陽(yáng)性對(duì)照組)刺激細(xì)胞，培養(yǎng)24 h。加CCK-8試劑5 μL，酶標(biāo)儀檢查450 nm波長(zhǎng)時(shí)的吸光度值。倒置熒光顯微鏡400×鏡下拍照保存[6]。按式(1)計(jì)算細(xì)胞抑制率。

(1)

式中：

I——抑制率，%；

A1——測(cè)試樣品孔細(xì)胞的吸光度值；

A0——空白對(duì)照孔細(xì)胞的吸光度值[8]。

1.2.3 LC-1對(duì)Hela細(xì)胞凋亡的影響 用1 mL含不同濃度LC-1(2，4，6，8，10 μg/mL)和RPMI1640完全培養(yǎng)液(空白對(duì)照組)處理細(xì)胞，用細(xì)胞凋亡與壞死檢測(cè)試劑盒中1 mL細(xì)胞染色緩沖液重懸細(xì)胞，加入Hoechst染色液5 μL與PI染色液5 μL，混勻后，冰浴雙染30 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率[9]。

1.2.4 LC-1對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖的影響

(1) LC-1濃度對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖的影響：用100 μL 不同濃度(2，4，6，8，10 μg/mL)的LC-1、LPS(2 μg/mL，陽(yáng)性對(duì)照組)和空白培養(yǎng)液(陰性對(duì)照組)刺激細(xì)胞，培養(yǎng)24 h。加入5 μL CCK-8試劑，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450 nm 波長(zhǎng)下的吸光度值[10]。按式(2)計(jì)算細(xì)胞增殖活性。

(2)

式中：

P——細(xì)胞增殖率，%；

A0——細(xì)胞培養(yǎng)基的平均吸光度值；

A1——陰性對(duì)照組孔的平均吸光度值；

A2——測(cè)試樣品孔細(xì)胞的平均吸光度值[11]。

(2) 刺激時(shí)間對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖的影響：將巨噬細(xì)胞RAW264.7培養(yǎng)在10 μg/mL的LC-1中，分別在0，6，12，24，48，72 h用CCK-8試劑盒檢測(cè)巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖活性。

1.2.5 LC-1對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7周期的影響 用1 mL不同濃度的LC-1的完全培養(yǎng)液(1，5，10 μg/mL)處理細(xì)胞，以不含LC-1的完全培養(yǎng)液作為空白對(duì)照，培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞。按細(xì)胞周期與凋亡試劑盒操作說明進(jìn)行固定與染色。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞的DNA含量，并使用的modifit LT軟件計(jì)算各時(shí)期細(xì)胞DNA含量。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次[12]。

1.2.6 LC-1對(duì)巨噬細(xì)胞RAW 264.7吞噬功能的影響 用不同濃度的LC-1溶液(2，4，6，8，10 μg/mL，試驗(yàn)組)、LPS (2 μg/mL，陽(yáng)性對(duì)照組)和空白培養(yǎng)液(陰性對(duì)照組)刺激細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，取出上清液，加入0.075%中性紅溶液100 μL，繼續(xù)培養(yǎng)1 h，吸出上清液，PBS洗3次，加0.1 mol/L的細(xì)胞裂解緩沖液(乙醇與乙酸體積比為1∶1)100 μL，放置于4 ℃冰箱中，2 h后用酶標(biāo)儀測(cè)定540 nm處的吸光度[13]。

1.2.7 LC-1對(duì)RAW 264.7細(xì)胞IL-6和TNF-α含量的影響 分別用100 μL含有不同濃度LC-1的細(xì)胞培養(yǎng)液(2，4，6，8，10，50，100，200 μg/mL，試驗(yàn)組)、LPS細(xì)胞培養(yǎng)液(2 μg/mL，陽(yáng)性對(duì)照組)和空白培養(yǎng)液(陰性對(duì)照組)刺激細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，用ELISA試劑盒檢測(cè)上清液中的IL-6和TNF-α含量[13]。所有試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.8 LC-1對(duì)RAW 264.7細(xì)胞NO產(chǎn)生量的影響 分別用100 μL含有不同濃度LC-1的細(xì)胞培養(yǎng)液(2，4，6，8，10，50，100，200 μg/mL，試驗(yàn)組)、LPS細(xì)胞培養(yǎng)液(2 μg/mL，陽(yáng)性對(duì)照組)和空白培養(yǎng)液(陰性對(duì)照組)刺激細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后，在上清液中加入Griess試劑50 μL，于540 nm處測(cè)定吸光度值，用亞硝酸鈉溶液繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算NO生成量[14]。

1.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 以SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 LC-1對(duì)HeLa細(xì)胞生長(zhǎng)抑制試驗(yàn)結(jié)果分析

LC-1對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞抑制作用異常迅速，結(jié)果顯示(圖1)，在試驗(yàn)組中，經(jīng)不同濃度LC-1處理后HeLa細(xì)胞活細(xì)胞數(shù)量明顯不同。當(dāng)LC-1濃度為2 μg/mL 時(shí)較空白組抑制作用顯著(P<0.05)；而LC-1濃度達(dá)4～10 μg/mL時(shí)，均呈現(xiàn)極顯著的抑制作用(P<0.01)。當(dāng)LC-1濃度為10 μg/mL時(shí)，在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對(duì)HeLa細(xì)胞的抑制率達(dá)最大，超過陽(yáng)性對(duì)照組。經(jīng)不同濃度LC-1刺激后的宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)見圖2，隨香乳菇多糖LC-1濃度的增加，細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，細(xì)胞開始變圓，細(xì)胞間隙增大，與鄰近細(xì)胞脫離，細(xì)胞核體積增大，出現(xiàn)懸浮細(xì)胞。結(jié)果表明，香乳菇多糖LC-1能夠抑制HeLa細(xì)胞的生長(zhǎng)。

2.2 LC-1對(duì)Hela細(xì)胞周期的影響

不同濃度LC-1對(duì)Hela 細(xì)胞凋亡的影響見圖3。Sub峰表示凋亡細(xì)胞數(shù)量占所測(cè)細(xì)胞總數(shù)的百分比。結(jié)果顯示，在空白對(duì)照組中，Hela 細(xì)胞凋亡率為12.1%，經(jīng)2～10 μg/mL LC-1處理后的Hela 細(xì)胞的凋亡率分別達(dá)14.0%，15.1%，15.9%，18.9%，19.4%，較空白照對(duì)組均有所升高，并且隨著多糖濃度的升高，凋亡率升高越明顯。

*表示與空白對(duì)照組相比具有顯著性差異，P<0.05；**表示與空白對(duì)照組相比具有極顯著性差異，P<0.01

圖1 LC-1對(duì)Hela細(xì)胞體外抑制作用

Figure 1 Inhibitory effect of LC-1 on Hela cells in vitro

1. 未加多糖LC-1的空白組 2～6. 分別為2，4，6，8，10 μg/mL的LC-1的試驗(yàn)組 7. 2 μg/mL的LPS陽(yáng)性對(duì)照組

圖2 LC-1對(duì)Hela細(xì)胞形態(tài)的影響(400×)

Figure 2 Effect of LC-1 on the morphology of Hela cells (400×)

圖3 LC-1對(duì)Hela細(xì)胞周期的影響

多糖制劑作為抗腫瘤藥物，一般不會(huì)直接殺傷腫瘤細(xì)胞，而是通過刺激機(jī)體的特異性免疫功能達(dá)到抗腫瘤效果[15]，但LC-1可以在體外直接抑制Hela細(xì)胞的生長(zhǎng)。當(dāng)LC-1濃度為10 μg/mL 時(shí)，LC-1對(duì)HeLa細(xì)胞的直接抑制率可達(dá)為40.87%，超過陽(yáng)性對(duì)照組，且影響Hela細(xì)胞的凋亡周期與細(xì)胞形態(tài)。

2.3 LC-1對(duì)RAW264.7細(xì)胞體外增殖活性的影響

由圖4可知，隨著LC-1濃度的增加，細(xì)胞增殖活性呈劑量依賴性增加。當(dāng)LC-1濃度為6 μg/mL時(shí)，RAW264.7細(xì)胞增殖率達(dá)25.99%(與空白對(duì)照組相比，P<0.05)；當(dāng)LC-1濃度為8，10 μg/mL時(shí)，增值率分別為47.55%，67.48%(與空白對(duì)照組相比，P<0.01)；當(dāng)LC-1濃度為10 μg/mL時(shí)，RAW264.7細(xì)胞增殖活性接近陽(yáng)性對(duì)照組。

由圖5可知，經(jīng)10 μg/mL LC-1處理了6 h的細(xì)胞與0 h比較，其增殖活性達(dá)15.98%；當(dāng)處理時(shí)間達(dá)12 h，增殖活性達(dá)34.79%(與空白對(duì)照組相比，P<0.05)；當(dāng)多糖刺激達(dá)到24 h，增殖活性為65.48%(與空白對(duì)照組相比，P<0.01)；值得注意的是，當(dāng)刺激時(shí)間達(dá)48，72 h時(shí)，增殖活性雖然依舊在增加，但是增加速率較前12 h有所減慢。

*表示與空白對(duì)照組相比具有顯著性差異，P<0.05；**表示與空白對(duì)照組相比具有極顯著性差異，P<0.01

圖4 不同濃度LC-1對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖作用的影響

Figure 4 Effect of different concentrations of LC-1 on the proliferation of macrophage RAW264.7

*表示與空白對(duì)照組相比具有顯著性差異，P<0.05；**表示與空白對(duì)照組相比具有極顯著性差異，P<0.01

圖5 10 μg/mL LC-1刺激不同時(shí)間對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7增殖作用的影響

Figure 5 Stimulation effect of 10 μg/mL LC-1 on proliferation of RAW264.7 in different time

2.4 LC-1對(duì)RAW264.7細(xì)胞周期分布的影響

LC-1對(duì)RAW264.7細(xì)胞周期進(jìn)程的影響見圖6，LC-1對(duì)RAW264.7細(xì)胞周期各個(gè)階段分布都有一定程度的影響。用LC-1刺激細(xì)胞24 h后，G0/G1期細(xì)胞數(shù)相比對(duì)照組有明顯降低的現(xiàn)象，且呈濃度依賴性關(guān)系。當(dāng)LC-1濃度達(dá)1，5，10 μg/mL時(shí)，其G0/G1期細(xì)胞比例分別減少到58.3%，57.6%，55.1%。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)改變LC-1濃度，G2/M期的細(xì)胞數(shù)也發(fā)生變化。分別由空白組的14.1%，增加到14.7%，15.1%，19.7%。在細(xì)胞周期中，G1期主要合成RNA和核糖體，S期主要是DNA復(fù)制、組蛋白和酶的合成；G2期為有絲分裂的準(zhǔn)備期。G0期細(xì)胞大量存在，則不利于細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂。結(jié)果提示，LC-1 可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞在G1期向G2期和S期轉(zhuǎn)化，減少G0期細(xì)胞產(chǎn)生，導(dǎo)致巨噬細(xì)胞增殖。

圖6 LC-1對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞周期的影響

2.5 LC-1對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響

巨噬細(xì)胞活力增加的重要指標(biāo)之一是吞噬能力增強(qiáng)。用0.075%中性紅檢測(cè)LC-1刺激后巨噬細(xì)胞的吞噬能力，結(jié)果見圖7，與空白對(duì)照組相比，不同濃度的LC-1培養(yǎng)液中孵育24 h后的RAW264.7細(xì)胞，其吞噬能力增強(qiáng)，在試驗(yàn)劑量范圍內(nèi)，活性與劑量呈依賴性關(guān)系。當(dāng)LC-1濃度在8，10 μg/mL時(shí)，RAW264.7細(xì)胞的吞噬能力分別為85.60%，87.09%(與空白對(duì)照組相比，P<0.05)，且LC-1濃度在10 μg/mL時(shí)LC-1刺激RAW264.7細(xì)胞的吞噬能力高于陽(yáng)性對(duì)照。

*表示與空白對(duì)照組相比具有顯著性差異，P<0.05；**表示與空白對(duì)照組相比具有極顯著性差異，P<0.01

圖7 LC-1對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7吞噬功能的影響

Figure 7 Effect of LC-1 on phagocytosis of macrophage RAW264.7

多糖的主鏈結(jié)構(gòu)、支鏈的組成和分子量決定多糖的高級(jí)結(jié)構(gòu)，也是其抗腫瘤活性的重要因素。一般來(lái)說，具有中等分枝程度和分子量的多糖活性較高。分子量太大或太小，都難以達(dá)到理想的活性，各個(gè)多糖都有自己的最適分子量[16]。同時(shí)，多糖發(fā)揮抗生物活性的前提是能溶于水。多糖的水溶性增加，其藥理活性也相應(yīng)提高[17]。LC-1分子量為9 279 Da，在最適相對(duì)分子質(zhì)量范圍內(nèi)，且具有良好的水溶性[7]，可能是導(dǎo)致香乳菇多糖具有誘導(dǎo)宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡及對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7具有免疫調(diào)控活性的關(guān)鍵。

2.6 LC-1對(duì)細(xì)胞因子分泌的影響

細(xì)胞因子在免疫應(yīng)答機(jī)制中起著舉足輕重的作用。由圖8、9可知，加入LC-1刺激后的RAW264.7細(xì)胞中IL-6和TNF-α的含量較陰性對(duì)照組有增高趨勢(shì)，且在試驗(yàn)范圍內(nèi)呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。當(dāng)LC-1的劑量為8 μg/mL 時(shí)，IL-6和TNF-α的含量分別為153.02，483.74 pg/mL，與陰性對(duì)照組相比，均顯著上調(diào)，但LC-1的作用效果仍低于陽(yáng)性對(duì)照組。

*表示與空白對(duì)照組相比具有顯著性差異，P<0.05；**表示與空白對(duì)照組相比具有極顯著性差異，P<0.01

圖8 LC-1對(duì)巨噬細(xì)胞分泌白介素6(IL-6)與腫瘤壞死因子α(TNF-α)的影響

Figure 8 Effect of LC-1 on IL-6 and TNF-α production in macrophage RAW264.7

圖9 低濃度LC-1對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7產(chǎn)生NO的影響

巨噬細(xì)胞在機(jī)體的特異性免疫過程中最重要的是吞噬作用，在吞噬過程中同時(shí)會(huì)釋放出大量的細(xì)胞因子，調(diào)節(jié)其他免疫細(xì)胞進(jìn)行免疫應(yīng)答[18-19]。10 μg/mL LC-1促使巨噬細(xì)胞增值率和吞噬活性分別可達(dá)67.48%，87.09%(與空白對(duì)照組相比，P<0.01)，亦能促進(jìn)巨噬細(xì)胞從G1期向G2、S期轉(zhuǎn)化，減少G0期細(xì)胞產(chǎn)生，同時(shí)刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-6和TNF-α，且呈現(xiàn)出明顯的劑量依賴性。

2.7 LC-1刺激巨噬細(xì)胞生成NO效應(yīng)的影響

用上清液中亞硝酸鹽量作為檢測(cè)巨噬細(xì)胞RAW264.7生成NO量標(biāo)準(zhǔn)，其測(cè)定結(jié)果見圖9、10。與隨性對(duì)照組和空白培養(yǎng)液比較，低濃度LC-1對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7產(chǎn)生NO沒有明顯的促進(jìn)作用。高濃度LC-1對(duì)NO的生成量有一定的促進(jìn)作用，但促進(jìn)效果亦不顯著。

巨噬細(xì)胞在干擾素IFN-γ或者腫瘤壞死因子(TNF)激活下，能產(chǎn)生一氧化氮合酶(iNOS)，誘導(dǎo)NO的產(chǎn)生，調(diào)控巨噬細(xì)胞參與炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)。同時(shí)，IL-6作為一種抗炎細(xì)胞因子，在TNF-α，IL-1的協(xié)同作用下以及IL-10等的激活下發(fā)揮免疫作用[20]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，LC-1可以促進(jìn)IL-6和TNF-α的生成，不促進(jìn)NO的生成，提示可能的分子機(jī)制不涉及一氧化氮合酶(iNOS)的參與。

圖10 高濃度LC-1對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7NO產(chǎn)生的影響

3 結(jié)論

多糖制劑作為抗腫瘤藥物，一般不會(huì)直接殺傷腫瘤細(xì)胞，而是通過刺激機(jī)體的特異性免疫功能達(dá)到抗腫瘤效果。LC-1的主鏈和側(cè)鏈具有中等分枝程度，分子量在最適相對(duì)分子質(zhì)量范圍內(nèi)，且具有良好的水溶性，是導(dǎo)致香乳菇多糖具有誘導(dǎo)宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡及對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7具有免疫調(diào)控活性的關(guān)鍵。在體外試驗(yàn)中，LC-1能抑制宮頸癌Hela細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞增殖和吞噬活性，影響宮頸癌Hela細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的周期，刺激巨噬細(xì)胞產(chǎn)生免疫因子，但涉及的相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與分子機(jī)制還有待驗(yàn)證。

[1] 王斌, 連賓. 食藥用真菌多糖的研究與應(yīng)用[J]. 食品與機(jī)械, 2005, 21(6): 96-100.

[2] 賈林, 陸金健, 周文雅, 等. 桔梗多糖對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠的免疫調(diào)節(jié)[J]. 食品與機(jī)械, 2012, 28(3): 112-114.

[3] 翁梁, 溫魯術(shù). 藥用真菌多糖研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2008, 29(12): 748-751.

[4] 李六文, 趙剛. 藥用真菌多糖抗腫瘤免疫生物活性研究進(jìn)展[J]. 中華腫瘤防治雜志, 2015, 22(14): 1 156-1 160.

[5] 黃年來(lái). 中國(guó)食用菌百科[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 1993: 146-147.

[6] 應(yīng)建浙, 卯曉嵐, 馬啟明. 中國(guó)藥用真菌圖譜[M]. 北京: 科學(xué)出版社, 1987: 283.

[7] WANG Fang, HOU Yi-ling, DING Xiang, et al. Structure elucidation and antioxidant effect of a polysaccharide from Lactarius camphoratum (Bull.) Fr[J]. Int J Biol Macromol, 2013, 62: 131-136.

[8] 張華, 王振宇, 楊鑫, 等. 黑木耳多糖的羧甲基化及其對(duì)肝癌細(xì)胞HePG2的抑制作用[J]. 食品與機(jī)械, 2011, 27(3): 42-44, 67.

[9] 李雪, 李鵬飛, 李曉東, 等. 5種長(zhǎng)白山野生食用菌的抗腫瘤活性研究[J]. 食品與機(jī)械, 2015, 31(1): 151-154.

[10] 楊艷, 劉東波, 康信聰, 等. H2O2誘導(dǎo)胰島RIN-m5F細(xì)胞構(gòu)建氧化應(yīng)激模型[J]. 食品與機(jī)械, 2014, 30(2): 40-43.

[11] 王雯, 王東, 方明明, 等. 糖皮質(zhì)激素對(duì)脂多糖誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子的影響[J]. 國(guó)際呼吸雜志, 2015(12): 911-913

[12] 孫震, 鄭婕, 張莉, 等. 芹菜素對(duì)甲狀腺癌BCPAP細(xì)胞生長(zhǎng)及細(xì)胞周期的影響[J]. 食品與機(jī)械, 2015, 31(3): 3-7.

[13] 徐明生, 林日新, 湯群, 等. 卵轉(zhuǎn)鐵蛋白體外免疫活性研究[J]. 食品與機(jī)械, 2012, 28(2): 115-118, 169.

[14] 李艷紅, 高志玲, 馬金姝. 藜蘆酸抑制LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞中NO表達(dá)的研究[J]. 中國(guó)免疫學(xué)雜志, 2014, 30(3): 326-329.

[15] HORI S, NOMURA T, SAKAGUCHI S. Control of Regulatory T Cell Development by the Transcription Factor Foxp3[J]. Science, 2003, 299(5 609): 1 057-1 061.

[16] SURENJAV U, ZHANG Li-na, XU Xiao-juan, et al. Effects of molecular structure on antitumor activities of (1→3)-β-Dglucans from different Lentinus Edodes[J]. Carbohydrate Polymers, 2006, 63: 97-104.

[17] BOHN J A, BEMILLER J N. (1→3)-β-DGlucans as biological response modifiers: a review of structure-fuctional activity relationships[J]. Carbohydrate Polymers, 1995, 28: 3-14.

[18] KIM S S, OH O J, MIN H Y, et al. Eugenol suppresses cyclooxygenase-2 expression in lipopolysaccharide-stimulated mouse macrophage RAW264.7 cells[J]. Life Sciences, 2003, 73(3): 337-348.

[19] WANG Shi-yao, TAI Gui-xiang, ZHANG Peng-yu, et al. Inhibitory effect of activin A on activation of lipopolysaccharide-stimulated mouse macrophage RAW264.7 cells[J]. Cytokine, 2008, 42(1): 85-91.

[20] ANESTAKIS D, PETANIDIS S, KALYVAS S, et al. Mechanisms and applications of interleukins in cancer immunotherapy[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2015, 16 (1): 1 691-1 710.

Inhibitory effect on Hela cells and immune effects on RAW264.7 cells of a polysaccharide fromLactariuscamphoratum(Bull.) Fr

ZHAO Da-qun DING Xiang LIU Lu QIAN Ye XU TingGOUFan-chengSONGBoHOUWan-ruHOUYi-ling

(1.CollegeofLifeScience,ChinaWestNormalUniversity,Nanchong,Sichuan637009,China; 2.KeyLaboratoryofSouthwestChinaWildlifeResourcesConservation〔MinistryofEducation〕,Nanchong,Sichuan637009,China)

The antitumor and immunoregulatory activities of polysaccharide LC-1 fromLactariuscamphoratum(Bull.) Fr. were studied by using the human cervical cancer Hela cells and the mouse macrophage RAW264.7 cells. The two kinds of cells were cultured in vitro, and the effects of different concentrations of LC-1 on the proliferation and cell cycle of Hela cells and the proliferation and phagocytosis of RAW264.7 cells were investigated. Moreover, the secretion of NO, IL-6 and TNF- alpha of RAW264.7 cells were tested using CCK-8 method, flow cytometry and ELISA technique, respectively. The results showed that polysaccharide LC-1 fromL.camphoratum(Bull.) Fr. has obvious inhibitory effect on Hela cells in vitro, and could influence the apoptosis cell cycle of Hela cells. When the concentration of LC-1 was 10 μg/mL, the content of Sub peaks was 19.4%. It was further found that polysaccharide LC-1 could regulate the immune activity of macrophage. When the concentration of LC-1 was 10 μg/mL, the phagocytic activity and proliferation rate of macrophage were 67.48% and 87.09%, respectively. LC-1 could also promote the transformation of macrophages from G0/G1 phase to G2 phase and S phase and stimulate macrophages to produce IL-6 and TNF-α, showing a dose-dependent. However, no obvious effect on the production of NO was observed. In conclusion, in vitro, polysaccharide LC-1 fromL.camphoratum(Bull.) Fr. could inhibit the growth of cervical carcinoma Hela cells and promote the proliferation and phagocytosis of macrophage, as well as stimulate macrophages to produce immune factors.

Lactariuscamphoratum(Bull.) Fr. polysaccharide; Hela cells; apoptosis; macrophage RAW264.7; proliferation; phagocytosis

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：31400016)；四川省生態(tài)安全與保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：ESP1408)；四川省教育廳重大培育項(xiàng)目(編號(hào)：16CZ0018)；南充市科技局項(xiàng)目(編號(hào)：16YFZJ0043)

趙大群，女，西華師范大學(xué)在讀碩士研究生。

侯怡鈴(1983—)，女，西華師范大學(xué)教授，博士。 E-mail: starthlh@126.com

2017—03—06

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.06.001